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    重組敬釗毒素在畢赤酵母中的表達(dá)與純化研究

    2014-04-29 15:56:49蔣倩倩李慧玲劉莉莉高寧程玉鵬
    安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2014年19期
    關(guān)鍵詞:基因工程

    蔣倩倩 李慧玲 劉莉莉 高寧 程玉鵬

    (黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150040)お

    摘要

    [目的]研究重組敬釗毒素在畢赤酵母中的表達(dá)與純化。[方法]通過設(shè)計(jì)、構(gòu)建Jztx-III/pPIC9k表達(dá)載體,經(jīng)電轉(zhuǎn)化、甲醇誘導(dǎo)后使敬釗毒素在畢赤酵母GS115中進(jìn)行表達(dá),并利用C-端6×His標(biāo)簽進(jìn)行分離純化。[結(jié)果]Jztx-III可以在畢赤酵母GS115中高效表達(dá),經(jīng)親和層析純化后其產(chǎn)量可達(dá)到95 mg/L。[結(jié)論]該試驗(yàn)結(jié)果解決了敬釗毒素資源有限產(chǎn)量較低的問題。

    關(guān)鍵詞 蜘蛛毒素;畢赤酵母;基因工程

    中圖分類號(hào) SB188文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 0517-6611(2014)19-06166-01

    The Expression and Purification of Jingzhao Toxin in 玃ichia pastoris

    JIANG Qian瞦ian, CHENG Yu瞤eng et al

    (College of Pharmacy, Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin, Heilongjiang 150040)

    Abstract [Objective] To study expression and purification of Jingzhao toxin in 玃ichia pastoris. [Method] Jztx睮II GS115/pPIC9k plasmid was constructed to express Jingzhao toxin睮II in 玃ichia pastoris. A 6×His tag in C瞭erminus was employed to purify the recombinant Jztx 睮II. [Result] The results showed that Jztx 睮II can be expressed in 玃ichia pastoris 獹S115 effectively. The production of Jztx 睮II can reach to 95 mg/L after purified by affinity chromatography. [Conclusion] The experiment results solve the problem of lower yield of Jingzhao toxin limited resource.

    Key wordsSpider toxin; 玃ichia pastoris; Genetic engineering

    基金項(xiàng)目 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)?;穑?01004);黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)優(yōu)秀創(chuàng)新人才支持計(jì)劃(2012RCQ12)。

    作者簡介

    蔣倩倩(1981-),女,黑龍江哈爾濱人,講師,碩士,從事生物制藥研究。*通訊作者,副教授,博士,從事生物制藥┭芯?。?/p>

    收稿日期 20140604

    蜘蛛毒素成分復(fù)雜,由一系列蛋白質(zhì)、多肽、神經(jīng)毒素、核酸、氨基酸、無機(jī)鹽組成,這些成分可以對脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物產(chǎn)生不同的生物學(xué)效應(yīng)[1]。根據(jù)蜘蛛毒素的藥理和生物化學(xué)特性,蜘蛛毒素可以分為離子通道毒素、非神經(jīng)毒素、酶及低分子量化合物[2]。

    敬釗毒素-III (Jztx-III,分子量3 919.3 Da)是從中國狼蛛敬釗纓毛蛛中分離的小分子多肽,由36個(gè)氨基酸組成且分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜,其內(nèi)部含有3個(gè)交錯(cuò)的二硫鍵分別是:I-IV, II-V和 III-VI (Cys4-Cys19, Cys11-Cys24, and Cys18-Cys31)[3]。這種毒素專一作用于鉀離子電壓門控通道Kv2.1和鈉離子電壓門控通道Nav1.5,而對其他亞型的電壓通道無作用。正是由于其對電壓離子通道的特異性及獨(dú)特的分子機(jī)制,使得Jztx-III成為研究電壓敏感型毒素和離子通道相互作用的理想工具。但是由于敬釗毒素來源有限且含量低,限制了其在研究和醫(yī)療上的應(yīng)用,因此研究開發(fā)蜘蛛毒素合成方法降低生產(chǎn)成本是目前亟待解決的問題?;蚬こ淌巧a(chǎn)生物活性肽的理想途徑,但目前對于重組Jztx-III多肽的表達(dá)的研究鮮有報(bào)道。筆者通過設(shè)計(jì)構(gòu)建pPIC9k/Jztx-III表達(dá)載體,在畢赤酵母中表達(dá)重組敬釗毒素-III并利用其C-端6×His標(biāo)簽進(jìn)行分離純化,以期為蜘蛛毒素的藥物開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

    1材料與方法

    1.1 材料

    表達(dá)載體 pPIC9k、獷. coli 獼M109、畢赤酵母GS115菌株,均由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)生物技術(shù)教研室保存。

    1.2 Jztx-III的基因設(shè)計(jì)與合成

    根據(jù)敬釗毒素-III全長基因序列及畢赤酵母偏愛密碼子對其進(jìn)行全基因合成,5端添加EcoRⅠ位點(diǎn),3端添加NotⅠ位點(diǎn),同時(shí)在3端添加編碼6×His的分離純化標(biāo)簽,該基因合成由上海生工完成。

    1.3 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

    用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ和Not Ⅰ雙酶切pPIC9k載體,以T4連接酶將合成的JZTX-III基因與載體連接,16 ℃連接12 h,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞JM109中。挑出單菌落,進(jìn)行雙酶切鑒定,并送往上海生工進(jìn)行測序。

