烏賊墨多糖對(duì)環(huán)磷酰胺介導(dǎo)小鼠睪丸氧化應(yīng)激損傷的干預(yù)效應(yīng)

谷毅鵬 肖為 張?jiān)撇? 樂小炎 劉華忠 羅萍??

(1.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江 524088；2.廣東海洋大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣東湛江 524088；3.廣東海洋大學(xué)生物化學(xué)中心，廣東湛江 524088)お

摘要

［目的］ 探討烏賊墨多糖對(duì)環(huán)磷酰胺致小鼠睪丸氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用。［方法］ 隨機(jī)將70只成年雄性昆明小鼠分成7組：正常組、模型組、治療組1、治療組2、治療組3、治療組4和治療組5，通過對(duì)小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺進(jìn)行造模，灌胃烏賊墨多糖作為化療保護(hù)劑，檢測(cè)小鼠的體重、睪丸和附睪重量、睪丸指數(shù)和附睪指數(shù)、精子畸形率、睪丸中抗氧化指標(biāo)，同時(shí)觀察睪丸組織結(jié)構(gòu)。［結(jié)果］ 烏賊墨多糖能提高小鼠體重和睪丸重量，降低精子畸形率，提高睪丸組織中抗氧化酶SOD和CAT活性，降低MDA含量，修復(fù)睪丸病理學(xué)損傷。烏賊墨多糖明顯緩解環(huán)磷酰胺對(duì)睪丸的氧化損傷，其最佳灌胃劑量為80 mg/kg。［結(jié)論］ 烏賊墨多糖有可能作為臨床上的化療輔助藥物。

關(guān)鍵詞 烏賊墨多糖；環(huán)磷酰胺；小鼠；睪丸；抗氧化

中圖分類號(hào) SB917;RB282.77文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 0517-6611（2014）19-06275-04

Interventional Effects of Sepia Polysaccharide against Cyclophosphamide瞚nduced Oxidative Stress Injury to Testis of Mice

GU Yi瞤eng, LUO Ping et al

(School of Food Science & Technology, Guangdong Ocean University, Zhanjiang，Guangdong524088)

Abstract ［Objective］ The research aimed to discuss the protection effects of sepia polysaccharide on the cyclophosphamide瞚nduced oxidative stress injury to testis of mice. ［Method］ Seventy adult male Kunming mice were randomly divided into seven groups: normal group, model group , treatment groups Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ, Ⅴ. Mice in model group were administrated by using intraperitoneal injection. The sepia polysaccharide was used as chemoprotectant for intragastric administration. The body weight, the weight of testis and epididymis, testis index and epididymis index，abnormal sperm rate and antioxidant indices in testis were detected. And the histological structure of testis was observed. ［Result］ Sepia polysaccharide could enhance the body weight and testis weight，reduce the rate of abnormal sperm，increase the activities of SOD and CAT, decrease MDA content and restore the histopathological injury of testis. The best dosage of sepia polysaccharide for intragastric administration was 80 mg/kg. ［Conclusion］ Sepia polysaccharide might be used as the chemotherapy's adjunctive drug in the clinic.

Key words Sepia polysaccharide; Cyclophosphamide; Mice;Testis; Antioxidation

基金項(xiàng)目 國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（41306149，31171667）。

作者簡介 谷毅鵬（1987-），男，河南洛陽人，碩士研究生，研究方向：海洋生物活性物質(zhì)研究。*通訊作者，講師，碩士，從事天然產(chǎn)物與功能食品研究。

