• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    豬繁殖與呼吸綜合征疫苗研究進展

    2014-04-29 20:23:30馬德慧薛江東楊鳴霞姚睿智商祥軍
    中國動物保健 2014年12期
    關(guān)鍵詞:活疫苗載體仔豬

    馬德慧 薛江東 楊鳴霞 姚睿智 商祥軍

    豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome , PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)引起的豬的一種急性熱性接觸性傳染病,該病主要特征是厭食、發(fā)熱,懷孕母豬中后期發(fā)生流產(chǎn),產(chǎn)死胎,木乃伊胎;幼齡仔豬發(fā)生呼吸道癥狀和大量死亡。該病最早于1987年在美國發(fā)現(xiàn)[1]。荷蘭學(xué)者Wensvoort G等在1990年底首次從人工和自然感染的病豬中分離到該病毒, 并將其命名為Lelvstad virus (LV)。1992年,世界動物衛(wèi)生組織(Office Inlernalional Des Epizoolies,OIE)在國際專家研討會上采用了PRRS這一名稱[2]。我國于1996年由郭寶清等首次從國內(nèi)疑似PRRSV感染豬群中分離出PRRSV,從而證實該病在我國的存在[3]。2006年夏季,“豬高熱綜合征”在我國南方地區(qū)首先發(fā)生并流行,然后迅速波及全國大部分養(yǎng)豬地區(qū)[4]。2007年1月,經(jīng)過國內(nèi)許多專家學(xué)者的不斷研究,最后確定了引起國內(nèi)“豬高熱綜合征”的主要病原是PRRSV變異株,并將這種由PRRSV變異株引起的疾病命名為豬高致病性藍耳病(HP-PRRS)。近幾年,PRRSV不斷變異,出現(xiàn)了毒力更強的PRRSV變異株,嚴(yán)重危害著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展,由于尚無特效的藥物療法,所以疫苗研制就成為熱點問題之一。

    1 PRRS滅活疫苗

    目前我國使用的商品化PRRS滅活疫苗主要由NVDGJ XAI株和CH-la株滅活制成的,臨床實踐表明滅活疫苗的免疫保護效果良好。周建勝等對來自山東省接種PRRS滅活疫苗的豬場進行PRRSV特異性抗體檢測[5]。發(fā)現(xiàn)接種過PRRS滅活疫苗的豬場,PRRSV的特異性抗體水平均較高,達到56.4%~87.9%。郭寶清等選用豬繁殖與呼吸綜合征CH-1a株,在Marc 145細胞上增殖了較高滴度后制成PRRS油佐劑滅活疫苗,經(jīng)過免疫效力試驗和攻毒試驗發(fā)現(xiàn),用該疫苗免疫過的豬,體內(nèi)抗體在20 d左右達到高峰,并能維持半年左右,說明該疫苗的免疫保持期較長[6]。王星晨等利用豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)安徽分離株制備了油乳劑滅活疫苗,用該疫苗免疫豬,7 d后便能夠產(chǎn)生抗體,14 d后血清抗體水平達到高峰,免疫28 d以后使用強毒進行攻擊,保護力可達80%[7]。

    盡管滅活疫苗有較好的免疫效果,但存在免疫劑量大、免疫次數(shù)多、免疫產(chǎn)生周期長、對異源株免疫保護效果差等缺點[8]。Nilubol等報道,用PRRS滅活疫苗免疫仔豬后,攻毒不能保護仔豬對PRRSV的感染,病毒感染后病毒血癥的持續(xù)時間和病毒的滴度與非免疫組無顯著差別,但是能增加中和抗體的效價和產(chǎn)生IFN-γ的細胞數(shù)[9]。由此看出PRRS滅活疫苗并不能夠適應(yīng)PRRSV具有很強變異性這一特點,所以單獨使用PRRS滅活疫苗來預(yù)防PRRS的發(fā)生和流行是遠遠不夠的[10,11]。

    2 PRRS弱毒疫苗

    弱毒疫苗是用微生物產(chǎn)生的自然強毒或從自然界篩選的自然弱毒株通過人工致弱而制成的。盡管弱毒疫苗在制作過程中毒力被減弱,但是病原仍可在免疫動物體內(nèi)進行繁殖,所以弱毒疫苗具有用量小,免疫原性好,免疫期長,成本低等優(yōu)點。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)接種過PRRS弱毒疫苗的仔豬對抗PRRSV感染的能力要強于接種PRRS滅活疫苗的仔豬。劉海珍等研究表明,首次免疫和加強免疫均用高致病性豬藍耳病滅活疫苗,抗體保護率只有30~40%;而首次免疫用高致病性豬藍耳病弱毒疫苗,加強免疫用高致病性豬藍耳病滅活苗或弱毒疫苗,免疫保護率能達到80%以上[12]。

