紫薯多糖脫蛋白工藝的研究

林翔凱 張龍濤 陳潔 陳玲 鄭寶東

摘 要 以紫薯多糖為原料，研究不同酶添加量、時(shí)間、溫度和pH值對(duì)蛋白質(zhì)脫除率和多糖損失率的影響。通過正交試驗(yàn)法得到酶法脫除紫薯多糖中蛋白的最優(yōu)工藝，并與Sevag法和三氯乙酸法相比較。結(jié)果表明：酶法是最佳的脫蛋白方法，其脫蛋白最佳工藝為：酶添加量為460 U/mL，溫度為50 ℃，時(shí)間為60 min，蛋白質(zhì)脫除率為87.71%，多糖的損失率為29.55%。

關(guān)鍵詞 紫薯；多糖；酶法；脫蛋白

中圖分類號(hào) TS255.36 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

紫薯[（Ipomoea batatas（L.）Lam）]又稱紫甘薯、黑薯，薯皮、薯肉分別呈紫黑、紫紅色，是甘薯的一種特有品種，在中國河南、廣東、福建、河北、廣西等地區(qū)均有廣泛種植[1-3]。已有研究結(jié)果表明，紫薯含有多糖、氨基酸、蛋白質(zhì)、色素等功能性成分，具有很強(qiáng)的抗氧化能力[4-5]，還可預(yù)防高血壓[6]、改善肝功能[7]、抗腫瘤[8]及抑制誘癌物質(zhì)的產(chǎn)生[9]。近年來，對(duì)于紫薯保健作用和藥用價(jià)值的研究越來越受到人們的重視。

多糖類物質(zhì)廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物的細(xì)胞壁中，是生物體內(nèi)除核酸、蛋白質(zhì)外的又一類重要生物分子，具有降血糖、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤等生物活性[10-12]。水提法得到的植物粗多糖中常含有較多的以糖蛋白復(fù)合物形式存在的蛋白雜質(zhì)，脫除難度較大，從而影響了紫薯多糖結(jié)構(gòu)和功效的進(jìn)一步研究。因此，如何在高效脫除蛋白質(zhì)的同時(shí)盡可能地保留多糖是多糖純化過程中需要解決的難題，也是制備多糖純品的必要步驟。

目前，國內(nèi)外粗多糖脫蛋白的方法主要有Sevag法、鹽酸法、酶法、三氯乙酸法和三氟三氯乙烷法等[13-15]。對(duì)紫薯粗多糖脫蛋白的報(bào)道還較少，尚未見采用酶法對(duì)紫薯粗多糖進(jìn)行脫蛋白的相關(guān)報(bào)道，因此筆者采用酶法對(duì)紫薯粗多糖進(jìn)行脫蛋白，通過正交試驗(yàn)對(duì)其工藝進(jìn)行優(yōu)化，并與Sevag法和三氯乙酸法作對(duì)比，為紫薯多糖的分離純化提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試植物 紫薯（紫羅蘭品種）購自福建長(zhǎng)樂。

1.1.2 藥品或試劑 木瓜蛋白酶購自北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司；牛血清蛋白、考馬斯亮藍(lán) G-250、無水乙醇、正丁醇、氯仿、濃硫酸、苯酚、葡萄糖、碳酸氫鈉、氫氧化鈉、氯化鈉等均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.1.3 設(shè)備或儀器 Phs-3C型精密pH計(jì)購自上海精密科學(xué)儀器有限公司；UV-2000型紫外可見分光光度計(jì)購自尤尼柯（上海）儀器有限公司；AL104型精密分析天平購自梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；FZ102植物粉碎機(jī)購自天津市泰斯特儀器有限公司；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器購自上海亞榮生化儀器廠；L530型臺(tái)式低速離心機(jī)購自長(zhǎng)沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)湘儀離心機(jī)儀器有限公司；丹瑞HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋購自江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)篩購自上虞市銀河測(cè)試儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 紫薯多糖的提取 紫薯洗凈、去皮、切片→烘干（45 ℃， 6 h）→粉碎、過篩（60目=250 μm）→熱水浸提（70 ℃、 3 h）→抽濾→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮（55 ℃）→95%乙醇沉淀→離心→水溶解→粗多糖溶液。