收稿日期 20140526

環(huán)磷酰胺(Cyclophosphamide，CP)是一類雙功能烷化劑，可有效治療多種惡性腫瘤，也可作為免疫抑制劑，用于器官移植、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和全身性紅斑狼癥等疾病的治療，是一種應(yīng)用非常廣泛的臨床藥物［1-3］。但是，環(huán)磷酰胺在抑制腫瘤細(xì)胞增殖的同時(shí)，也會(huì)影響正常細(xì)胞的增殖和分化［4］，從而產(chǎn)生較多毒副作用，對(duì)生殖系統(tǒng)特別是男性睪丸的毒性損傷就是其中之一。大量研究表明，腹腔注射環(huán)磷酰胺可明顯降低小鼠睪丸的生精功能［5］，破壞睪丸組織內(nèi)氧化-抗氧化系統(tǒng)的平衡，產(chǎn)生大量自由基以及氧化產(chǎn)物，造成睪丸氧化應(yīng)激損傷［6］。烏賊墨多糖（Squid ink polysaccharide，SIP）提取自海洋活性物質(zhì)烏賊墨，是一種高效、無毒、廣譜類細(xì)胞保護(hù)劑，具有抗氧化［7］、抗腫瘤［8］、抗化療［9］、增強(qiáng)免疫［10-11］等生物學(xué)活性。近年來，樂小炎等發(fā)現(xiàn)烏賊墨多糖對(duì)化療藥物環(huán)磷酰胺造成的毒性損傷具有較強(qiáng)的緩解能力，其中對(duì)環(huán)磷酰胺所致的雄性生殖損傷改善作用也非常明顯［12-13］。筆者從烏賊墨多糖緩解環(huán)磷酰胺所致小鼠睪丸氧化損傷的角度來研究烏賊墨多糖對(duì)環(huán)磷酰胺致小鼠睪丸氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用，為臨床上開發(fā)化療的輔助藥物提供一定理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

清潔級(jí)昆明小鼠70只，雄性，6周齡，購自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證編號(hào)為0006318，在廣東海洋大學(xué)生化中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.1.2

主要試劑。烏賊墨多糖由實(shí)驗(yàn)室自制［13-14］。

注射用環(huán)磷酰胺（CP），購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；考馬斯亮藍(lán)蛋白定量測(cè)試盒、總超氧化物歧化酶（T睸OD）測(cè)試盒、丙二醛（MDA）測(cè)試盒和過氧化氫酶（CAT）測(cè)試盒，均購自南京建成生物工程研究所；其他試劑均為分析純。

1.1.3

主要儀器。HH6型數(shù)顯電子恒溫水浴鍋；KDC160HR型高速冷凍離心機(jī)；FDU1100型真空冷凍干燥機(jī)；UV2800AH型紫外可見分光光度；N1000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；JY92并蛐統(tǒng)聲波細(xì)胞粉碎機(jī)；BX51型多功能顯微鏡。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理及體重測(cè)定。

取70只雄性昆明小鼠隨機(jī)分成5組：對(duì)照組（A）、模型組（B）、治療組1（C）、治療組2（D）、治療組3（E）、治療組4（F）和治療組5（G），每組10只。治療組每天灌胃烏賊墨多糖，C、D、E、F和G各組用量分別為25、40 、60 、80 、100 mg/(kg·d)； 對(duì)照組和模型組動(dòng)物按同樣方法每天給予等量生理鹽水；灌胃至第7天，模型組和治療組小鼠需腹腔注射環(huán)磷酰胺，劑量為120 mg/kg，對(duì)照組腹腔注射等量生理鹽水；各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均連續(xù)處理14 d，每隔1 d稱1次體重。

1.2.2

生殖器官指數(shù)的測(cè)定。在末次給藥24 h后，稱量小鼠體重，然后脫頸椎處死，取雙側(cè)睪丸和附睪，迅速清除組織周圍脂肪并稱重。按照以下公式計(jì)算小鼠睪丸和附睪指數(shù)：生殖器官指數(shù)（睪丸/附睪）=每只小鼠生殖器官（睪丸/附睪）重量/每只小鼠體重×100%。

1.2.3

精子畸形率的測(cè)定。

將含有1 ml 0.9%生理鹽水的離心管置于37 ℃水浴鍋中預(yù)熱，取單側(cè)附睪縱向剪成3段，放入離心管中輕輕搖動(dòng)，37 ℃下溫育5~10 min，使精子充分游出，然后吸取此精子懸液10 μl滴于潔凈載玻片一端，均勻推片，待玻片晾干后用甲醇固定5 min以上，再次晾干后用1%伊紅染色1 h，用水輕沖，干燥，在顯微鏡下觀察精子畸┬溫?。?/p>