    目前我國國內(nèi)使用的PRRS弱毒疫苗毒株主要有R98株、CH-1R株、HuN4-F112株、JXA1-R株等。冷雪等用高致病性PRRSV致弱株TJM制備弱毒疫苗,安全性試驗表明該疫苗對4~5周齡仔豬安全,攻毒試驗表明疫苗接種豬對強毒攻擊的保護率達到80%(4/5)以上,保存期試驗顯示該疫苗易于保存[13]。李惠蘭等用JXAI-R株、TJM-F92株、HUN4-F112株3個毒株高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗對豬進行免疫試驗[14]。1個月后抗體檢測顯示合格率均達到100%;3個月后再次進行抗體檢測,合格率仍可保持在80%~100%之間,說明這3個毒株疫苗均可以產(chǎn)生較好的免疫效果。徐小艷等對PRRS活疫苗(JXA1-R株)進行了試驗,疫苗的安全性試驗和普免試驗表明該疫苗用于3~4周齡仔豬是安全的,且免疫效果良好[15]。

    盡管PRRS弱毒疫苗對PRRSV的感染能起到一定的保護作用,但是,弱毒疫苗在使用過程中同樣存在著一些缺點。有報道稱PRRSV可以通過母體胎盤感染給胎兒,如果母豬在懷孕期間接種了PRRS弱毒疫苗,那么很有可能產(chǎn)下帶有PRRSV的小豬;另外,有些接種過PRRS弱毒疫苗的公豬精液中也可以分離到病毒。Nielsen J等使用從胎兒、死胎及死亡的仔豬中分離到的疫苗源毒人工感染懷孕晚期的母豬,發(fā)現(xiàn)人工分離到的疫苗源毒能在豬群當(dāng)中持續(xù)存在,并且引發(fā)疾病[16]。由此看來應(yīng)該謹慎使用PRRS弱毒疫苗。

    3 生物技術(shù)疫苗

    生物技術(shù)疫苗是利用生物技術(shù)制備的分子水平的疫苗。目前,PRRS生物技術(shù)疫苗主要有基因工程亞單位疫苗和活載體疫苗、基因缺失疫苗、DNA疫苗等。

    3.1 基因工程亞單位疫苗

    基因工程亞單位疫苗是用DNA重組技術(shù),將編碼病原微生物保護性抗原的基因?qū)朐思毎ㄈ绱竽c桿菌)或真核細胞(如雞胚成纖維細胞,CHO細胞),使其在受體細胞中高效表達,分泌保護性抗原肽鏈。提取保護性抗原肽鏈,加入佐劑即制成基因工程亞單位疫苗,又稱為生物合成亞單位疫苗。這種基因工程亞單位疫苗,只含有產(chǎn)生保護性免疫應(yīng)答所必需的免疫原成分,不含有免疫所不需要的成分,因此有很多優(yōu)點。首先,是安全性好,疫苗中不含傳染性材料,接種后不會發(fā)生急性、持續(xù)或潛伏感染,可用于不宜使用活疫苗的一些情況,如妊娠母豬;其次,這些疫苗減少或消除了常規(guī)活疫苗或死疫苗難以避免的致熱原、變應(yīng)原、免疫抑制原和其他有害的反應(yīng)原。

    Jianzhong Hu等用玉米的愈傷組織表達了PRRSV的M蛋白,并將其口服給小鼠,結(jié)果表明該病毒蛋白可以引起小鼠的體液免疫應(yīng)答并且產(chǎn)生了具有病毒中和活性的IgG和IgA抗體;除此之外,在接種動物的脾細胞還檢測到PRRSV特異性的

    IFN-γ[17]。這些結(jié)果表明利用轉(zhuǎn)基因玉米來生產(chǎn)PRRS口服亞單位疫苗是非常有潛力的。錢洪喜等將構(gòu)建的pPIC9K-NA和pPIC9K-NE重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入到酵母宿主細胞GS115中進行蛋白表達試驗[18]。SDS-PAGE結(jié)果顯示,表達出來的兩種產(chǎn)物大小均約為15 kD,Dot blot結(jié)果表明表達的兩種N蛋白可以與各自對應(yīng)的陽性血清發(fā)生反應(yīng),這說明N蛋白具有較好的反應(yīng)原性。Plana等把PRRSV的ORF2-ORF7基因分別插入到桿狀病毒表達載體內(nèi),結(jié)果只有ORF2、ORF3 、ORF5和ORF7在昆蟲細胞中表達,將ORF3和ORF5基因的表達產(chǎn)物提取后免疫懷孕母豬,結(jié)果顯示,ORF3基因的表達產(chǎn)物保護率為68.4%,ORF5基因的的表達產(chǎn)物保護率為50%[19]。

    3.2 基因工程疫苗

    基因工程疫苗包括活載體疫苗和基因缺失疫苗二類。

    3.2.1 活載體疫苗

    活載體疫苗是用基因工程技術(shù)將病毒或細菌構(gòu)建成一個載體,然后把外源基因插入其中使之表達的活疫苗。該類疫苗免疫動物后向宿主免疫系統(tǒng)提交免疫原性蛋白的方式與自然感染時的真實情況很接近,可誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫比較廣泛,包括體液免疫和細胞免疫,甚至黏膜免疫,所以可以避免重組亞單位疫苗的很多缺點。如果載體中同時插入多個外源基因,就可以達到一針防多病的目的。

