尖孢鐮刀菌古巴?；蚮gb1基因敲除突變體的構(gòu)建與表型分析

摘 要 為了研究尖孢鐮刀菌古巴?；虶蛋白β亞基編碼基因fgb1的功能，構(gòu)建fgb1基因敲除突變體，分析fgb1敲除突變體的表型。結(jié)果表明：敲除fgb1基因?qū)е峦蛔凅w菌落在PDA培養(yǎng)基上生長減慢，產(chǎn)孢量和菌絲分枝減少；致病性測(cè)定結(jié)果表明fgb1基因敲除突變體對(duì)巴西蕉的致病性減弱；用激光共聚焦顯微鏡觀察感病香蕉根系，發(fā)現(xiàn)fgb1基因敲除突變體仍可在根系維管束中定殖。本研究結(jié)果為進(jìn)一步研究G蛋白信號(hào)傳導(dǎo)途徑在尖孢鐮刀菌古巴?；椭械淖饔玫於嘶A(chǔ) 。

關(guān)鍵詞 尖孢鐮刀菌古巴專化型；G蛋白；致病性；生長；發(fā)育

中圖分類號(hào) Q789 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract To investigate the function of the G-protein gene fgb1 in the banana fungal pathogen Fusarium oxysporum f. sp. cubense（Foc），the fgb1 deletion mutants were constructed. Phenotypical analysis revealed that deletion of fgb1 gene led to several alterations including slower growth rate on potato dextrose agar（PDA）plates，reduced conidiation and less branches of mycelia compared to the wild-type strain. The fgb1 deletion mutants showed decreased pathogenicity to the banana（Musa spp. cv. Brazil），but the mutant could still invade the vascular bundles of banana roots. The results lay a foundation for studying the roles of G-protein in Foc.

Key words Fusarium oxysporum f. sp. cubense；G-protein；Pathogenicity；Growth；Development

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.11.018

尖孢鐮刀菌古巴?；停‵usarium oxysporum f. sp. cubense）可從香蕉根系侵入并造成維管束萎蔫和植株枯萎，是制約香蕉生產(chǎn)的重要病原菌之一。同時(shí)，尖孢鐮刀菌古巴?；涂稍谕寥乐写婊疃嗄?，化學(xué)藥劑難以有效防治，選用抗病香蕉品種是防治香蕉枯萎病的有效措施[1]?？共∠憬镀贩N的選育依賴于對(duì)香蕉與枯萎病菌的相互作用機(jī)制以及病原菌致病機(jī)理的深入理解。

目前有關(guān)尖孢鐮刀菌致病機(jī)理的研究已取得相當(dāng)進(jìn)展。許多重要致病基因已被鑒定，包括fmk1、ste12、chs2、chs7、chsV、rho1、fow1、fow2、six1和 frp1等基因[2-3]，這為進(jìn)一步揭示尖孢鐮刀菌致病信號(hào)網(wǎng)絡(luò)奠定了基礎(chǔ)。近年來，尖孢鐮刀菌古巴?；椭虏』虻难芯恳踩〉昧艘恍┲匾M(jìn)展。相關(guān)學(xué)者通過構(gòu)建尖孢鐮刀菌T-DNA插入突變體庫，鑒定了一些致病力減弱或喪失的突變體，并進(jìn)一步鑒定了T-DNA所插入的基因序列[4-7]。Qi等[8]通過基因敲除策略鑒定了轉(zhuǎn)錄因子編碼基因foatf1等重要致病基因。

