福州旗山野生蕉Musa spp. AB Group試管苗Mn—SOD基因克隆及生物信息學(xué)分析

張銳　賴(lài)鐘雄

摘 要 以旗山野生蕉（Musa spp.，AB group）試管苗幼嫩葉片為材料，利用RT-PCR結(jié)合RACE技術(shù)克隆獲得野生蕉試管苗Mn-SOD基因cDNA序列。結(jié)果表明：旗山野生蕉Mn-SOD的cDNA全長(zhǎng)序列共831 bp，其中5′UTR為137 bp，3′UTR為151 bp，3′端含有17個(gè)poly（A）尾。開(kāi)放閱讀框（ORF）共有543個(gè)堿基組成，編碼181個(gè)氨基酸。蛋白理化性質(zhì)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示：Mn-SOD蛋白分子量為20 108.8 u，等電點(diǎn) 7.92，屬于堿性蛋白。

關(guān)鍵詞 旗山野生蕉（Musa spp.，AB Group）；試管苗；基因克??；Mn-SOD基因；生物信息學(xué)分析

中圖分類(lèi)號(hào) Q943.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract The young leaves of in vitro plantlets of a wild banan（Musa spp.，AB group）grown in Qishan Mountain of Fuzhou were used as the materials to clone Mn-SOD gene by RT-PCR and RACE technology. The full-length cDNA sequence was 831 bp，containing 137 bp 5′UTR，543 bp open reading frame，encoding 181 amino acids，151 bp 3′UTR，and 3′-end involved 17 poly（A）tails. The prediction of proteins physical and chemical properties showed it belonged to a basic protein with 20 108.8 u and pI7.92.

Key words Wild banana（Musa spp.，AB Group）；In vitro plantlets；Gene cloning；Mn-SOD；Bioinformatics analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.11.020

正常生命活動(dòng)中，生物體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生與清除處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，這種動(dòng)態(tài)平衡是在超氧化物歧化酶（SOD）、抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、過(guò)氧化物酶（POD）等多種酶的協(xié)同作用下完成的[1]，而超氧化物歧化酶（SOD）則是生物體清除逆境反應(yīng)所產(chǎn)生的活性氧（ROS）的關(guān)鍵酶，廣泛存在于植物、動(dòng)物、微生物中[2]，在清除活性氧和自由基、保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷、增加膜結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定性、增強(qiáng)植物抗逆性等方面發(fā)揮重要作用[3]。根據(jù)所含金屬輔基的不同主要分為3類(lèi)：Mn-SOD、Cu/Zn-SOD和Fe-SOD，Cu/Zn-SOD主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，Mn-SOD主要存在于線(xiàn)粒體中，F(xiàn)e-SOD主要存在于葉綠體中。

抗氧化酶基因是目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的與植物抗寒性有關(guān)的起膜保護(hù)作用的抗寒功能蛋白基因。在膜保護(hù)酶與抗寒性的研究中，以SOD的研究最多[4]。將外源SOD基因轉(zhuǎn)到其他植物體內(nèi)，可以提高逆境條件下植物體內(nèi)SOD活性，降低脅迫條件下ROS對(duì)植物造成的損害，增強(qiáng)植物對(duì)各種逆境脅迫的適應(yīng)性[5]。Bowler等[6]早在1989年就開(kāi)始研究SOD在耐凍中的作用，該研究把煙草的Mn-SOD cDNA導(dǎo)入苜蓿中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的SOD活性增強(qiáng)，認(rèn)為是Mn-SOD抑制了超氧自由基的產(chǎn)生，從而提高抗寒能力。對(duì)桉樹(shù)的抗寒性研究也發(fā)現(xiàn)，桉樹(shù)SOD的活性與其耐寒性有關(guān)聯(lián)，是桉樹(shù)抗寒生理機(jī)制中的一個(gè)關(guān)鍵酶[7]。同時(shí)，SOD在植物抗病蟲(chóng)、抗旱、耐鹽堿、抗?jié)场⒖钩輨┑确矫嬉舶l(fā)揮著重要作用[8-9]。