    仇玉等以雞痘病毒為載體構(gòu)建了重組有PRRSV免疫原性基因的重組雞痘病毒疫苗rFPV-GP5,rFPV-M和rFPV-GP5-M,結(jié)果顯示,小鼠在接種重組雞痘病毒兩周后體內(nèi)可產(chǎn)生PRRSV特異性抗體,并且使用rFPV-GP5-M免疫的小白鼠體內(nèi)中和抗體滴度明顯高于用rFPV-M和rFPV-GP5蛋白免疫組;另外,rFPV-GPS-M可以顯著促進小鼠T細胞的增殖和IFN-γ的分泌,這說明重組雞痘病毒rFPV-GP5-M能夠引起機體的體液免疫和細胞免疫,并且效果良好,具有成為抗PRRSV新型疫苗的潛力[20]。鄭其升等構(gòu)建了共表達PRRSV NJ-a株GP4, GP5和M蛋白的重組病毒rMVA-GP5/M/GP4[21]。利用該重組病毒rMVA-GP5/M/GP4免疫小鼠3周后,便可以檢測出特異性PRRSV中和抗體,8周后檢測發(fā)現(xiàn)中和抗體效價達到25,并能持續(xù)4周;淋巴細胞增殖試驗發(fā)現(xiàn),重組病毒可以使免疫小鼠產(chǎn)生特異性細胞增殖反應(yīng),該研究說明rMVA-GP5/M/GP4免疫原性較好,可以作為新型PRRS候選疫苗進行進一步研究。許信剛等成功構(gòu)建了表達PRRSV GP5蛋白的口服重組減毒鼠傷寒沙門氏菌活載體疫苗株X4550(pYA3341-ORF5)。將重組菌口服免疫小鼠后可以產(chǎn)生抗GP5蛋白的中和抗體,同時,還發(fā)現(xiàn)重組菌株可以調(diào)節(jié)細胞免疫;除此之外,淋巴細胞增殖試驗還發(fā)現(xiàn),該重組菌能夠誘發(fā)小鼠體內(nèi)產(chǎn)生較強的細胞免疫應(yīng)答[22]。

    3.2.2 基因缺失疫苗

    基因缺失疫苗是用基因工程技術(shù)將強毒株毒力相關(guān)基因切除構(gòu)建的活疫苗,該苗安全性好、不易返祖;其免疫接種與強毒感染相似,機體可對病毒的多種抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答;免疫力堅強,免疫期長,尤其適于局部接種,誘導(dǎo)產(chǎn)生黏膜免疫,因而是較理想的疫苗。

    武華等通過多年研究獲得了一種PRRSV基因缺失疫苗毒株TJM-F92,該疫苗安全性好,懷孕的母豬、幼齡的仔豬都能用。注射疫苗3 d后,豬就產(chǎn)生抗體,可迅速有效地抵抗“藍耳病”的自然感染[23]。能使豬“藍耳病”的保護率達到80%以上。

    3.3 DNA疫苗

    DNA疫苗是應(yīng)用基因工程技術(shù)把編碼保護性抗原的基因與能在真核細胞中表達的載體DNA重組,這種目的基因與表達載體的重組DNA可直接接種到動物體內(nèi),目的基因可在動物體內(nèi)表達,刺激機體產(chǎn)生體液免疫和細胞免疫。

    馬德慧等成功構(gòu)建了基因疫苗表達載體pEGP5-C1和pEM-C1,并進行了小鼠免疫試驗,結(jié)果表明重組基因疫苗質(zhì)粒能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性中和抗體,并且從二免后的第一周開始檢測到特異性淋巴細胞增殖反應(yīng)[24]。高磊等分別構(gòu)建了單獨表達PRRSV GP5基因以及PRRSV GP5基因和豬IL-18基因共表達的重組核酸疫苗質(zhì)粒(pEGFP-GP5和pEGFP-IL 18-GP5 )[25]。試驗表明,接種pEGFP-IL18-GP5核酸疫苗的仔豬體內(nèi)產(chǎn)生抗體的數(shù)量,產(chǎn)生IFN-γ的細胞數(shù)和特異性T淋巴細胞增殖反應(yīng)均高于接種pEGFP-GP5組。杜東華等構(gòu)造了pcDNA-GP5-M-N真核重組質(zhì)粒,然后用重組質(zhì)粒pcDNA-GP5-M-N免疫Balb/c小鼠,中和抗體檢測結(jié)果表明,首免后2周即有小鼠產(chǎn)生可檢測到的病毒中和抗體(1∶4),隨后抗體水平快速升高,第8周抗體效價達到最高(1∶32),該試驗結(jié)果表明構(gòu)建的重組質(zhì)粒pcDNA-GP5-M-N能誘發(fā)免疫小鼠產(chǎn)生較高水平的中和抗體[26]。