G蛋白在真菌生長、發(fā)育和致病力等方面具有重要的調(diào)控作用[9]。部分學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)尖孢鐮刀菌G蛋白具有相似的功能。Jain等[10-11]首先通過基因破壞策略研究了尖孢鐮刀菌黃瓜專化型（F. oxysporum f. sp. cucumerinum）G蛋白α和β亞基編碼基因fga1、fga2、fgb1的功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)fga1和fgb1基因失活突變體對(duì)黃瓜的致病力減弱，其菌落形態(tài)、產(chǎn)孢量、孢子萌發(fā)率和耐熱性等發(fā)生顯著變化。fga2基因失活突變體對(duì)黃瓜的致病性完全喪失，但是菌落形態(tài)和產(chǎn)孢量并沒有發(fā)生明顯改變[12]。Delgado-Jarana等[13]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，G蛋白β亞基FGB1可通過依賴環(huán)化腺苷酸（cAMP）的途徑或不依賴cAMP的信號(hào)途徑調(diào)控菌絲的生長、發(fā)育和致病性。盡管關(guān)于這些G蛋白編碼基因的功能在尖孢鐮刀菌黃瓜專化型中已有所闡明，但與其在尖孢鐮刀菌古巴?；椭械墓δ苁欠褚恢氯杂写?yàn)證。

因此筆者通過DNA重組策略敲除古巴專化型菌株fgb1基因，以驗(yàn)證G蛋白β亞基編碼基因在尖孢鐮刀菌古巴?；途曛械墓δ堋?/p>

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂20 g/L）；PDB成分與PDA相同，但不加瓊脂；再生培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g/L、蔗糖174 g/L、瓊脂20 g/L）。

1.1.2 試劑 轉(zhuǎn)化使用的溶液為STC溶液[1.2 mol/L山梨醇、 0.5%氯化鈣、 100 mmol/L Tris-HCL（pH7.0）、 25 mmol/L EDTA]； PTC溶液[STC溶液、 10%（W/V）PEG4000]； 0.7 mol/L氯化鈉溶液；Driselase崩潰酶溶液（20 mg/mL， Sigma）；溶壁酶Lysing Enzyme（廣州微生物研究所）。

1.1.3 供試菌株和質(zhì)粒 尖孢鐮刀菌古巴?；停‵usarium oxysporum f. sp. cubense）4號(hào)小種菌株B2分離自感病的巴西蕉；pCT74質(zhì)粒由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所微生物資源研究利用課題組保存。

1.1.4 供試香蕉品種 巴西蕉（Musa sp. AAA）試管苗由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院組織培養(yǎng)中心提供。試管苗經(jīng)清水洗凈后種于砂土中，栽培1個(gè)月左右。

1.2 方法

1.2.1 真菌基因組DNA提取 將B2菌株接種于PDB培養(yǎng)基，以150 r/min、28 ℃搖床震蕩培養(yǎng)5 d，過濾收集菌絲體，瀝干后用于基因組DNA提取。 DNA提取采用CTAB法[14-15]。

1.2.2 fgb1基因敲除載體的構(gòu)建 以基因組DNA為模板，用引物對(duì)AF（5′-ggggtaccGACGGTTACGAT

TGAGTGA-3′，小寫字母線堿基為KpnⅠ識(shí)別序列）和AR（5′-ccgctcgagTGAAGTTGGTGGATGGATG-3′，

小寫字母堿基為XhoⅠ識(shí)別序列）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得fgb1基因開放閱讀框上游5′端同源臂DNA；用引物對(duì)BF（5′-cggaattcCGGCGACTATACCATCTG

-3′，小寫字母堿基為EcoRⅠ識(shí)別序列）和BR（5′-tgctctagaGACATCAAGAGCGATACCA-3′，小寫字母堿基為XbaⅠ識(shí)別序列）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得下游3′端同源臂DNA。PCR擴(kuò)增采用Premix TaqTM試劑（TaKaRa，Dalian），擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，然后進(jìn)行35個(gè)擴(kuò)增循環(huán)（95 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min），最后72 ℃保溫5 min。將所擴(kuò)增的DNA片段分別連接于pMD19T載體，形成pMD19T-5A和pMD19T-3B克隆載體。再用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和XhoⅠ、EcoRⅠ和 XbaⅠ從克隆載體上切下5′端和3′端同源臂DNA，將其分別連接于經(jīng)相同限制性內(nèi)切酶酶切的線性pCT74載體（包含潮霉素抗性基因hph和gfp基因表達(dá)盒）中，構(gòu)建成pCT74-fgb1載體。最后用KpnⅠ和XbaⅠ從pCT74-fgb1載體中切下用于轉(zhuǎn)化的DNA片斷，經(jīng)回收純化后備用。