香蕉屬芭蕉科（Musaceae）芭蕉屬（Musa）植物。起源于熱帶亞熱帶地區(qū)，生物學(xué)特性決定了其極易受寒害的侵襲，嚴(yán)重影響香蕉的品質(zhì)和次年產(chǎn)量。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)施用外源物質(zhì)在一定程度上可增加細(xì)胞保護(hù)酶的活性，提高香蕉抗寒能力[10]，但無(wú)法從根本上解決香蕉的寒害問(wèn)題，也不適用于實(shí)際生產(chǎn)。截至目前還沒(méi)有真正有效的方法從根本上解決寒害對(duì)香蕉造成的損失。栽培香蕉多數(shù)是三倍體、具有高度不育性，在生產(chǎn)上主要靠無(wú)性繁殖，很難采用傳統(tǒng)的育種方法實(shí)現(xiàn)品種改良。因此，要從根本上解決香蕉的寒害問(wèn)題，最有效的方法就是通過(guò)基因工程手段對(duì)栽培蕉進(jìn)行品種改良，提高其抗寒性。呂慶芳等[11]研究發(fā)現(xiàn)粉蕉、大蕉（Musa spp.，ABB Group）能抵御0～4 ℃的低溫，而野生蕉的抗寒性則更強(qiáng)，且種類(lèi)不同抗寒性也存在差異，如福州野生蕉[12]（Musa spp.，AA Group）能耐-2 ℃以下的低溫，而三明野生蕉（Musa spp.，AB Group）能耐-5 ℃以下的低溫[13]。香蕉（Musa spp.，AAA）則根本無(wú)法抵御0 ℃以下的低溫。這說(shuō)明香蕉的抗寒能力在本質(zhì)上由自身的遺傳物質(zhì)所決定。

Baum等[14]首次從玉米中克隆得到植物SOD基因。隨后，植物SOD基因的克隆在國(guó)內(nèi)外迅速開(kāi)展。目前已從水稻、擬南芥、煙草、柑橘、龍眼、小麥等多種植物中克隆得到Mn-SOD基因，部分已通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化驗(yàn)證了其功能。但該基因在香蕉中的克隆和研究較少，僅發(fā)現(xiàn)了香蕉（AAA）中的部分序列及全序列，在GenBank中的登錄號(hào)分別為： AF510071.1和AEZ56248.2。目前關(guān)于福州旗山野生蕉（Musa spp.，AB Group）的Mn-SOD基因尚未見(jiàn)報(bào)道。近年來(lái)香蕉基因組測(cè)序工作的完成及生物技術(shù)的發(fā)展為香蕉遺傳改良提供了一定的理論依據(jù)。本研究首次從福州旗山野生蕉（Musa spp.，AB Group）中克隆得到Mn-SOD基因的cDNA序列，并對(duì)其編碼的氨基酸序列進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析，為利用基因工程進(jìn)行香蕉的抗性育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料及主要試劑

供試材料為旗山野生蕉（Musa spp.，AB Group）離體保存試管苗幼嫩葉片；菌種DH5α感受態(tài)細(xì)胞及PCR反應(yīng)液均購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；植物總RNA通用提取試劑盒購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；pMD18-T載體、反轉(zhuǎn)錄試劑盒3′RACE均購(gòu)自Fermentas公司；5′RACE購(gòu)自Invitrogen公司；膠回收試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 野生蕉總RNA提取及cDNA的合成 利用通用植物總RNA提取試劑盒提取野生蕉試管苗幼嫩葉片總RNA，采用Fermentas公司的RevertAidTM First-Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒合成單鏈cDNA，用于保守區(qū)、3′RACE 及ORF的擴(kuò)增；采用Invitrogen公司的5′RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends、Version 2.0試劑盒合成5′RACE cDNA，用于5′RACE的擴(kuò)增，具體操作詳見(jiàn)說(shuō)明書(shū)。