    4 展望

    目前我國在PRRS的預(yù)防控制上主要采用的還是常規(guī)疫苗,但是由于滅活疫苗免疫效果差、免疫反應(yīng)持續(xù)時間短、需要多次接種、對異源株免疫保護效果差以及弱毒疫苗存在散毒和毒力返強等缺點,因此加快新型生物技術(shù)疫苗的研究并將其推廣到臨床應(yīng)用已迫在眉睫。

    生物技術(shù)疫苗憑借其使用安全、保護效果好等優(yōu)勢成為當(dāng)前人們研究的熱點,隨著學(xué)者們對豬繁殖與呼吸綜合征病毒研究的不斷深入,人們對其保護性抗原基因已經(jīng)基本確定,這些研究成果將為開發(fā)新型PRRS疫苗提供依據(jù)??蒲泄ぷ髡邆兛梢詫⒖乖蛏吓c免疫反應(yīng)無關(guān)的作用位點剔除或突變,或者同時將幾種不同的保護性抗原基因整合到同一重組質(zhì)粒,這樣一個重組質(zhì)粒便可以同時表達多種保護性抗原,使疫苗的免疫保護水平大大提升?;蛉笔б呙缗c其他疫苗之間無免疫干擾性,可以和其他疫苗一起使用,并且儲存和使用都比較方便,是很有潛力的新型疫苗,值得進行深入研究。除此之外,理想的疫苗佐劑和表達載體也是接下來需要深入研究的。

    總之,伴隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展,相信會有越來越多的新型PRRS疫苗將被應(yīng)用于臨床實踐。█(編輯:李雨慈)

    參考文獻:

    [1] 陳溥言.獸醫(yī)傳染病學(xué)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2006.

    [2] 胡恒龍,王強,左瑞華.豬繁殖與呼吸綜合征-豬藍耳病的診斷與防制[J].畜牧與飼料科學(xué),2009,30(7-8):29-33.

    [3] 郭寶清,陳章水,劉文興,等.從疑似PRRS流產(chǎn)胎兒分離PRRSV的研究[J].中國畜禽傳染病,1996(2):1-4.

    [4] 王東東,鄧雨修,招麗嬋,等.我國豬繁殖與呼吸綜合征流行概況[J].動物醫(yī)學(xué)進展,2009,30(5):101-104.

    [5] 周建勝.山東省豬繁殖與呼吸綜合征病毒的分離鑒定及PRRS滅活疫苗免疫技術(shù)研究[D].山東:山東農(nóng)業(yè)大學(xué),2010.

    [6] 郭寶清,蔡雪暉,劉文興,等.豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗的研制[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報,2000,22(4):259-261.

    [7] 王星晨,李郁,王桂軍,等.豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗的制備及免疫試驗[J].中國生物制品學(xué)雜志,2010,23(4):382-384.

    [8] 李麗琴,蔡雪輝,劉永剛,等.PRRSV變異株活疫苗和火活疫苗免疫特性的研究[J].中國獸醫(yī)學(xué)報.2010,32(6):465-472.

    [9] Nilubol D, Platt K B, Halbur P G, et al. The effect of a killed porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) vaccine treatment on virus shedding in previously PRRSV infect-ed pigs [J]. Vet Microbiol, 2004, 102(122): 11-18.

    [10] 王隆柏,魏宏,陳少鶯,等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒滅活疫苗安全性和免疫原性測定[J].中國獸醫(yī)雜志,2007,22(2):185-187.

    [11] 胡守萍,張卓,蔡雪輝,等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒弱毒疫苗和變異株滅活疫苗的免疫效果評價[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報.2009,31(5):392-396.

    [12] 劉海珍,張俊文.不同豬藍耳病疫苗對仔豬免疫效果對比試驗[J].中國畜禽種業(yè),2013,(2):42-43.

    [13] 冷雪,李真光,夏銘崎,等.高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗的研制[J].中國獸醫(yī)科學(xué),2011,41(11):1171-1175.

    [14] 李惠蘭,孫永祥,李樹博,等.高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗免疫試驗報告[J].現(xiàn)代畜牧獸醫(yī),2011(11):43.

    [15] 徐小艷,徐正軍,陳昌海,等.高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗(JXA1-R株)免疫效果及安全性試驗[J].Animal Husbandry&Veterinary Medicine,2014, 46(4):118-119.

    [16] NIELSEN J,BOTNER A,BILLE-HANSEN V,et al.Experimental inoculation of late term pregnant sows with a field isolate of porcine reproductive and respiratory syndrome vaccine-derived virus[J].Vet Microbiol,2002,84(1/2):1-13.

    [17] Jianzhong Hu,Yanyan Ni,Barbara A ,et al.Immunogenicity study of plant-made oral subunit vaccine against porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)[J].Vaccine,2012(30):2068-2074.

    [18] 錢洪喜.PRRSV N基因原核雙基因表達載體與畢赤酵母表達載體的構(gòu)建及其表達研究[D].四川雅安:四川農(nóng)業(yè)大學(xué),2008.

    [19] Plana Duran J,Climent I.Sarraseca J,et al.Baculovirus expression of proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome virus strain OIot/91.In volvement of ORF3 and ORF5 proteins in protection[J].Virus Genes,1997,14(1):19-29.

