煙草青枯病菌巢式PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用

李本金等

摘 要 利用細(xì)菌16S-23S rDNA內(nèi)源轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)通用引物L(fēng)1/L2擴(kuò)增煙草青枯病菌基因組DNA，并對(duì)其擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆測(cè)序，經(jīng)與近緣種序列多重比對(duì)分析后，設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物RsF/RsR，用于包括煙草青枯病菌在內(nèi)的15種不同細(xì)菌、5種真菌、3種卵菌基因組DNA的PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明：在優(yōu)化的反應(yīng)體系與程序條件下，該對(duì)引物只能從煙草青枯病菌中擴(kuò)增出241 bp的特異片段，并通過(guò)序列測(cè)定驗(yàn)證了其準(zhǔn)確性；將引物RsF/RsR與細(xì)菌通用引物L(fēng)1/L2進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增后，其檢測(cè)靈敏度在DNA水平上可達(dá)0.4 fg/μL，較常規(guī)PCR 提高1 000倍，表明該對(duì)引物能有效地用于煙草組織及土壤中青枯病菌的檢測(cè)。此結(jié)果對(duì)煙草青枯病的早期診斷、快速檢測(cè)及病害流行學(xué)研究具有重要意義。

關(guān)鍵詞 煙草；青枯病菌；巢式PCR；分子檢測(cè)

中圖分類號(hào) S435.72 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract Based on differences in the sequences of 16S-23S ribosomal DNA of Ralstonia solanacearum in tobacco and the other closely related species， a pair of primers RsF/RsR were designed and a PCR assay was developed in the study. Among 47 isolates representing 15 bacteria species including R. solanacearum in tobacco and 8 other fungi and oomycetes species， only a single PCR band of 241 bp amplified with DNA extracted from all isolates of R. solanacearum in tobacco， while other tested isolates had no corresponding band. The detection sensitivity increased 1 000-fold to 0.4 fg/μL genomic DNA by developed a nested PCR procedure with bacterial universal primer pair L1/L2 as the first round primers and RsF/RsR as the second round primers. The results showed that nested-PCR assays provided a rapid and sensitive method for the detection of R. solanacearum from naturally infected tobacco tissues and diseased soil samples. It has great significance for early diagnosis and rapid detection of tobacco bacterial wilt， and the research of disease epidemiology.

Key words Tobacco；Ralstonia solanacearum；Nested-PCR；Molecular detection

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.11.022

由青枯勞爾氏菌（Ralstonia solanacearum E. F. Smith）引起的煙草青枯病是威脅世界煙草生產(chǎn)的一種毀滅性病害，廣泛分布于熱帶、亞熱帶地區(qū)。該病在中國(guó)南方煙區(qū)普遍發(fā)生，近年來(lái)有逐漸加重的趨勢(shì)[1-3]。目前對(duì)煙草青枯病菌的檢測(cè)大多仍采用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)和血清學(xué)鑒定方法，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法耗時(shí)長(zhǎng)且靈敏度較低，難以滿足病害控制中快速、靈敏、穩(wěn)定的檢測(cè)要求，很容易錯(cuò)過(guò)病害防治的最佳時(shí)期，免疫血清學(xué)鑒定方法雖已建立，但血清的制備過(guò)程耗時(shí)耗力，且可能存在交叉反應(yīng)，容易造成假陽(yáng)性[4]，這些方法的應(yīng)用均受到一定的限制。因此，建立一種快速、靈敏、準(zhǔn)確的煙草青枯病菌檢測(cè)技術(shù)對(duì)該病及時(shí)、有效地防治具有十分重要的意義。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）技術(shù)因其具有快速、特異、靈敏的特點(diǎn)已被廣泛應(yīng)用于病原微生物的檢測(cè)。國(guó)內(nèi)外應(yīng)用PCR技術(shù)對(duì)青枯病菌的檢測(cè)研究已有報(bào)道，主要是針對(duì)青枯菌核糖體基因[1、5]、功能基因[1-3]及未知片段[6-7]設(shè)計(jì)引物進(jìn)行檢測(cè)，其中核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS序列是由交替的保守區(qū)和可變區(qū)組成，在微生物基因組中以多拷貝出現(xiàn)，具有種的特異性，因此該序列成為在種的水平鑒定細(xì)菌極好的目標(biāo)。目前，具有更高靈敏度的巢式PCR技術(shù)已在一些植物病原菌檢測(cè)中得以應(yīng)用[8-10]，但有關(guān)煙草青枯病菌的檢測(cè)鮮有報(bào)道[11-12]，且靈敏度不太理想。為此，本研究根據(jù)16S-23S rDNA的ITS區(qū)段序列在細(xì)菌種間高度變異和種內(nèi)穩(wěn)定性特點(diǎn)，設(shè)計(jì)煙草青枯病菌特異性引物，并結(jié)合細(xì)菌通用引物建立巢式PCR檢測(cè)體系，對(duì)煙草青枯病菌及帶菌植株或土壤進(jìn)行?；詸z測(cè)，以期為該病的早期診斷和及時(shí)采取有效的防控措施提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)供試菌株、寄主及來(lái)源詳見(jiàn)表1，所有菌株均保存于本實(shí)驗(yàn)室。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 卵菌和真菌基因組DNA的提取參照改良的CTAB法[13]；細(xì)菌DNA的提取采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；植物組織DNA的提取參照NaOH快速裂解法[14]；土壤DNA的提取采用土壤基因組DNA快速提取試劑盒（購(gòu)自北京百泰克生物科技有限公司）。