1.2.2 野生蕉Mn-SOD基因保守區(qū)引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增 根據(jù)GenBank中已經(jīng)登錄的不同物種Mn-SOD基因高度保守區(qū)序列設(shè)計(jì)特異上游引物Mn-SOD-F和特異下游引物Mn-SOD-R，以保守區(qū)cDNA為模板，進(jìn)行保守區(qū)序列的擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25 μL，其中上下游引物各1 μL，2×Master Mix 12.5 μL，模板1 μL，用ddH2O補(bǔ)足25 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，退火57 ℃（根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果的不同進(jìn)行調(diào)整），共35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸40 s，35個(gè)循環(huán)后72 ℃繼續(xù)延伸10 min，于4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 野生蕉Mn-SOD基因3′RACE引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增 運(yùn)用DNAMAN 6.0和primer premier 5.0軟件，根據(jù)測(cè)序所得到的Mn-SOD基因保守區(qū)序列，選擇與其他物種序列相對(duì)特異的區(qū)域設(shè)計(jì)2條順式上游引物：3′Mn-SOD-1和3′Mn-SOD-2。以3′RACE cDNA為模板，3′Mn-SOD-1為上游引物，AUAP為下游引物，進(jìn)行第一輪3′端序列擴(kuò)增；以第一輪PCR產(chǎn)物為模版，3′Mn-SOD-2為上游引物，AUAP為下游引物，進(jìn)行第二輪3′端PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)程序同保守區(qū)。

1.2.4 野生蕉Mn-SOD基因5′RACE引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增 運(yùn)用DNAMAN 6.0軟件將測(cè)序所得到的Mn-SOD基因3′端序列與保守區(qū)序列進(jìn)行拼接，與其他物種Mn-SOD基因序列進(jìn)行比對(duì)，選擇與其他物種序列相對(duì)特異的區(qū)域設(shè)計(jì)2條反式下游引物：5′Mn-SOD-1和5′Mn-SOD-2，以AUAP為上游引物。采用巢式PCR進(jìn)行5′端擴(kuò)增。所用引物名稱(chēng)、引物序列、目的片段大小及退火溫度見(jiàn)表1。

1.2.5 野生蕉Mn-SOD ORF驗(yàn)證 用DNAMAN 6.0軟件將所獲得的野生蕉Mn-SOD基因的保守區(qū)、3′RACE及5′RACE序列進(jìn)行拼接可得到全長(zhǎng)cDNA序列。根據(jù)拼接得到野生蕉Mn-SOD基因全長(zhǎng)，在包括起始密碼子ATG和終止密碼子TGA處設(shè)計(jì)1對(duì)特異引物：上游引物ORF-F和下游引物ORF-R，以3′-RACE cDNA為模板進(jìn)行開(kāi)放閱讀框的擴(kuò)增，驗(yàn)證所克隆的Mn-SOD基因序列的正確性。

1.2.6 產(chǎn)物檢測(cè) 以1.0%瓊脂糖凝膠檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，使用Solarbio公司瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收目的片段，將其連接于載體pMD18-T上，采用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，過(guò)夜培養(yǎng)后挑選白斑單菌落進(jìn)行菌液培養(yǎng)；通過(guò)菌落PCR（與以cDNA為模板的PCR反應(yīng)條件相同）對(duì)陽(yáng)性克隆菌株進(jìn)行檢測(cè)，將PCR產(chǎn)物遞交給華大公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.7 生物信息學(xué)分析 將測(cè)序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行在線(xiàn)BLAST，檢測(cè)結(jié)果的正確性，利用DNAMAN 6.0軟件和ExPASy系統(tǒng)中的ProtParam工具對(duì)Mn-SOD基因編碼的蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、跨膜結(jié)構(gòu)域、亞細(xì)胞定位、磷酸化位點(diǎn)、分子進(jìn)化等進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，以進(jìn)一步了解其結(jié)構(gòu)和功能。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生蕉葉片總RNA的提取及質(zhì)量檢測(cè)

本研究所提取的總RNA近無(wú)色，不呈膠狀，基本上排除了多酚、多糖、蛋白質(zhì)等污染。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)可知，無(wú)DNA污染，總RNA條帶邊緣整齊，28S和18S的條帶比較清晰，說(shuō)明通用植物總RNA提取試劑盒所提取的RNA質(zhì)量好，純度高，可進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)（圖略）。 2.2 野生蕉Mn-SOD基因序列片段的獲得