    [20] 仇玉,王明珍.豬繁殖與呼吸綜合征病毒三種不同基因活載體疫苗的免疫性研究[J].廣東畜牧獸醫(yī)科技,2011,36(1):28-31.

    [21] 鄭其升,畢志香,李鵬,等.共表達豬呼吸與繁殖障礙綜合征病毒NJ-a株ORF4.ORF5與ORF6基因重組改良型痘苗病毒安卡拉株的構(gòu)建[J].微生物學(xué)報,2007,47(2):345-349.

    [22] 許信剛,趙紅妮,童德文.表達豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5蛋白減毒鼠傷寒沙門氏菌疫苗株的構(gòu)建及動物免疫試驗[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報,2011,42(7):955-962.

    [23] 王梅.泰州醫(yī)藥城研發(fā)豬"藍耳病"基因缺失活疫苗[EB/OL].http://www.jsagri.gov.cn/news/files/536397.asp,2012-07-31/2014-05-01.

    [24] 馬德慧,薛江東,劉鍇,等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5、M蛋白基因的克隆及其基因疫苗構(gòu)建[J].中國獸醫(yī)學(xué)報,2010,30(2):150-153.

    [25] 高磊,等.PRRSV GP5蛋白與豬IL-18基因共表達核酸疫苗的構(gòu)建及免疫原性研究[D].吉林:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué),2011.

    [26] 杜冬華,周靜,王愛華,等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒HB-3株GP5-M-N蛋白核酸疫苗的構(gòu)建及免疫原性[J].中國獸醫(yī)學(xué)報,2014,34(2):177-181.