1.2.3 尖孢鐮刀菌原生質(zhì)體制備和DNA轉(zhuǎn)化 參照謝德嘯等[16]報(bào)道的方法。

1.2.4 fgb1基因敲除突變體的鑒定 采用CTAB法提取轉(zhuǎn)化子基因組DNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)合格后，將其作為PCR擴(kuò)增的模板。分別以轉(zhuǎn)化子和野生型菌株B2基因組DNA為模板，采用引物F1（5′-AGGTCGGATTGGATGGAGTG-3′）和F2（5′-CGTTGCAAGACCTGCCTGAA-3′）進(jìn)PCR擴(kuò)增，檢測(cè)轉(zhuǎn)化子是否在fgb1基因開放閱讀框5′端發(fā)生同源重組；用引物C1（5′-ATGAACTCGCAAGG

CAACAG-3′）和C2（5′-TCATTTTCCTCTCGGTGTAC

CG-3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)轉(zhuǎn)化子是否存在fgb1基因開放閱讀框，預(yù)計(jì)分別擴(kuò)增約1 663 bp和1 380 bp的 DNA片段。如果用F1和F2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增結(jié)果為陽性，而用C1和C2 引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增結(jié)果為陰性，那么這類轉(zhuǎn)化子即為fgb1基因敲除突變體。PCR擴(kuò)增采用Premix TaqTM試劑（TaKaRa，Dalian），擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，然后進(jìn)行35個(gè)擴(kuò)增循環(huán)（95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min），最后72 ℃保溫5 min。

1.2.5 突變體菌落形態(tài)觀察 用體式顯微鏡（SZX7，Olympus）放大10倍觀察單菌落形態(tài)并拍照。

1.2.6 孢子懸浮液配制 將fgb1基因敲除突變體和野生型菌株B2分別接種于200 mL的PDB培養(yǎng)基中，置于25 ℃、180 r/min的搖床中震蕩培養(yǎng)7 d。離心收集菌體，用蒸餾水重懸，將分生孢子懸浮液濃度調(diào)至106個(gè)/mL。

1.2.7 致病性測(cè)定及病情統(tǒng)計(jì) 將香蕉苗用清水洗凈根部沙土后，各取約30株幼苗，將其根系分別浸于fgb1敲除突變體和野生型菌株B2孢子懸浮液中，放置5 min后取出，重新種于土中，以無菌水浸泡5 min作為對(duì)照。經(jīng)處理后按照常規(guī)方法栽培管理，并觀察植株的發(fā)病情況。3周后調(diào)查病害發(fā)生情況，從球莖中間縱向切開，觀察球莖褐變程度以及葉片黃化情況，記錄每株幼苗發(fā)病級(jí)數(shù)，病害分級(jí)參考郭立佳等[14]的方法。

1.2.8 激光共聚焦顯微觀察 取感病的香蕉根系進(jìn)行徒手切片，臨時(shí)制片，置于激光共聚焦顯微鏡（FV1000，Olympus）下，用波長為488 nm的光線激發(fā)，具體參照Hamm等[17]所述方法進(jìn)行。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

接種fgb1基因突變體和野生型菌株B2的香蕉幼苗發(fā)病情況用病情指數(shù)表示，病情指數(shù)計(jì)算采用此公式：病情指數(shù)=100×[∑（植株發(fā)病級(jí)數(shù)×對(duì)應(yīng)株數(shù)）/（植株發(fā)病最高級(jí)數(shù)×總株數(shù)）]。數(shù)據(jù)采用SigmaPlot 12.5軟件統(tǒng)計(jì)分析模塊進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 fgb1基因敲除載體構(gòu)建