以O(shè)lig（dT）18 prime進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，將所獲得的cDNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得400 bp左右的單一特異性條帶（圖1-A），測(cè)序結(jié)果為426 bp，包含上下游引物序列，與預(yù)期結(jié)果一致。將該序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行在線(xiàn)BLAST，結(jié)果顯示其與別的物種的Mn-SOD基因在核苷酸序列上高度同源，初步推斷克隆得到的片段為野生蕉Mn-SOD基因的保守區(qū)序列。

以3′RACE cDNA為模板，經(jīng)過(guò)2輪PCR擴(kuò)增，得到500 bp左右的單一條帶（圖1-B），測(cè)序結(jié)果為509 bp，包含上下游引物序列，與預(yù)期片段大小基本相符，終止密碼子為T(mén)GA，且具有典型的Poly（A）尾巴和加尾信號(hào)“AATAA”。用DNAMAN6.0軟件將該序列與保守區(qū)序列進(jìn)行拼接，2序列片段具有相應(yīng)的重復(fù)區(qū)，且該片段與已登錄NCBI的多種Mn-SOD基因高度同源，可認(rèn)為該片段是野生蕉Mn-SOD基因的3′末端片段。

以5′RACE cDNA為模板，經(jīng)過(guò)2輪巢式PCR擴(kuò)增，得到約300 bp的單一條帶（圖1-C），測(cè)序結(jié)果為315 bp，包含起始密碼子ATG。

2.3 野生蕉Mn-SOD基因全長(zhǎng)cDNA及ORF驗(yàn)證

將所獲得的野生蕉Mn-SOD基因cDNA全長(zhǎng)序列在GenBank上登錄，登錄號(hào)為：JF752346。開(kāi)放閱讀框（ORF）共由543個(gè)核苷酸組成，編碼181個(gè)氨基酸（圖2），ATG為起始密碼子，TGA為終止密碼子，包括完整的5′端非編碼區(qū)137 bp、3′端非編碼區(qū)151 bp及3′端poly（A）尾巴17 bp。

以3′RACE cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)測(cè)序得到550 bp的cDNA片段（圖1-D），與推斷的ORF序列完全相同，驗(yàn)證了所克隆的Mn-SOD基因的正確性。

將野生蕉Mn-SOD基因在http：//ncbi.nlm.nih.gov、http：//banana-genome.cirad.fr網(wǎng)站上進(jìn)行在線(xiàn)BLAST，其與不同物種間Mn-SOD基因的核苷酸序列同源性均比較高，其中該序列與芭蕉屬（JQ364939.2）同源性86%、荔枝（HQ661041.1）同源性79%、擬南芥（AY085319.1）同源性74%、番木瓜（L77078.1）同源性75%、蓖麻屬（XM_002520810.1）同源性74%，與香蕉基因組測(cè)序結(jié)果中的小果野蕉（Musa acuminata）核苷酸序列同源性高達(dá)96.8%，說(shuō)明本試驗(yàn)通過(guò)RACE克隆的基因是Mn-SOD基因。

2.4 野生蕉Mn-SOD基本理化性質(zhì)的預(yù)測(cè)及分析

根據(jù)DNAMAN 6.0軟件和ExPASy系統(tǒng)中的ProtParam工具，預(yù)測(cè)Mn-SOD蛋白的分子量為20 108.8 u，等電點(diǎn)pI為7.92，屬于堿性蛋白；分子式：C917H1402N248O259S2，總原子數(shù)為2 828；帶負(fù)電的氨基酸有18（Asp+Glu），帶正電的氨基酸有19（Arg+Lys）；消光系數(shù)：在280 nm時(shí)為50 420。在哺乳動(dòng)物網(wǎng)狀紅細(xì)胞的體外表達(dá)半衰期為30 h，在酵母和大腸桿菌中的體內(nèi)表達(dá)的半衰期分別大于20 h和10 h。不穩(wěn)定系數(shù)是25.71，在閾值范圍內(nèi)，說(shuō)明該蛋白屬于穩(wěn)定蛋白；脂肪系數(shù)為88.39?？偲骄杷詾?0.374，預(yù)測(cè)該蛋白是親水蛋白（水溶蛋白）。此蛋白質(zhì)由20種氨基酸組成，其中Ala、Leu、Lys、Gly、Val、Asn、Glu含量較為豐富，分別為20（11.1%）、18（10.0%）、16（8.9%）、15（8.3%）、13（7.2%）、12（6.7%）、10（5.6%），Met含量最少，只有2個(gè)（1.1%）。疏水性分析為跨膜結(jié)構(gòu)提供相互驗(yàn)證的依據(jù)。從整體上看，親水性氨基酸多于疏水性氨基酸，整條多肽鏈表現(xiàn)為親水性。運(yùn)用PSORT（http：//psort.nibb.ac.jp/）軟件進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)與分析可知，Mn-SOD定位在線(xiàn)粒體。推斷野生蕉Mn-SOD基因編碼的蛋白是一種線(xiàn)粒體蛋白。