    猜你喜歡
    活疫苗載體仔豬
    創(chuàng)新舉措強載體 為僑服務(wù)加速跑
    華人時刊(2022年9期)2022-09-06 01:02:44
    新冠病毒滅活疫苗誕生記
    春季仔豬白肌病如何防治
    秋冬季仔豬保暖措施有哪些
    注意預(yù)防仔豬腹瀉
    堅持以活動為載體有效拓展港澳臺海外統(tǒng)戰(zhàn)工作
    華人時刊(2020年15期)2020-12-14 08:10:36
    鴨黃病毒滅活疫苗的制備與免疫效力研究
    仔豬
    滴鼻免疫布氏菌活疫苗保護效果的研究
    TiO_2包覆Al_2O_3載體的制備及表征
    97超碰精品成人国产| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 视频区图区小说| 网址你懂的国产日韩在线| 久久精品国产a三级三级三级| 国产乱来视频区| 国产精品久久久久成人av| 亚洲精品国产av成人精品| 亚洲国产av新网站| 永久免费av网站大全| 久久久久久久久久人人人人人人| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 十八禁网站网址无遮挡 | 男人添女人高潮全过程视频| 久久久精品免费免费高清| 熟女av电影| 国产黄片美女视频| 国产免费福利视频在线观看| 深夜a级毛片| 99久久中文字幕三级久久日本| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 日韩亚洲欧美综合| 日韩欧美一区视频在线观看 | 日韩中文字幕视频在线看片 | 亚洲精品自拍成人| 丰满乱子伦码专区| 精品人妻熟女av久视频| 蜜桃在线观看..| 国产乱人视频| 久久人人爽av亚洲精品天堂 | 久久99热这里只有精品18| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜 | 交换朋友夫妻互换小说| 一级a做视频免费观看| 老司机影院成人| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 亚洲色图av天堂| av免费观看日本| 久久综合国产亚洲精品| 国产爽快片一区二区三区| 大香蕉久久网| 成人国产av品久久久| 少妇的逼好多水| 久久国内精品自在自线图片| 国产成人精品一,二区| 免费观看av网站的网址| 精品久久国产蜜桃| 亚洲精品第二区| 夜夜爽夜夜爽视频| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 少妇人妻精品综合一区二区| 欧美+日韩+精品| 国产黄频视频在线观看| 超碰av人人做人人爽久久| 国产亚洲一区二区精品| 欧美+日韩+精品| 亚洲欧美日韩无卡精品| 综合色丁香网| 嘟嘟电影网在线观看| 亚洲人成网站在线观看播放| 麻豆成人av视频| 十八禁网站网址无遮挡 | 91精品一卡2卡3卡4卡| 十八禁网站网址无遮挡 | 你懂的网址亚洲精品在线观看| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 精品久久久久久久久亚洲| 七月丁香在线播放| 丰满迷人的少妇在线观看| 亚洲欧美清纯卡通| 亚洲,一卡二卡三卡| 大片免费播放器 马上看| 色视频在线一区二区三区| 国产在视频线精品| 日韩 亚洲 欧美在线| 久久久精品免费免费高清| 亚洲av中文av极速乱| 我要看日韩黄色一级片| 久久99热6这里只有精品| 亚洲精品一二三| 国产又色又爽无遮挡免| 精品人妻视频免费看| 校园人妻丝袜中文字幕| 蜜桃久久精品国产亚洲av| .国产精品久久| 十分钟在线观看高清视频www | 亚洲精品第二区| 国产精品不卡视频一区二区| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 欧美性感艳星| 91精品国产九色| 亚洲色图av天堂| 精品一区二区免费观看| 国产淫片久久久久久久久| 亚洲av在线观看美女高潮| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 久久久久国产精品人妻一区二区| 欧美成人精品欧美一级黄| 国产午夜精品一二区理论片| 高清黄色对白视频在线免费看 | 久久久久久九九精品二区国产| 中文字幕av成人在线电影| 亚洲天堂av无毛| 大片电影免费在线观看免费| 美女福利国产在线 | 国产欧美亚洲国产| 天堂中文最新版在线下载| 黄色欧美视频在线观看| 欧美日本视频| 欧美日韩综合久久久久久| 在线看a的网站| 一区二区三区精品91| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 色婷婷久久久亚洲欧美| 中文字幕亚洲精品专区| 少妇的逼水好多| 亚洲国产高清在线一区二区三| 国产一区二区在线观看日韩| 精品一区在线观看国产| 国内精品宾馆在线| 熟妇人妻不卡中文字幕| 高清视频免费观看一区二区| 亚洲av欧美aⅴ国产| 亚洲av男天堂| 欧美成人a在线观看| 晚上一个人看的免费电影| 亚洲av二区三区四区| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 免费在线观看成人毛片| 亚洲成人av在线免费| 丰满人妻一区二区三区视频av| 老司机影院成人| 国产精品不卡视频一区二区| 中国三级夫妇交换| 免费看av在线观看网站| 国产av精品麻豆| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 99热全是精品| 久久久久久久久久久免费av| 777米奇影视久久| 久久久久国产精品人妻一区二区| 欧美最新免费一区二区三区| 亚洲精品国产色婷婷电影| 性色av一级| 亚洲成色77777| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 国产美女午夜福利| 亚洲av二区三区四区| 在线观看三级黄色| 久热久热在线精品观看| av网站免费在线观看视频| 免费大片18禁| 日本欧美视频一区| 看非洲黑人一级黄片| 日韩欧美精品免费久久| 欧美日本视频| 爱豆传媒免费全集在线观看| 少妇熟女欧美另类| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 黑人猛操日本美女一级片| 久热久热在线精品观看| 22中文网久久字幕| 国产免费一区二区三区四区乱码| 尾随美女入室| 久久久久视频综合| 欧美日韩亚洲高清精品| 日韩av不卡免费在线播放| 国产高清有码在线观看视频| 久久这里有精品视频免费| 哪个播放器可以免费观看大片| 亚洲国产最新在线播放| 欧美+日韩+精品| 我的女老师完整版在线观看| 免费看日本二区| 全区人妻精品视频| 精品少妇久久久久久888优播| 国产乱人偷精品视频| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 久久精品久久精品一区二区三区| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 久久国产乱子免费精品| 国产 精品1| 午夜视频国产福利| 精品人妻偷拍中文字幕| 国产男女内射视频| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 久热久热在线精品观看| 2021少妇久久久久久久久久久| 久久国产亚洲av麻豆专区| 日韩 亚洲 欧美在线| 精品一区二区三卡| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 