1.2.2 16S-23S rDNA ITS序列擴(kuò)增、克隆和測(cè)序 細(xì)菌16S-23S rDNA ITS序列擴(kuò)增的通用引物為L(zhǎng)1：5′-AGTCGTAACAACGTAGCCGT-3′和L2：5′-GTGCCAAGGCATCCACC-3′。采用25 μL反應(yīng)體系：2.5 μL 10×PCR buffer（Mg2+ free），2.0 mmol/L MgCl2，0.2 mmol/L dNTPs，1.0 U Taq DNA聚合酶，10 μmol/L 的上、下引物各0.5 μL，25 ng DNA模板，不足部分由ddH2O補(bǔ)足。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增結(jié)束后取10.0 μL PCR產(chǎn)物于含0.5 μg/mL EB的1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)上檢測(cè)并拍照。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在T-vector上克隆后，由生工生物工程（上海）有限公司測(cè)序。

采用DNAMAN軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果及GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已登錄的青枯菌近緣種基因組序列進(jìn)行同源性比較，選取差異位點(diǎn)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。

1.2.3 特異性檢測(cè) 采用合成特異引物對(duì)供試菌株基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并檢測(cè)其特異性，以滅菌的ddH2O為陰性對(duì)照。PCR反應(yīng)體系同1.2.2。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增結(jié)束后取5 μL PCR產(chǎn)物于含0.5 μg/mL EB的1.5%瓊脂糖凝膠中電泳30 min（100 V），在凝膠成像系統(tǒng)上檢測(cè)并拍照。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆測(cè)序，通過(guò)序列比對(duì)驗(yàn)證其準(zhǔn)確性。

1.2.4 靈敏度檢測(cè) 采用10倍濃度系列稀釋法將提取的煙草青枯病菌基因組DNA依次稀釋成1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL、1 fg/μL共7個(gè)不同濃度梯度，采用巢式PCR對(duì)引物的靈敏度進(jìn)行測(cè)定。分別取1 μL不同濃度的煙草青枯病菌基因組DNA為模板，以細(xì)菌16S rDNA通用引物L(fēng)1/L2進(jìn)行第1輪PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系和反應(yīng)程序同1.2.2。反應(yīng)結(jié)束后將PCR產(chǎn)物稀釋100倍，分別取1 μL做為DNA模板，用引物RsF/RsR進(jìn)行第2輪PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系和反應(yīng)程序同1.2.3。取5 μL第2輪PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.5 田間發(fā)病煙草植株或土壤的檢測(cè) 以從福建龍巖、三明、南平采集的32份青枯病典型癥狀或可疑癥狀的煙草植株及8份連作2～3 a發(fā)病煙田土樣基因組DNA為模板，將模板進(jìn)行10、50、100、500、1 000倍稀釋，煙草植株采用常規(guī)PCR檢測(cè)，土壤樣品采用巢式PCR檢測(cè)。以煙草青枯病菌基因組DNA為陽(yáng)性對(duì)照，以健康煙草組織作為陰性對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異引物的設(shè)計(jì)