通過(guò)在線(xiàn)BLAST比較野生蕉（Musa spp.， ABGroup）Mn-SOD和其他物種Mn-SOD的氨基酸序列可知，克隆得到的該序列含有2個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，包括SOD-Fe-N 和 SOD-Fe-C功能結(jié)構(gòu)域，說(shuō)明該Mn-SOD基因?qū)儆贔e/Mn-SOD超級(jí)家族成員。

運(yùn)用Tmpered（www.ch.embnet.org/software/tepred-form.html）及PSORT（http：//psort.nibb.ac.jp/）在線(xiàn)軟件進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)可知，僅在多肽鏈131～149（19）處有一個(gè)內(nèi)而外螺旋（Inside to outside helices），但分值太低，僅為265分，沒(méi)有超過(guò)500分，經(jīng)推測(cè)可知，野生蕉Mn-SOD沒(méi)有跨膜結(jié)構(gòu)域，屬于非跨膜蛋白。信號(hào)肽是指用于指導(dǎo)蛋白質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)移的位于分泌蛋白N-末端的氨基酸序列，一般由15～30個(gè)氨基酸組成，包括一個(gè)帶正電的N末端、以中性氨基酸為主的一個(gè)中間疏水序列和一個(gè)較長(zhǎng)的帶負(fù)電荷的C末端。信號(hào)肽的作用是指導(dǎo)新合成的多肽鏈進(jìn)行跨膜轉(zhuǎn)移，信號(hào)肽的預(yù)測(cè)和分析有助于理解蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位及功能域的劃分。經(jīng)SignaIP 3.0 Server在線(xiàn)分析可知，Mn-SOD屬于非分泌蛋白，不具信號(hào)肽（圖3），這和跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)的結(jié)果一致。用NetPhos 2.0 Serve軟件在線(xiàn)對(duì)野生蕉Mn-SOD基因編碼的氨基酸進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)（圖4），推測(cè)野生蕉Mn-SOD磷酸化位點(diǎn)為5個(gè)，在1個(gè)Ser（在肽鏈第72位）、1個(gè)Thr（117位）、3個(gè)Tyr（12、151、175位）氨基酸位點(diǎn)處發(fā)生磷酸化修飾。在肽鏈第175位的C末端有Tyr磷酸化位點(diǎn)，分值最高，達(dá)0.735，推測(cè)Tyr 磷酸化位點(diǎn)可能會(huì)影響野生蕉Mn-SOD的構(gòu)象、核定位調(diào)節(jié)等功能。

應(yīng)用InterProScan程序搜索位于EBI的InterPro數(shù)據(jù)庫(kù)（圖5）可知，Mn-SOD基因?qū)?yīng)的181個(gè)氨基酸殘基編碼的蛋白質(zhì)屬于Fe/Mn-SOD超級(jí)家族成員。該家族收錄了大量的蛋白質(zhì)成員，其中細(xì)菌域（bacteria）最多，由4 241個(gè)蛋白質(zhì)成員組成；集胞藻屬、果蠅和病毒最少，分別只有3個(gè)成員。通過(guò)JPred（http：//www.compbio.dundee.ac.uk/）預(yù)測(cè)Mn-SOD蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，其二級(jí)結(jié)構(gòu)包括51.11%的α螺旋、8.89%的延伸鏈和40.00%的不規(guī)則卷曲（圖6）。