1.2.4

睪丸組織的病理學(xué)檢測(cè)。

取睪丸組織，用10%的甲醛溶液固定，梯度乙醇脫水，常規(guī)石蠟包埋，5 μm切片，HE染色，在顯微鏡下觀察睪丸組織結(jié)構(gòu)變化。

1.2.5

睪丸抗氧化指標(biāo)的測(cè)定。

取一側(cè)睪丸，加生理鹽水，冰上研磨，制成10%組織勻漿，3 000 r/min離心，取上清。按照試劑盒說明書，采用比色法測(cè)定睪丸組織中超氧化物歧化酶（SOD）活性、過氧化氫酶（CAT）活性以及丙二醛（MDA）┖量。

1.2.6

數(shù)據(jù)處理。使用SAS公司開發(fā)的JMP7.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 體重變化

從圖1可以看出，在注射環(huán)磷酰胺前，各組小鼠體重變化并無顯著差異（玃>0.05），均呈上升趨勢(shì)；注射環(huán)磷酰胺后，模型組和治療組1、2的小鼠體重總體均處于下降趨勢(shì)，治療組3的動(dòng)物體重先下降，但第11天后開始上升，對(duì)照組和治療組4、5體重一直處于上升狀態(tài)；各組小鼠體重從13天開始出現(xiàn)明顯差異，第15天模型組同對(duì)照組相比體重顯著降低（玃<0.01），與模型組相比，治療組3、4、5小鼠體重均明顯增高，差異極顯著（玃<0.01）。這說明烏賊墨多糖可有效緩解環(huán)磷酰胺對(duì)雄性小鼠體重的影響，恢復(fù)體重的最小灌胃劑量是60 mg/kg。

2.2 生殖器官指標(biāo)

由表1可知，與對(duì)照組相比，模型組小鼠睪丸重量明顯降低，差異顯著（玃<0.05），睪丸指數(shù)也有所降低，但差異并不顯著（玃>0.05），附睪重量和附睪指數(shù)也均無明顯差異（玃>0.05），表明環(huán)磷酰胺對(duì)小鼠的睪丸重量有較強(qiáng)抑制作用；與模型組相比，治療組4、5小鼠經(jīng)SIP灌胃后睪丸指數(shù)顯著增高（玃<0.05），而治療組各組附睪重量和附睪指數(shù)的也均無明顯變化（玃>0.05）。這說明烏賊墨多糖主

注：不同小寫字母表示差異顯著（玃<0.05）；不同大寫字母表示差異極顯著（玃<0.01）。A.對(duì)照組；B.模型組；C.治療組1；D.治療組2；E.治療組3；F.治療組4；G.治療組5。

圖1 各組試驗(yàn)小鼠體重的變化

要緩解環(huán)磷酰胺對(duì)雄性小鼠睪丸重量的影響，其最小灌胃劑量為80 mg/kg。

表1 各組小鼠生殖器官指標(biāo)的變化(玭=10，x±s)

組別 睪丸重量mg 睪丸指數(shù)mg/g 附睪重量mg 附睪指數(shù)mg/g

對(duì)照組 22.23±2.40a 6.63±0.30 55.25±3.42 1.59±0.14

模型組 17.94±2.87b 6.19±0.62 52.67±5.59 1.54±0.15

治療組1 18.21±2.72ab 6.27±0.69 53.78±5.96 1.58±0.13

治療組2 19.49±1.30ab 6.32±0.74 52.10±4.76 1.59±0.17

治療組3 20.03±2.68ab 6.41±0.82 54.70±5.45 1.59±0.20

治療組4 21.94±1.83a 6.58±0.73 52.88±3.75 1.56±0.17

治療組5 21.70±1.59a 6.52±0.78 56.50±6.15 1.59±0.12

注：同列不同小寫字母表示差異顯著（玃<0.05）。

2.3 精子畸形率

由表2可知，模型組小鼠精子畸形率明顯高于對(duì)照組（玃<0.01），精子畸形類型主要為頭部畸形，其中無鉤、胖頭及香蕉頭所占比例較高，說明精子在發(fā)育過程中頭部更容易受環(huán)磷酰胺的毒害，誘發(fā)畸變；與模型組相比，治療組2、3精子畸形率明顯降低（玃<0.05），隨著烏賊墨多糖灌胃劑量的增加，治療組4、5精子畸形率大大降低（玃<0.01），緩解環(huán)磷酰胺對(duì)小鼠精子損傷的最低灌胃劑量為40 mg/kg。

