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    綬草高頻再生體系建立的研究

    2014-04-29 15:56:49李慧玲蔣倩倩劉莉莉高寧程玉鵬
    安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2014年19期
    關(guān)鍵詞:誘導(dǎo)

    李慧玲 蔣倩倩 劉莉莉 高寧 程玉鵬

    (黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150040)お

    摘要

    [目的]建立綬草高頻再生體系。[方法]以野生綬草的花序軸為外植體,對外植體進(jìn)行消毒和預(yù)培養(yǎng)后,以MS為基本培養(yǎng)基,添加不同濃度的6睟A篩選最適誘導(dǎo)培養(yǎng)基;以MS為基本培養(yǎng)基,添加不同濃度6睟A和IAA篩選最適增殖培養(yǎng)基;以1/2 MS為基本培養(yǎng)基,添加不同濃度NAA篩選最適生根培養(yǎng)基。[結(jié)果]最適誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6睟A2.0,最適增殖培養(yǎng)基為MS+6睟A1.5+IAA0.4,最適生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA1.5。[結(jié)論]該研究對綬草優(yōu)良品種的改良和次級代謝產(chǎn)物研究有重要意義。

    關(guān)鍵詞 綬草;再生體系;誘導(dǎo)

    中圖分類號 SB188文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A文章編號 0517-6611(2014)19-06162-01

    On Establishing a High Frequency Regeneration System of 玈piranthes sinensis

    LI Hui瞝ing, CHENG Yu瞤eng et al

    (College of Pharmacy, Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin, Heilongjiang 150040)

    Abstract [Objective] To establish a high frequency regeneration system of 玈piranthes sinensis. [Method] With rachis of wild 玈piranthes sinensis 玜s explant, disinfection and preculture was conducted. With MS as basic medium, adding different concentration 6睟A, the optimum induction medium was obtained; with MS as basic medium, adding different concentration 6睟A and IAA, the optimum proliferation medium was selected; with 1/2 MS as basic medium, add different concentration NAA for screen out the optimal rooting medium. [Result] The optimum medium for induction is MS+6睟A 2.0; the optimum medium for proliferation is MS+6睟A 1.5+IAA 0.4 and 1/2 MS+NAA 1.5 is the best rooting medium. [Conclusion] The study has significance for improvement and secondary metatolites research of 玈piranthes sinensis 玣ine cultivar.

    Key wordsSpiranthes sinensis; Regeneration system; Induction

    基金項(xiàng)目 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)校基金(200710)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)?;穑?01004);黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)優(yōu)秀創(chuàng)新人才支持計(jì)劃(2012RCQ13)。

    作者簡介

    李慧玲(1979-),女,黑龍江北安人,碩士,講師,從事環(huán)境微生物和生物藥物研究。*通訊作者,博士,副教授,從事生物制藥研究。

    收稿日期 20140526

    綬草(玈piranthes sinensis)屬于蘭科綬草屬植物,別名盤龍參、龍抱柱、豬鞭草等,原國家林業(yè)部頒布的《野生植物保護(hù)名錄》中將其列為二級保護(hù)植物,現(xiàn)已列入《瀕危野生動植物種國際貿(mào)易公約》[1]。綬草生長于海拔400~3 200 m的山坡林下或草地,廣泛分布于我國各省區(qū)。綬草根或全草入藥,具有滋陰益氣、補(bǔ)腎壯陽、涼血解毒、潤肺止咳、消炎解毒、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕之功效。用于病后氣血兩虛、少氣無力、陰虛內(nèi)熱、神經(jīng)衰弱、肺結(jié)核咯血、小兒季熱、糖尿病、遺精、頭暈、失眠等癥狀[2]。

    綬草中已經(jīng)報(bào)道分離出多種化合物:黃酮類化合物spirathetin并瘛阿魏酸酯如阿魏酸二十八醇酯(octaco瞫ylferulate)、二氫菲類衍生物和甾醇類等[3-5]。其中阿魏酸二十八醇酯已被證實(shí)具有抗腫瘤的作用[3],二氫菲類衍生物可能具抗乙肝病毒和抗SARS病毒的作用[6]。由于綬草植株瘦小、野生資源較少、有效成分很難提取和富集,這些都限制綬草藥用價(jià)值的進(jìn)一步開發(fā)。因此,建立綬草高頻再生體系,對其優(yōu)良品種的改良和次級代謝產(chǎn)物的研究具有重要意義。