螺旋主要位于C端?？v觀(guān)該蛋白的整體結(jié)構(gòu)，α螺旋和不規(guī)則卷曲是野生蕉葉片Mn-SOD蛋白最大的結(jié)構(gòu)元件，貫穿于整個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中，而延伸鏈較少，分散其中。利用SWISS-MODEL在線(xiàn)工具對(duì)Mn-SOD進(jìn)行蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，Mn-SOD蛋白有4個(gè)β折疊，5個(gè)α螺旋。

將所獲得的野生蕉Mn-SOD基因編碼的氨基酸序列與番木瓜（Carica papaya，GenBank登錄號(hào)：AAB02052.1）、荔枝（Litchi chinensis，GenBank登錄號(hào)：AEK05514.1）、擬南芥（Arabidopsis thaliana，GenBank登錄號(hào)：AAM62550.1）、蓖麻（Ricinus communis，GenBank登錄號(hào)：XP_002520856.1）、天寶蕉（Musa acuminata AAA Group，GenBank登錄號(hào)：AEZ56248.2）、基因組測(cè)序中的小果野蕉（Musa acuminata1，2，3）等幾個(gè)物種的Mn-SOD基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，用MEGA4.1軟件中的NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖7）。從圖中可以看出，9種植物可分為3個(gè)大組：5種芭蕉屬植物處于同一分支中，具有很高的同源性，聚為一類(lèi)的概率為90%；蓖麻單獨(dú)為一組；番木瓜、荔枝、擬南芥為一組，聚為一類(lèi)的概率為76%；克隆所得到的旗山野生蕉（Musa spp.， AB Group）Mn-SOD與基因組測(cè)序中的小果野芭蕉（Musa acuminate 1）同源性最高，兩者聚為一類(lèi)的概率為100%；天寶蕉（Musa acuminata AAA Group）與基因組測(cè)序中的小果野芭蕉（Musa acuminate 2）聚為一類(lèi)的概率為85%。上述結(jié)果說(shuō)明了Mn-SOD在進(jìn)化過(guò)程中的高度保守性及不同物種間該基因的特異性。

3 討論與結(jié)論

3.1 Mn-SOD基因功能多樣性

多項(xiàng)研究結(jié)果表明，Mn-SOD基因與植物的抗逆性有關(guān)，是一種重要的抗氧化劑，具有多種生物學(xué)功能。外源Mn-SOD基因的轉(zhuǎn)入可以提高植物清除活性氧的能力，明顯增強(qiáng)植物的抗性。McKersie等[15-16]將煙草Mn-SOD基因?qū)胲俎＞€(xiàn)粒體中，提高了苜蓿的產(chǎn)量和植株的抗冷性；應(yīng)用基因槍法將小麥錳超氧化物歧化酶基因（Mn-SOD）導(dǎo)入玉米胚性愈傷組織，獲得的轉(zhuǎn)基因植株中SOD的活性高于非轉(zhuǎn)基因植株，明顯提高了轉(zhuǎn)基因玉米的抗氧化損傷能力[17]；將豌豆錳超氧化物歧化酶導(dǎo)入水稻葉綠體中可以增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因水稻植株的耐旱性[18]；鄧婷婷等[19]將極端耐鹽的鹽生杜氏藻的錳超氧化物歧化酶（DsMnSOD）基因轉(zhuǎn)染SOD缺陷型大腸桿菌并誘導(dǎo)其表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，該大腸桿菌在耐鹽、耐輻射和抗寒方面的耐受性均明顯提高。上述結(jié)果進(jìn)一步證明了利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將Mn-SOD基因轉(zhuǎn)入植物基因組，能明顯提高植物的抗逆性。