表2各組小鼠精子畸形率的變化(玭=10，x±s)

組別

各類畸形精子數(shù)

無鉤 無定形 香蕉頭 胖頭 尾折疊 其他 總計(jì) 畸形率%

對(duì)照組 88.70 57.98 8.93 16.02 1.56 2.94 176.13 8.81±0.92Bb

模型組 128.62 101.69 16.39 21.96 3.33 4.54 276.54 13.83±2.04Aa

治療組1 102.42 81.78 13.54 19.68 1.01 2.51 220.95 11.05±1.85 ABab

治療組2 96.09 63.55 11.22 16.05 2.14 3.36 192.40 9.62±2.39 Bb

治療組3 112.66 64.26 11.33 20.41 0.96 2.87 212.50 10.62±1.14 ABb

治療組4 80.74 69.37 11.70 15.62 1.57 2.90 181.90 9.09±2.17 Bb

治療組5 87.82 65.44 7.63 15.57 1.18 2.23 179.87 8.99±2.71 Bb

注：各組檢測(cè)小鼠精子總數(shù)均為2000。同列不同小寫字母表示差異顯著（玃<0.05）；同列不同大寫字母表示差異極顯著（玃<0.01）。

2.4 睪丸形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

從圖2可以看出，正常組（A）小鼠睪丸曲細(xì)精管上皮厚，細(xì)胞層數(shù)多，生精細(xì)胞排列緊密且規(guī)則，間質(zhì)稀少，血管豐富；模型組（B）曲細(xì)精管明顯變薄，管腔內(nèi)空洞化，細(xì)胞層數(shù)減少，內(nèi)部生精細(xì)胞少且排列松散紊亂，間質(zhì)明顯有較大空隙，血管稀少；治療組1（C）曲細(xì)精管厚度有所增加，但管腔內(nèi)仍有明顯空洞化，間質(zhì)變??；治療組2（D）曲細(xì)精管細(xì)胞層數(shù)增加，管腔內(nèi)空洞化明顯減少，但生精細(xì)胞數(shù)較少，間質(zhì)空隙少；治療組3（E）曲細(xì)精管無空洞化，精管上皮層厚，生精細(xì)胞數(shù)目較多，間質(zhì)少；治療組4（F）和治療組5（G）睪丸在光鏡下與正常組基本相同，曲細(xì)小管管壁厚，細(xì)胞層較寬，生精細(xì)胞豐富且排列規(guī)則，間質(zhì)稀少，血管豐富。由此可見，烏賊墨多糖可恢復(fù)環(huán)磷酰胺對(duì)睪丸組織造成的病理損傷，當(dāng)灌胃劑量大于60 mg/kg時(shí)可明顯減少曲細(xì)精管空洞化，減少間質(zhì)，提高生精細(xì)胞數(shù)目。

注：A.對(duì)照組;B.模型組;C.治療組1;D.治療組2;E.治療組3;F.治療組4；G.治療組5。

圖2各組小鼠睪丸組織切片觀察

2.5 抗氧化指標(biāo)

由表3可知，模型組小鼠注射環(huán)磷酰胺后，與對(duì)照組相比，睪丸組織中抗氧化酶SOD和CAT活力均顯著降低（玃＜0.01），MDA含量明顯升高（玃＜0.05）；治療組小鼠隨著烏賊墨多糖灌胃劑量的增加，睪丸中SOD和CAT活性不斷增高，而MDA含量不斷降低。其中，與模型組相比，治療組2、3、4、5睪丸中SOD活性均顯著恢復(fù)（玃＜0.01）；而CAT活性從治療組3開始明顯恢復(fù)（玃＜0.05），治療組5已恢復(fù)至正常組水平（玃＜0.01）；治療組4和5小鼠睪丸組織中MDA含量也均明顯降低（玃＜0.05）。這表明烏賊墨多糖可顯著緩解環(huán)磷酰胺對(duì)小鼠睪丸組織造成的氧化損傷，提高睪丸組織中SOD和CAT活性，降低MDA含量，提高整體抗氧化能力的最佳灌胃劑量為80 mg/kg。