    1材料與方法

    1.1材料

    以黑龍江鏡泊湖綬草為材料,取其花序軸為外植體。

    1.2 方法

    1.2.1

    外植體消毒和預(yù)培養(yǎng)。將花序軸剪去小苞葉后用流水沖洗15 min,然后用75%乙醇消毒30 s,無菌水沖洗4~5次。利用0.1%的氯化汞消毒3、5、7和10 min,用無菌水沖洗4~5次,將花序軸剪成1~2 cm小段接種于MS培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)。每個(gè)處理接種30個(gè)外植體,培養(yǎng)25 d,統(tǒng)計(jì)污染率、死亡率和成活率。

    1.2.2

    外植體的誘導(dǎo)培養(yǎng)。將預(yù)培養(yǎng)后生長良好的外植體接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基,誘導(dǎo)培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基,添加不同濃度的6睟A(0.2、0.6、1.0、1.5、2.0、3.0 mg/L),每種培養(yǎng)基接種30個(gè)外植體。

    1.2.3

    誘導(dǎo)芽的增殖培養(yǎng)。將誘導(dǎo)產(chǎn)生的芽接種于增殖培養(yǎng)基,增殖培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基,添加不同濃度的6睟A(0.6、1.0、1.5、3.0 mg/L)和IAA(0、0.2、0.4、0.6 ﹎g/L)。每種培養(yǎng)基接種30個(gè)誘導(dǎo)芽。

    1.2.4

    誘導(dǎo)芽的生根培養(yǎng)。

    將2 cm以上的芽接種于生根培養(yǎng)基中,以1/2 MS為基本培養(yǎng)基,添加不同濃度的NAA(0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L),每種培養(yǎng)基接種30個(gè)芽。

    1.3 培養(yǎng)條件

    培養(yǎng)基添加蔗糖30 g/L,瓊脂7 g/L,pH值為5.8,培養(yǎng)溫度25 ℃,光照2 000 lx,每天12 h光照/12 h┖詘怠*

    2 結(jié)果與分析

    2.1 不同消毒方法對預(yù)培養(yǎng)的影響

    外植體培養(yǎng)25 d后,消毒結(jié)果如表1所示,0.1%的氯化汞消毒效果隨滅菌時(shí)間的增加而加強(qiáng),外植體消毒10 min污染率為0,消毒7 min外植體出現(xiàn)枯死,消毒10 min枯死數(shù)量明顯增加。鑒于外植體在消毒7 min時(shí),污染和死亡較少,成活率也較高,所以0.1%氯化汞消毒7 min效果較好。

    2.2 最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基的選擇

    外植體接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基15~18 d后,誘導(dǎo)芽生長情況如表2所示,6睟A濃度在0.2 mg/L時(shí)沒有分化芽;當(dāng)濃度達(dá)到0.6 mg/L時(shí)開始分化芽,但是數(shù)量較少;隨著6睟A濃度的升高芽誘導(dǎo)率增加,當(dāng)6睟A濃B度B達(dá)B到2.0 mg/L時(shí)芽誘導(dǎo)率達(dá)83.3%。因B此外B植體B接種于培養(yǎng)基MS+6睟A2.0最適宜芽的誘導(dǎo)。

    表1 外植體的消毒處理

    消毒時(shí)間∥min 接種數(shù)∥個(gè) 污染率∥%死亡率∥%成活率∥%

    3 30 75 0 25

    5 30 34 0 66

    7 30 10 13 77

    10 30 0 48 52

    表2 外植體的芽誘導(dǎo)率

    6睟A濃度∥mg/L 接種數(shù)∥個(gè) 形成芽∥個(gè)芽誘導(dǎo)率∥%

    0.2 30 0 0

    0.6 30 2 6.7

    1.0 30 15 50

    1.5 30 18 60

    2.0 30 25 83.3

    2.3 最佳增殖培養(yǎng)基的選擇

    誘導(dǎo)芽在增殖培養(yǎng)基中生長4~5周后的芽增殖倍數(shù)結(jié)果見表3。表3表明,6睟A濃度為1.5 mg/L時(shí)芽的增殖倍數(shù)高于6睟A其他試驗(yàn)組,培養(yǎng)基中添加1.5 mg/L的6睟A和0.4 mg/L的IAA時(shí)芽增殖倍數(shù)最高,因此最佳增殖培養(yǎng)基是MS+6睟A1.5+IAA0.4。