本課題組多年來(lái)對(duì)野生蕉的調(diào)查研究表明，福州野生蕉（Musa spp.，AA Group）和三明野生蕉（Musa spp.，AB Group）均具有一定程度的抗寒性，三明野生蕉的抗寒性略高于福州野生蕉。張妙霞[20]已對(duì)三明野生蕉（Musa spp.，AB Group）抗寒相關(guān)基因進(jìn)行了克隆與表達(dá)分析，在功能上進(jìn)一步驗(yàn)證了野生蕉可能具有的抗寒性。植物的抗寒性為數(shù)量性狀，受微效多基因控制，應(yīng)該結(jié)合多個(gè)相關(guān)基因進(jìn)行系統(tǒng)的研究[21-22]。Mn-SOD作為一種抗寒功能蛋白基因，其抗寒性已在多種植物上得到證實(shí)，但在野生蕉中尚未見(jiàn)報(bào)道，因此從旗山野生蕉中克隆得到Mn-SOD基因并將其轉(zhuǎn)入栽培蕉基因組，所獲得的轉(zhuǎn)基因植株很可能會(huì)提高栽培蕉的抗寒性，為利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育香蕉抗寒新品種奠定基礎(chǔ)。

3.2 Mn-SOD蛋白質(zhì)功能預(yù)測(cè)與抗寒性

蛋白理化性質(zhì)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示該蛋白是親水蛋白。親水蛋白較高的親水性可避免膜構(gòu)像發(fā)生變化，對(duì)維持蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)具有重要作用，可能在抗凍過(guò)程中也起重要作用[20]；蛋白質(zhì)需要定位在一個(gè)或多個(gè)亞細(xì)胞位置來(lái)發(fā)揮其職能作用，亞細(xì)胞定位顯示該基因定位在線(xiàn)粒體，一些亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)如線(xiàn)粒體、葉綠體等是細(xì)胞內(nèi)活性氧的主要來(lái)源[23]。野生蕉具備較強(qiáng)的抗寒性，可能是由于植株在受到低溫脅迫時(shí)，線(xiàn)粒體內(nèi)高活性的Mn-SOD有效清除了細(xì)胞內(nèi)過(guò)多的活性氧和自由基，在調(diào)節(jié)膜透性、增加膜結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定性方面發(fā)揮了重要作用，這可能是野生蕉具有一定抗寒性的機(jī)理之一。二級(jí)結(jié)構(gòu)中α螺旋的比例最大，α螺旋的主要功能是作為蛋白質(zhì)骨架起穩(wěn)定作用，而無(wú)規(guī)則卷曲區(qū)則決定蛋白質(zhì)的功能。有研究認(rèn)為α螺旋一方面可以和冰晶結(jié)合，阻止其他水分子與冰晶結(jié)合，從而抑制冰晶生長(zhǎng)，另一方面可與其它蛋白質(zhì)或膜結(jié)合，穩(wěn)定膜功能，防止膜受低溫?fù)p傷[24]。關(guān)于Mn-SOD在野生蕉生長(zhǎng)過(guò)程中的功能及其調(diào)控機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究。

參考文獻(xiàn)

[1]汪本勤. 植物SOD的研究進(jìn)展[J]. 河北農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2008， 12 （3）： 6-9， 12.

[2] Cao Y J， Wei Q， Liao Y， et al. Ectopic overexpression of AtHDG11 in tall fescue resulted in enhanced tolerance to drought and salt stress[J]. Plant Cell Reports， 2009， 28（4）： 579-588.

[3] 常萬(wàn)霞. 檉柳MnSOD基因的克隆及功能驗(yàn)證[D]. 哈爾濱： 東北林業(yè)大學(xué)， 2006.

[4] Ariizumi T， KishitaniS， Inatsugi R， et a1. An increase in unsaturation of fatty acids in phosphatidylglycerol from leaves improves the rates of photosynthesis and growth at low temperatures in transgenic rice seedlings[J]. Plant Cell Physiol， 2002， 43（7）： 751-758.

[5] Sunkar R， Kapoor A， Zhu J K. Posttranscriptional induction of two Cu/Zn superoxide dismutase genes in Arabidopsis is mediated by down regulation of miR398 and important for oxidative stress tolerance[J]. The Plant Cell， 2006， 18（8）： 2 051-2 065.