お

表3 各組小鼠睪丸組織中抗氧化指標(biāo)（玭=10，x±s)

組別 SOD活性U/mg CAT活性U/mg MDA含量nmol/mg

對(duì)照組 110.94±12.58Aa 14.75±1.15Aa 3.23±1.30b

模型組 72.64±8.14Bc 11.63±1.15Bb 5.71±2.62a

治療組1 84.84±7.56ABbc 12.77±1.04ABab 4.14±1.17ab

治療組2 95.09±6.77Aab 13.49±0.49ABab 3.64±1.13ab

治療組3 101.67±12.98Aab 14.17±1.96ABa 3.52±1.26ab

治療組4 103.70±7.08Aab 14.08±1.12ABa 3.38±1.06b

治療組5 102.57±10.26Aab 14.46±2.21Aa 3.37±1.06b

注：同列不同小寫字母表示差異顯著（玃<0.05）；同列不同大寫字母表示差異極顯著（玃<0.01）。

3 小結(jié)

環(huán)磷酰胺是臨床上應(yīng)用十分廣泛的化療藥物，毒副作用強(qiáng)，會(huì)導(dǎo)致生殖不育或遺傳毒害。大量研究表明，環(huán)磷酰胺主要作用于細(xì)胞快速分裂增殖的組織，而睪丸就是其中的靶器官之一，該藥可對(duì)DNA產(chǎn)生烷化作用，從而干擾細(xì)胞內(nèi)的多種生物學(xué)功能，致使生精細(xì)胞凋亡，睪丸染色體畸變，睪丸萎縮，造成生育能力降低以及子代遺傳性缺陷等［15-17］。該研究結(jié)果表明環(huán)磷酰胺可導(dǎo)致小鼠的體重減輕，睪丸萎縮，精子大量畸形，曲細(xì)精管空洞化，生精細(xì)胞數(shù)量減少，間質(zhì)細(xì)胞破壞嚴(yán)重，睪丸組織中抗氧化酶SOD和CAT活性明顯降低，MDA含量過度積累，造成睪丸組織嚴(yán)重氧化損傷。

烏賊墨多糖作為一種較強(qiáng)抗氧化能力的海洋活性物質(zhì)［18］，能較大范圍內(nèi)有效弱化化療藥物對(duì)機(jī)體組織產(chǎn)生的氧化性損傷，如造血系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、腎、肝、肺、腦等［13,19-22］，通過提高這些組織器官的抗氧化能力，從而減弱化療藥物的毒副作用。該研究結(jié)果表明烏賊墨多糖可以緩解化療藥物環(huán)磷酰胺造成的睪丸氧化損傷，主要表現(xiàn)在以下方面：①提高生精功能，最直接的表現(xiàn)是修復(fù)睪丸組織的病理學(xué)損傷，防止睪丸萎縮，提高生精細(xì)胞數(shù)目，降低畸形率；②提高組織抗氧化能力，SOD和CAT是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化酶，而MDA含量反映組織細(xì)胞膜質(zhì)的過氧化程度，烏賊墨多糖可通過提高睪丸中SOD和CAT活性以及降低MDA的含量，有效清除組織內(nèi)積累的過量自由基，避免睪丸的氧化損傷；③提高機(jī)體免疫能力，降低環(huán)磷酰胺對(duì)免疫系統(tǒng)的抑制作用，從而避免小鼠體重以及睪丸重量的下降，間接發(fā)揮保護(hù)作用。綜上所述，烏賊墨多糖有效緩解環(huán)磷酰胺對(duì)睪丸組織氧化損傷的最佳灌胃劑量為80 mg/kg。據(jù)此推測(cè)，烏賊墨多糖可以作為臨床上的化療輔助藥物，用于病人在化療后的康復(fù)治療，同時(shí)對(duì)擴(kuò)大藥源以及海洋資源的充分開發(fā)和利用均具有重大意義。

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