用4種限制性內(nèi)切酶對(duì)所構(gòu)建的質(zhì)粒pCT74-fgb1進(jìn)行酶切分析。結(jié)果表明（圖1），用KpnⅠ和 XhoⅠ酶切可從載體上切下預(yù)計(jì)約600 bp的DNA條帶；用 EcoRⅠ和XbaⅠ酶切，也可切下約800 bp的DNA條帶。測(cè)序結(jié)果表明所克隆的DNA序列正確，說明fgb1基因敲除載體已構(gòu)建成功。

2.2 PCR鑒定fgb1敲除突變體

經(jīng)再生培養(yǎng)和潮霉素抗性篩選，獲得一批轉(zhuǎn)化子，挑選其中的6個(gè)轉(zhuǎn)化子，提取基因組DNA，以其為模板，用C1/C2引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化子D1～D3和清水對(duì)照無擴(kuò)增條帶，D4～D6和野生型菌株B2均有1.4 kb左右的DNA擴(kuò)增條帶；用F1/F2引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，以轉(zhuǎn)化子D1～D4基因組DNA為模板，可擴(kuò)增到約1.6 kb的DNA條帶，其余模板及清水對(duì)照均無PCR擴(kuò)增條帶（圖2）。結(jié)果表明D1～D3轉(zhuǎn)化子均為fgb1基因敲除突變體，分別命名為Δfgb1-1、Δfgb1-2、Δfgb1-3。

2.3 fgb1基因敲除突變體表型分析

fgb1基因敲除突變體菌株Δfgb1-1和Δfgb1-2與野生型菌株B2在PDA平板上形成的菌落形態(tài)相似（圖3-A）；在PDA平板上劃線培養(yǎng)36 h，野生型菌株B2的菌絲呈輻射狀向四周生長，與之不同，突變體菌株Δfgb1-1的菌絲呈直線沿兩端生長，菌絲分枝明顯減少（圖3-B）。將野生型菌株B2與fgb1敲除突變體菌株Δfgb1-1和Δfgb1-2分別接種于PDA平板上并培養(yǎng)4 d，測(cè)量其菌落直徑，結(jié)果表明野生型菌落平均直徑（4.88 cm）極顯著（t測(cè)驗(yàn)，p<0.01）大于突變體菌株Δfgb1-1（4.30 cm）和Δfgb1-2（4.32 cm）菌落平均直徑（圖3-C）。在PDA平板上培養(yǎng)7 d，Δfgb1-1和Δfgb1-2突變體菌株單菌落產(chǎn)孢量（1.1×109和1.3×109，圖3-D）低于野生型菌株B2（2.3×109）?？梢?，fgb1基因的敲除導(dǎo)致突變體菌株菌絲分枝減少，菌落生長減慢，產(chǎn)孢量減少。

2.4 fgb1敲除突變體對(duì)巴西蕉的致病性

統(tǒng)計(jì)接種野生型菌株B2與fgb1敲除突變體菌株Δfgb1-1和Δfgb1-2的巴西蕉病情指數(shù)。發(fā)現(xiàn)接種fgb1敲除突變體菌株Δfgb1-1和Δfgb1-2的巴西蕉幼苗平均病情指數(shù)（15.3和17.8，圖4）均顯著（t測(cè)驗(yàn)，p<0.01）低于野生型菌株B2（63.7，圖4）。結(jié)果表明fgb1敲除突變體對(duì)巴西蕉的致病性顯著降低。

2.5 fgb1敲除突變體在巴西蕉根系中的侵染情況 用共聚焦激光顯微鏡觀察fgb1基因敲除突變體菌株在根系中的定殖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其既可在根系皮層定殖（圖5-A），也可侵入根系維管束，在木質(zhì)部定殖（圖5-B）。結(jié)果表明fgb1基因敲除突變體雖然致病力減弱，但其仍可侵染巴西蕉根系，并在維管束定殖。