高清日韩中文字幕在线| 精品久久久精品久久久| 久久久久久伊人网av| 一二三四中文在线观看免费高清| 国产一级毛片在线| 中文资源天堂在线| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 精品久久久久久久久av| 日本一二三区视频观看| 国产人妻一区二区三区在| 青春草视频在线免费观看| 国产毛片在线视频| 男的添女的下面高潮视频| 精品久久久久久久末码| 欧美高清成人免费视频www| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 欧美精品亚洲一区二区| 免费观看av网站的网址| 亚洲成人手机| 久久久久久久久久成人| 免费av中文字幕在线| 丝瓜视频免费看黄片| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 亚洲综合精品二区| 三级经典国产精品| 国产精品女同一区二区软件| 国产免费又黄又爽又色| 国产成人91sexporn| a级毛色黄片| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 丰满乱子伦码专区| 国产日韩欧美亚洲二区| av播播在线观看一区| 男人和女人高潮做爰伦理| 看免费成人av毛片| 国产男女内射视频| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 日本av免费视频播放| 美女福利国产在线 | 午夜福利高清视频| 亚洲成人手机| 黄色配什么色好看| 免费大片18禁| 国产成人午夜福利电影在线观看| 亚洲av福利一区| 香蕉精品网在线| 边亲边吃奶的免费视频| 国产亚洲精品久久久com| 欧美激情国产日韩精品一区| 黑人猛操日本美女一级片| 又爽又黄a免费视频| 久久99蜜桃精品久久| 国产亚洲精品久久久com| 国产欧美亚洲国产| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜 | 亚洲伊人久久精品综合| 久热久热在线精品观看| 在线观看免费日韩欧美大片 | 99久久综合免费| 亚洲精品一二三| 国产一区亚洲一区在线观看| 国产乱人偷精品视频| 91aial.com中文字幕在线观看| 在线 av 中文字幕| 久久久久久久久久久免费av| 久久97久久精品| 欧美变态另类bdsm刘玥| 国产亚洲欧美精品永久| 国产高清三级在线| 少妇丰满av| 少妇人妻精品综合一区二区| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| videossex国产| 99国产精品免费福利视频| 高清av免费在线| 精品人妻一区二区三区麻豆| av国产免费在线观看| 亚洲人与动物交配视频| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 亚洲av免费高清在线观看| 成人免费观看视频高清| 久久青草综合色| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 亚洲精品国产av蜜桃| 只有这里有精品99| 国产美女午夜福利| 午夜福利高清视频| 丝袜脚勾引网站| 欧美区成人在线视频| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 97超碰精品成人国产| 高清av免费在线| 国产 一区 欧美 日韩| 国产一区二区三区av在线| 亚洲欧美一区二区三区国产| 亚洲精品aⅴ在线观看| 国模一区二区三区四区视频| 国产精品一区二区在线观看99| 黄色怎么调成土黄色| 免费看不卡的av| 一边亲一边摸免费视频| 国产日韩欧美亚洲二区| 日日撸夜夜添| 涩涩av久久男人的天堂| 亚洲av男天堂| 中文在线观看免费www的网站| 欧美日韩精品成人综合77777| 国产精品一二三区在线看| 男的添女的下面高潮视频| 美女cb高潮喷水在线观看| 黄色日韩在线| 嫩草影院入口| 夫妻性生交免费视频一级片| 毛片一级片免费看久久久久| 亚洲av二区三区四区| 91在线精品国自产拍蜜月| 国产又色又爽无遮挡免| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 国产色婷婷99| 国产男女内射视频| 久热这里只有精品99| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 亚洲美女搞黄在线观看| 一区二区av电影网| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 男女啪啪激烈高潮av片| 最近2019中文字幕mv第一页| 亚洲精品视频女| 简卡轻食公司| 男的添女的下面高潮视频| 男人和女人高潮做爰伦理| 在线天堂最新版资源| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 99精国产麻豆久久婷婷| 亚洲va在线va天堂va国产| 看十八女毛片水多多多| 久久韩国三级中文字幕| av福利片在线观看| 一区二区三区乱码不卡18| 成人免费观看视频高清| 美女内射精品一级片tv| 黑丝袜美女国产一区| 最近中文字幕高清免费大全6| 国产成人一区二区在线| 黄色怎么调成土黄色| 伦精品一区二区三区| 一级二级三级毛片免费看| 欧美变态另类bdsm刘玥| 国产精品精品国产色婷婷| 久久久欧美国产精品| 多毛熟女@视频| 免费人成在线观看视频色| xxx大片免费视频| 久久精品国产亚洲av天美| 中文天堂在线官网| av一本久久久久| 少妇丰满av| 一级毛片久久久久久久久女| 久久久久国产精品人妻一区二区| 欧美成人a在线观看| 免费黄频网站在线观看国产| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 久久久精品94久久精品| 热re99久久精品国产66热6| 全区人妻精品视频| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 男男h啪啪无遮挡| 秋霞伦理黄片| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 久久精品国产亚洲网站| 高清午夜精品一区二区三区| 免费大片18禁| 日韩欧美一区视频在线观看 | 国产一区二区三区av在线| 五月天丁香电影| 国产在线免费精品| 亚洲国产欧美人成| 又爽又黄a免费视频| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 成人无遮挡网站| 中文资源天堂在线| 精品午夜福利在线看| 中文字幕亚洲精品专区| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 老熟女久久久| 久久久久视频综合| a级一级毛片免费在线观看| 精品久久国产蜜桃| 亚洲精品一二三| 深爱激情五月婷婷| 亚洲国产日韩一区二区| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 网址你懂的国产日韩在线| 男男h啪啪无遮挡| 亚洲成人av在线免费| 国产在视频线精品| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 国产精品无大码| 香蕉精品网在线| 国内揄拍国产精品人妻在线| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 亚洲精品色激情综合| 精品一区二区三卡| 久久久久人妻精品一区果冻| 国产探花极品一区二区| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜 | a级毛片免费高清观看在线播放| 久久久精品免费免费高清| 久久ye,这里只有精品| 亚洲性久久影院| 久久97久久精品| 女性生殖器流出的白浆| 久久国内精品自在自线图片| 日韩av不卡免费在线播放| 人妻系列 视频| 亚洲欧美精品专区久久| 国产久久久一区二区三区| 国产成人免费观看mmmm| 美女中出高潮动态图| 91久久精品国产一区二区三区| 亚洲无线观看免费| 国精品久久久久久国模美| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 亚洲第一av免费看| 精品人妻视频免费看| 99久国产av精品国产电影| 性色avwww在线观看| 蜜桃在线观看..