[6] Bowler C， Slooten L， Vandenbranden S， et al. Manganese superoxide dismutase can reduce cellular damage mediated by oxygen radicals in transgenic plants[J]. EMBO J， 1991， 10（7）： 1 723-1 732.

[7]朱寧華， 李志輝， 李芳東. 桉樹(shù)耐寒性與超氧化物歧化酶關(guān)系研究[J]. 中南林學(xué)院學(xué)報(bào)， 2000， 20（3）： 63-66.

[8]王廣慧. 植物SOD的分子生物學(xué)及其在植物抗逆基因工程中的應(yīng)用進(jìn)展[J]. 北方園藝， 2011（3）： 194-197.

[9]竇俊輝， 喻樹(shù)迅， 范術(shù)麗， 等. SOD與植物脅迫抗性[J]. 分子植物育種， 2010， 8（2）： 359-364.

[10] 李茂富， 李紹鵬， 吳 凡， 等. 香蕉抗寒性的研究進(jìn)展[J]. 華南熱帶農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2005， 11（1）： 51-54.

[11]呂慶芳， 豐 鋒， 張秀枝. 香蕉葉片組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)特性與耐寒性的關(guān)系[J]. 湛江海洋大學(xué)學(xué)報(bào)， 2000， 20（2）： 48-51.

[12]賴(lài)鐘雄， 陳 源， 林玉玲， 等. 福州野生蕉（Musa spp.， AA Group）的發(fā)現(xiàn)及其分類(lèi)學(xué)地位的初步確定[J]. 亞熱帶農(nóng)業(yè)研究， 2007， 3（1）： 1-5.

[13]賴(lài)鐘雄， 陳 源， 林玉玲， 等. 三明野生蕉基本生物學(xué)特性調(diào)查[J]. 亞熱帶農(nóng)業(yè)研究， 2006， 2（4）： 241-244.

[14] Baum J A， Scandalios J G. Multiple genes controlling superoxide dismutase expression in maize[J]. Journal of Heredity， 1982， 73（2）： 95-100.

[15] McKersie B D， Bowley S R， Jones K S. Winter survival of transgenic alfalfa overexpressing superoxide dismutase[J]. Plant Physiology， 1999， 119（3）： 839-848.

[16] McKersie B D， Chen Y， de Beus M， et al. Superoxide dismutase enhances tolerance of freezing stress in transgenic alfalfa（Medicago sativa L.）[J]. Plant Physiology， 1993， 103（4）： 1 155-1 163.

[17] 何敬和， 姚 麗. 小麥Mn-SOD基因的克隆及其在鹽脅迫下的表達(dá)分析[J]. 麥類(lèi)作物學(xué)報(bào)， 2010， 30（4）： 630-633.

[18] Wang F Z， Wang Q B， Kwon S Y， et al. Enhanced drought tolerance of transgenic rice plants expressing a pea manganese superoxide dismutase[J]. Journal of Plant Physiology， 2005， 162（4）： 465-472.

[19]鄧婷婷， 李 靜， 馬 根， 等. 鹽生杜氏藻錳超氧化物歧化酶（MnSOD）在大腸桿菌中的功能鑒定[J]. 四川大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2007， 44（1）： 176-180.

[20]張妙霞. 野生香蕉（Musa spp.， AB group）抗寒相關(guān)基因的克隆與表達(dá)分析[D]. 福州： 福建農(nóng)林大學(xué)， 2010.

[21]袁維風(fēng)， 徐德聰， 錢(qián)玉梅. 植物抗寒基因及基因工程研究[J]. 宿州學(xué)院學(xué)報(bào)， 2009， 24（6）： 109-112.

[22] 彭筱娜， 易自力， 蔣建雄. 植物抗寒性研究進(jìn)展[J]. 生物技術(shù)通報(bào)， 2007（4）： 15-18.

[23] 馬旭俊， 朱大海. 植物超氧化物歧化酶（SOD）的研究進(jìn)展[J]. 遺傳， 2003， 25（2）： 225-231.

[24] 王轉(zhuǎn)梅， 陳崇順， 王 軼， 等. 煙草品種XanthiNN堿性β-l， 3-葡聚糖酶基因的克隆與生物信息學(xué)分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2009（l）：28-31.