    1.4 pPIC9k/Jztx-III電轉(zhuǎn)化畢赤酵母

    用SacⅠ酶切重組表達(dá)質(zhì)粒 pPIC9k/JZTX-III使之線性化,電擊轉(zhuǎn)化至畢赤酵母菌GS115,轉(zhuǎn)化菌液涂布 RDB平板,30 ℃培養(yǎng) 72 h,挑取單克隆,在MD平板上篩選His+表型,分別接種于G418的YPD培養(yǎng)基平板上,篩選多拷貝轉(zhuǎn)化子,對陽性重組子進(jìn)行PCR鑒定。

    1.5 Jztx-III的誘導(dǎo)表達(dá)

    挑選陽性菌落,置于BMGY培養(yǎng)基中,每24 h向培養(yǎng)基中添加100%甲醇至終濃度為0.5%~1.0%。用15% Trincine-SDS-PAGE 檢測JZTX-III表達(dá)情況。

    1.6 Jztx-III的分離純化

    菌體發(fā)酵離心所獲得上清,經(jīng)Millipore 超濾管濃縮除鹽,利用High Affinity Ni-NTA Resin(南京金斯瑞)進(jìn)行親和層析。洗脫產(chǎn)物由15% Trincine-SDS-PAGE檢測。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 pPIC9k/Jztx-III表達(dá)載體構(gòu)建

    根據(jù)敬釗毒素-III全長基因序列并依據(jù)畢赤酵母偏愛密碼子設(shè)計(jì)合成敬釗毒素-III的全長DNA序列,與表達(dá)載體pPIC9k連接后,經(jīng)EcoR I和Not I雙酶切及測序結(jié)果表明片段大小及序列與pPIC9k及Jztx-III大小相符。

    2.2 pPIC9k/Jztx-III陽性轉(zhuǎn)化子的鑒定

    pPIC9k/Jztx-III經(jīng)SacⅠ酶線性化后,電轉(zhuǎn)化至畢赤酵母菌GS115,并經(jīng)MD

    平板、G418平板篩選獲得了多拷貝轉(zhuǎn)化子。選取其中8株His+陽性重組子進(jìn)行PCR鑒定(圖1)。經(jīng)過PCR擴(kuò)增后獲得2個(gè)片段,分別為2.2 kb的AOX基因和642 bp(Jztx-III+492kb側(cè)翼序列)片段,證明Jztx-III已經(jīng)整合入GS115基因組。

    圖1pPIC9k/Jztx-III陽性轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定結(jié)果

    2.3 重組Jztx-III的分離純化

    含有pPIC9k/Jztx-III的陽性菌落在BMGY培養(yǎng)基培養(yǎng)并甲醇誘導(dǎo)72 h后產(chǎn)量達(dá)到最高,利用High Affinity Ni-NTA Resin進(jìn)行親和層析,樣品經(jīng)洗脫液洗脫后,15% Tricine-SDS-PAGE檢測(圖2),結(jié)果顯示,經(jīng)純化后獲得分子量為5 kD左右的多肽,該分子量與敬釗毒素-3理論值3.9 kD加0.84 kD的6×His標(biāo)簽相符。經(jīng)BCA法檢測發(fā)現(xiàn),Jztx-III濃度可達(dá)到95 mg/L。

    圖2 Tricine-SDS-PAGE 檢測純化的Jztx-III

    3 結(jié)論與討論

    蜘蛛毒素為富含二硫鍵的多肽,其分子量小、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、體外的折疊效率比較低,因此很難通過化學(xué)合成的方法復(fù)現(xiàn)其功能區(qū)。采用基因工程方法,在體內(nèi)進(jìn)行蜘蛛毒素的合成是一條理想的途徑。試驗(yàn)選擇巴斯德畢赤酵母作為Jztx-III

    的表達(dá)體系,其優(yōu)勢在于酵母表達(dá)系統(tǒng)是具有高效分泌的真核表達(dá)系統(tǒng),可對目的蛋白進(jìn)行翻譯后修飾,幫助敬釗毒素形成正確結(jié)構(gòu)。同時(shí),為了進(jìn)一步提高Jztx-III的表達(dá)量,試驗(yàn)根據(jù)畢赤酵母偏愛密碼子對Jztx-III基因進(jìn)行了優(yōu)化設(shè)計(jì),并在其C-端添加了6×His標(biāo)簽,構(gòu)建了pPIC9k/Jztx-III表達(dá)載體,該標(biāo)簽的加入有利于表達(dá)后的分離純化且不對多肽的活性有影響。經(jīng)電轉(zhuǎn)化、甲醇誘導(dǎo)、High Affinity Ni-NTA純化后,Jztx-III可以成功在畢赤酵母GS115中表達(dá),產(chǎn)量達(dá)到95 mg/L,實(shí)現(xiàn)了Jztx-III在畢赤酵母中得高效表達(dá)。而對于重組Jztx-III的生物學(xué)活性,有待于進(jìn)一步┭芯?。?/p>

    參考文獻(xiàn)

    [1] ORI M,IKEDA H.Spider venoms and spider toxins[J].Journal of Toxicology-Toxin Reviews,1998,17(3):405-426.

    [2] RASH L D,HODGSON W C.Pharmacology and biochemistry of spider venoms[J].Toxicon,2001,40(3):225-254.

    [3] XIAO Y C,TANG J Z,YANG Y J,et al.Jingzhaotox瞚n睮II,a novel spider toxin inhibiting activation of voltage瞘ated sodium channel in rat cardiac myocytes[J].J Biol Chem,2004,279(25):26220-26226.

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