用細(xì)菌通用引物L(fēng)1/L2對(duì)煙草青枯病菌基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物克隆測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)獲得煙草青枯病菌的特異引物，序列如下：RsF：5′-GGCGGCGAGAGCGATCT-3′，RsR：5′-ATTGCGCGCCTCATCAACGCG-3′。其包含引物序列在內(nèi)的片段大小為241 bp。

2.2 引物特異性檢測(cè)

利用設(shè)計(jì)的特異性引物RsF/RsR對(duì)供試菌株（表1）的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，進(jìn)一步測(cè)序驗(yàn)證的結(jié)果表明，只有在煙草青枯病菌中擴(kuò)增到241 bp的目的條帶，測(cè)序比對(duì)后與煙草青枯病菌ITS片段序列完全一致，其它供試菌株和空白對(duì)照均未擴(kuò)增到預(yù)期產(chǎn)物（圖1），表明該引物具有很高的特異性。

2.3 引物的靈敏性檢測(cè)

以L1/L2為外引物，RsF/RsR為內(nèi)引物對(duì)不同濃度的煙草青枯病菌基因組DNA進(jìn)行巢式PCR靈敏性驗(yàn)證。結(jié)果第1次以L1/L2為引物擴(kuò)增時(shí)，在25 μL反應(yīng)體系中，以1 ng至10 pg的基因組DNA為模板時(shí)均能得到預(yù)期帶，表明其檢測(cè)的靈敏度為0.4 pg/μL；而第2次以RsF/RsR為引物擴(kuò)增時(shí)，在以10 fg基因組DNA為模板時(shí)仍然可擴(kuò)增到241 bp的特異條帶?？梢?jiàn)，巢式PCR反應(yīng)可使檢測(cè)靈敏度提高1 000倍，靈敏度達(dá)到0.4 fg/μL（圖2）。

2.4 煙草發(fā)病植株和土壤的檢測(cè)

采用常規(guī)、巢式PCR分別對(duì)采集的煙草植株、土壤樣本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，28份煙草植株及6份土樣為青枯病菌陽(yáng)性，即能穩(wěn)定地?cái)U(kuò)增出一條分子量為241 bp的特異條帶；6份樣本未獲得檢測(cè)，結(jié)果為陰性，部分電泳結(jié)果見(jiàn)圖3。對(duì)供試的煙草植株及土壤樣品采用常規(guī)分離培養(yǎng)及顯微鏡形態(tài)觀察的方法進(jìn)行驗(yàn)證，取得了一致的結(jié)果，說(shuō)明該套技術(shù)能用于發(fā)病煙草組織或土壤中青枯病菌的快速檢測(cè)及病害的早期診斷。

3 討論與結(jié)論

核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)是20世紀(jì)90年代發(fā)展起來(lái)的全新的分子標(biāo)記。利用核糖體rDNA序列在物種進(jìn)化過(guò)程中的保守性和異變性設(shè)計(jì)引物，并建立病原菌和快速檢測(cè)的方法已得到廣泛應(yīng)用[15]。本研究根據(jù)測(cè)序得到的煙草青枯病菌序列與GenBank中已登錄的青枯菌近緣種rDNA-ITS區(qū)序列進(jìn)行比對(duì)，設(shè)計(jì)出對(duì)煙草青枯病菌基因組DNA有高度特異性的1對(duì)引物，對(duì)15種不同細(xì)菌、5種真菌、3種卵菌基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果只有對(duì)不同來(lái)源的煙草青枯病菌能擴(kuò)增出241 bp的特異性條帶，其余菌株DNA模板及空白對(duì)照均無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物。利用此特異引物對(duì)發(fā)病的煙草植株或煙田土壤進(jìn)行PCR或巢式PCR檢測(cè)，結(jié)果只能從煙草發(fā)病組織或帶菌土壤中擴(kuò)增出目的條帶，而健康煙株或不帶菌土壤沒(méi)有目的條帶產(chǎn)生。表明此特異引物可用于煙草組織或煙田土壤青枯病菌的分子檢測(cè)及病害的早期診斷，為該病防控措施的制定提供重要保障。