3 討論與結(jié)論

在真核生物中，G蛋白在細(xì)胞的生長發(fā)育等生物學(xué)過程中具有重要作用。由G蛋白α、β和γ亞基組成的異源三聚體在結(jié)合GDP時(shí)無活性，由受體催化的鳥嘌呤核苷酸交換使GTP結(jié)合到α亞基上，導(dǎo)致α亞基的活化，并與β和γ亞基解離，隨后游離的Gα亞基和Gβγ異二聚體激活下游的效應(yīng)物。當(dāng)GTP水解為GDP時(shí)，α亞基失活，細(xì)胞響應(yīng)完成[17]。不同真菌的G蛋白氨基酸序列之間具有較高的相似性，其中β亞基氨基酸序列中包含2個(gè)保守基序即IYAMHW和GHDNRV[10]，因此其在功能上也具有相當(dāng)?shù)谋Ｊ匦?。尖孢鐮刀菌不同?；途甑腉蛋白β亞基的氨基酸序列之間也具有很高的相似性，Jain等[10]和Delgado-Jarana等[13]研究發(fā)現(xiàn)尖孢鐮刀菌黃瓜?；秃头褜；偷腉蛋白β亞基具有一致的功能，即調(diào)控菌絲生長、發(fā)育和致病性，筆者發(fā)現(xiàn)G蛋白β亞基在尖孢鐮刀菌古巴專化型中也具有基本相同的功能，包括調(diào)控菌絲生長、菌絲分枝和產(chǎn)孢量以及致病性。它們的差別如下：在尖孢鐮刀菌古巴?；椭?，敲除fgb1導(dǎo)致菌絲生長減緩（圖3），而在尖孢鐮刀菌黃瓜?；秃头褜；椭?，敲除fgb1則促進(jìn)菌絲生長[10，13]。

盡管關(guān)于fgb1基因在尖孢鐮刀菌黃瓜?；秃头褜；途曛械墓δ芤延兴U明，但fgb1敲除突變體是否能侵入根系維管束仍是未知。筆者采用gfp和潮霉素抗性hph基因，通過DNA同源重組替換fgb1基因（圖2），所得的fgb1基因敲除突變體攜帶gfp基因，因此可用熒光顯微鏡觀察突變體在香蕉植株中的侵染和定殖情況。通過用激光共聚焦顯微鏡觀察fgb1突變體在巴西蕉根系中的定殖，筆者發(fā)現(xiàn)其可穿透根系皮層和進(jìn)入維管束木質(zhì)部，并在其中定殖（圖5）。這與以GFP標(biāo)記的野生型菌株在巴西蕉根系中的侵染定殖方式相似[18]。與此不同，Inoue等[19]研究發(fā)現(xiàn)，破壞Fow1基因?qū)е峦蛔凅w菌株對(duì)西甜瓜的致病性顯著降低，突變體菌株只能穿透西甜瓜根系表皮，而不能侵入維管束。Kim等[20]發(fā)現(xiàn)，破壞尖孢鐮刀菌蛋白激酶A編碼基因FoCPKA導(dǎo)致突變體菌株不能侵入擬南芥根系維管束。因此，可推測(cè)G蛋白β亞基FGB1調(diào)控尖孢鐮刀菌的致病性可能是通過采用不同于Fow1和FoCPKA的信號(hào)途徑。此外，與野生型菌株相比，fgb1基因突變體致病力雖然顯著減弱，但是其仍然能侵入香蕉根系木質(zhì)部維管束，筆者推測(cè)這可能是由于fgb1基因敲除突變體在侵染香蕉根系的過程中受到宿主的防御，其侵染性生長受一定程度的限制，但仍然能以較慢的速度侵入木質(zhì)部維管束，其具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

筆者通過構(gòu)建fgb1基因敲除突變體，分析突變體表型，發(fā)現(xiàn)FGB1可調(diào)控尖孢鐮刀菌古巴?；途z的生長、發(fā)育和致病性，其調(diào)控尖孢鐮刀菌古巴?；偷闹虏⌒钥赡苁峭ㄟ^采用不同于Fow1 和蛋白激酶A（FoCPKA）的信號(hào)途徑。本研究結(jié)果為進(jìn)一步研究G蛋白信號(hào)傳導(dǎo)途徑在尖孢鐮刀菌古巴?；椭虏∵^程中的作用奠定了基礎(chǔ)。

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