    表3 不同培養(yǎng)基的芽增殖倍數(shù)

    IAA濃度mg/L 6睟A濃度∥mg/L

    0.6 1.0 1.5 3.0

    0 2.4 2.7 3.3 1.2

    0.2 1.7 2.9 4.6 1.5

    0.4 1.3 3.2 4.7 1.8

    0.6 1.1 2.1 4.1 2.3

    2.4 最佳誘導(dǎo)生根培養(yǎng)基的選擇

    增殖后的芽轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)15~17 d開始生根,3周以后觀察生根情況。結(jié)果表明,NAA濃度是1.5 mg/L時(shí)生根率較高,所以最佳生根培養(yǎng)基是1/2MS+NAA1.5。

    2.5 煉苗和移栽

    組培苗生長到4~6 cm時(shí),生根3~4條進(jìn)行煉苗,打開培養(yǎng)瓶蓋2~3 d,取出試管苗用水沖洗干凈,洗去根部殘留的培養(yǎng)基,移栽到草炭與蛭石(2∶1)中,注意保持適宜的濕度和遮陰,每周噴施1次MS培養(yǎng)基中的大量元素。經(jīng)過30 d左右,當(dāng)幼苗粗壯、挺拔、根系發(fā)達(dá)后移栽到土壤中。

    3討論

    綬草屬于蘭科植物,在組織培養(yǎng)過程中經(jīng)常會出現(xiàn)染菌、褐化等現(xiàn)象,究其原因主要與品種、取材部位和取材時(shí)間、外植體大小及傷害程度有關(guān)[7]。所以,在培養(yǎng)過程中需要嚴(yán)格遵照無菌操作規(guī)程,降低污染率。

    6睟A是細(xì)胞分裂素,主要作用是促進(jìn)細(xì)胞分裂和誘導(dǎo)芽的分化,所以誘導(dǎo)芽的生成經(jīng)常在培養(yǎng)基中添加6睟A。NAA是生長素,可以誘導(dǎo)生根,效果較好,所以該研究利用NAA誘導(dǎo)生根達(dá)到了預(yù)期目的。該研究表明,進(jìn)行綬草組織培養(yǎng)時(shí),最適誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6睟A2.0,最適增殖培養(yǎng)基為MS+6睟A1.5+IAA0.4,最適生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA1.5。

    參考文獻(xiàn)

    [1] 國家環(huán)境保護(hù)總局.中國珍稀瀕危保護(hù)植物名錄(第一冊)[M].北京:中國科學(xué)院植物研究所,1987.

    [2]《中華本草》編委會.中華本草[M].上海:上??茖W(xué)技術(shù)出版社,1999:7916.

    [3] LIN Y L,HUANG R L,DON M J,et al.Dihydrophenanthrenes from 玈piranthes sinensis[J].Journal of Natural Products,2000,63(12):1608-1610.

    [4] LIN Y L,WANG W Y,KUO Y H.Homocyclotirucallane and two dihydrophenanthrenes from 玈piranthes sinensis[J].Chemical &Pharmaceutical Bulletin,2001,49(9):1098-1101.

    [5] PENG J Y,HAN X,XU L N,et al.Two new prenylated coumarins from 玈piranthes sinensis (Pers.) Ames[J].Journal of Asian Natural Products Research,2008,10(3): 256-259.

    [6] LINY L,CHEN W P,ABDULGAFOR D M.Dihydro phenanthrenenes from Bletilla formosana[J].Chem Pharm Bul,2005,53 (9):1111-1113.

    [7] 陳少珍,卜朝陽,閉志強(qiáng),等.蘭花組織培養(yǎng)中常見問題及解決方法[J].廣西農(nóng)業(yè)科學(xué),2006,37(1):72-74.

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