目前已有利用PCR或巢式PCR技術(shù)對(duì)煙草青枯病菌進(jìn)行檢測(cè)的報(bào)道[1-3、11、12、16]，但靈敏度較低。郭淼淼等[1]以青枯菌16S rDNA ITS及fliC基因?yàn)榘悬c(diǎn)設(shè)計(jì)引物對(duì)煙草青枯病菌進(jìn)行檢測(cè)，其檢測(cè)靈敏度在DNA水平上均可達(dá)到l0 fg/μL；吳金鐘等[2]根據(jù)青枯菌egl基因設(shè)計(jì)煙草青枯病菌PCR引物，檢測(cè)靈敏度為100 fg/μL基因組DNA；楊姣弟等[3]根據(jù)青枯菌rpsS等基因序列差異設(shè)計(jì)特異性引物，對(duì)煙草青枯菌懸液最低檢出率為105 cfu/mL（據(jù)郭淼淼等報(bào)道，105 cfu/mL菌懸液相當(dāng)于10 pg/μL基因組DNA）；賈春燕等[16]建立煙草青枯病菌的PCR檢測(cè)體系，對(duì)青枯菌基因組DNA檢測(cè)靈敏度為100 fg/μL。Poussier等[11]從hrp基因區(qū)域設(shè)計(jì)引物對(duì)青枯菌進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，其檢測(cè)靈敏度為103 cfu/mL；Khakvar[12]等利用前人設(shè)計(jì)的引物通過(guò)巢式PCR檢測(cè)煙草組織或土壤中的青枯菌，檢測(cè)靈敏度為104～106 cfu/mL。據(jù)報(bào)道，巢式PCR與常規(guī)PCR相比，一般可將引物的靈敏度提高100～1 000倍[8-12]。為此，本研究在細(xì)菌ITS區(qū)通用引物L(fēng)1/L2的內(nèi)部設(shè)計(jì)了1對(duì)特異引物RsF/RsR，并建立煙草青枯病菌巢式PCR檢測(cè)體系，利用該體系對(duì)引物的靈敏性進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在25 μL反應(yīng)體系中，以10 fg基因組DNA為模板時(shí)仍然可擴(kuò)增到目的條帶，可見(jiàn)其檢測(cè)靈敏度在DNA水平上可達(dá)到0.4 fg/μL，比之前文獻(xiàn)中報(bào)道的更靈敏。

據(jù)報(bào)道，羅香文[17]設(shè)計(jì)的引物AU759/AU760不但可用于鑒定從辣椒上分離到的青枯病菌，也可鑒定從番茄、茄子、桉樹、甘薯、煙草、木麻黃等其他作物上分離到的青枯病菌；郭淼淼等[1]設(shè)計(jì)的引物對(duì)RaITS-1/2、Ralflic-F/R對(duì)煙草青枯菌、辣椒青枯菌、番茄青枯菌、苦瓜青枯菌、羅漢果青枯菌均是特異的、靈敏的。本研究設(shè)計(jì)的煙草青枯病菌特異引物，就擴(kuò)增片段同源性比較結(jié)果來(lái)看，其他作物青枯病菌用該引物進(jìn)行PCR，也有可能擴(kuò)增出同樣大小的目的條帶，但若試圖用于其他寄主青枯病菌的檢測(cè)，還應(yīng)進(jìn)一步測(cè)試更多該寄主相關(guān)的病原菌。

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