| 国产精品三级大全| 日韩一区二区三区影片| 日日啪夜夜撸| 少妇人妻精品综合一区二区| 亚洲av日韩在线播放| 大片免费播放器 马上看| 久热这里只有精品99| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 亚洲av综合色区一区| 亚洲精品视频女| 99热6这里只有精品| 制服丝袜香蕉在线| 我要看黄色一级片免费的| 成人亚洲精品一区在线观看 | 99久国产av精品国产电影| 久久女婷五月综合色啪小说| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 伦精品一区二区三区| 亚洲国产精品一区三区| 国产欧美日韩精品一区二区| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 91精品国产九色| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 春色校园在线视频观看| 国产av精品麻豆| 欧美成人a在线观看| 久久鲁丝午夜福利片| 久久综合国产亚洲精品| 少妇人妻 视频| 嘟嘟电影网在线观看| 在线观看免费日韩欧美大片 | 亚洲三级黄色毛片| 国产一区二区三区av在线| 最近的中文字幕免费完整| 制服丝袜香蕉在线| videossex国产| 麻豆成人av视频| 国产高清有码在线观看视频| 亚洲最大成人中文| av国产精品久久久久影院| 在线播放无遮挡| 伦理电影免费视频| 亚洲无线观看免费| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 美女中出高潮动态图| 久久久国产一区二区| 免费少妇av软件| 欧美精品国产亚洲| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 成人国产av品久久久| 黄色一级大片看看| 久久97久久精品| 久久久久久久久久久免费av| 嫩草影院入口| 国产av码专区亚洲av| 日韩免费高清中文字幕av| 亚洲国产高清在线一区二区三| 最后的刺客免费高清国语| 波野结衣二区三区在线| 午夜老司机福利剧场| 国产精品.久久久| 久久午夜福利片| 国产探花极品一区二区| 日本爱情动作片www.在线观看| www.av在线官网国产| 亚洲成人手机| 最近中文字幕2019免费版| 高清欧美精品videossex| 国产免费一级a男人的天堂| 乱系列少妇在线播放| 久久久久久九九精品二区国产| av不卡在线播放| 亚洲色图av天堂| 午夜激情久久久久久久| 欧美成人a在线观看| 在线播放无遮挡| 少妇的逼好多水| 高清毛片免费看| 国产伦理片在线播放av一区| 国国产精品蜜臀av免费| av视频免费观看在线观看| 伦理电影免费视频| 久久这里有精品视频免费| 亚洲av福利一区| 少妇的逼水好多| 久久久久人妻精品一区果冻| 亚洲无线观看免费| 91在线精品国自产拍蜜月| 精品少妇黑人巨大在线播放| 18禁在线播放成人免费| 国产精品99久久久久久久久| 黄色怎么调成土黄色| 在线播放无遮挡| 十分钟在线观看高清视频www | 亚洲欧美精品专区久久| 最近的中文字幕免费完整| 婷婷色麻豆天堂久久| 亚洲精品456在线播放app| 最新中文字幕久久久久| 欧美成人精品欧美一级黄| 日本色播在线视频| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 乱码一卡2卡4卡精品| av免费在线看不卡| av专区在线播放| 亚洲欧洲日产国产| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 青青草视频在线视频观看| 欧美+日韩+精品| 美女内射精品一级片tv| 免费观看在线日韩| 精品人妻熟女av久视频| 高清黄色对白视频在线免费看 | 成年av动漫网址| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 午夜免费观看性视频| 一级a做视频免费观看| 国产精品不卡视频一区二区| 精品少妇久久久久久888优播| h日本视频在线播放| 久久99热这里只频精品6学生| 欧美区成人在线视频| 97热精品久久久久久| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 久久精品久久久久久噜噜老黄| 亚洲不卡免费看| 色吧在线观看| 欧美97在线视频| av一本久久久久| 亚洲性久久影院| 在线观看美女被高潮喷水网站| 日本黄色日本黄色录像| 亚洲,一卡二卡三卡| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 亚洲综合精品二区| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 人妻少妇偷人精品九色| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 国产精品久久久久久精品古装| 少妇丰满av| 又爽又黄a免费视频| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 激情五月婷婷亚洲| 91狼人影院| 91精品国产国语对白视频| 亚洲中文av在线| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 插逼视频在线观看| 国产精品嫩草影院av在线观看| 久久精品人妻少妇| 免费看av在线观看网站| 少妇人妻 视频| 观看免费一级毛片| 夫妻午夜视频| 麻豆成人av视频| 91精品伊人久久大香线蕉| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 亚洲精品日本国产第一区| 午夜日本视频在线| 嘟嘟电影网在线观看| 日本vs欧美在线观看视频 | 91午夜精品亚洲一区二区三区| 精品人妻一区二区三区麻豆| 久久久久久久精品精品| 日韩一本色道免费dvd| 观看免费一级毛片| 久久6这里有精品| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 成人美女网站在线观看视频| 国产免费视频播放在线视频| 久久99精品国语久久久| 美女中出高潮动态图| videossex国产| 亚洲天堂av无毛| 国产在线男女| 高清欧美精品videossex| 少妇丰满av| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 国产片特级美女逼逼视频| 精品一区二区免费观看| 不卡视频在线观看欧美| 久久久久国产精品人妻一区二区| 亚洲精品色激情综合| 色综合色国产| 久久99热6这里只有精品| 亚洲内射少妇av|