1.2.2 多糖含量的測(cè)定[16-17] （1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精確稱取經(jīng)干燥的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖20 mg，定容至500 mL，制得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，以水補(bǔ)至2.0 mL，然后加入6%苯酚水溶液1.0 mL，再迅速加入濃硫酸5.0 mL，顯色后于冷水中冷卻15 min。以水代替糖溶液作空白對(duì)照，于490 nm處測(cè)定吸光度。得到回歸方程為：

Y=6.623 2X+0.001 6（R2=0.998 8）

其中X：葡萄糖溶液濃度，單位mg/mL；Y：吸光度OD值。

（2）樣品中多糖含量的測(cè)定：吸取樣品液1.0 mL，按上述步驟操作，測(cè)定吸光度，代入回歸方程計(jì)算多糖含量。

1.2.3 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定[18] （1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精確移取牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度為0.1 mg/mL）0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，依次置于6支試管中，分別加入去離子水補(bǔ)至1 mL，搖勻。每管中加入5.0 mL染色液，搖勻，室溫靜置3 min。以空白溶液作對(duì)照，于595 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。得到回歸方程為：

Y=4.995 7X+0.009 4（R2=0.995 0）

其中X：牛血清白蛋白溶液濃度，單位mg/mL；Y：吸光度OD值。

（2）樣品中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定：吸取樣品液1.0 mL，按上述步驟操作，測(cè)定吸光度，代入回歸方程計(jì)算蛋白質(zhì)的含量。

1.2.4 酶法脫蛋白試驗(yàn) （1）單因素試驗(yàn)：考察木瓜蛋白酶添加量：60、160、260、360、460 U/mL（溫度60 ℃、時(shí)間60 min、pH為原液pH6.98），溫度：20、30、40、50、60、70 ℃（木瓜蛋白酶添加量160 U/mL、時(shí)間60 min、pH為原液pH6.98），時(shí)間：40、50、60、70、80、90 min（木瓜蛋白酶添加量160 U/mL、溫度60 ℃、pH為原液pH6.98）和pH值：4.00、5.00、6.00、6.98、8.00、9.00（木瓜蛋白酶添加量160 U/mL、溫度60 ℃、時(shí)間60 min）這些因素對(duì)蛋白質(zhì)脫除率的影響。酶解液經(jīng)4 000 r/min離心10 min，取上清液測(cè)定多糖和蛋白質(zhì)的含量。

（2）正交試驗(yàn)：在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選擇影響蛋白脫除率較大的3個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，得到酶法脫除紫薯粗多糖中蛋白質(zhì)的最佳工藝參數(shù)。

1.2.5 Sevag法 取多糖樣品液40 mL，加入10 mL Sevag試劑[氯仿 ∶ 正丁醇=4 ∶ 1（V ∶ V）]。將混合物劇烈振搖20～30 min，蛋白質(zhì)變性生成凝膠，離心分離，除去水層和溶劑層交界處的變性蛋白質(zhì)。取少量溶液測(cè)定多糖和蛋白質(zhì)含量，再向溶液中加入其1/4體積的氯仿-正丁醇溶液，重復(fù)上述步驟5次。

1.2.6 三氯乙酸法 取多糖樣品液50 mL，加入50 mL的3%三氯乙酸，使溶液完全混合均勻。于5～10 ℃冰箱中放置過夜，離心除去沉淀，測(cè)定多糖和蛋白質(zhì)的含量。

1.2.7 計(jì)算公式 多糖損失率=（C1-C2）/C1×100%

其中，C1：處理前的多糖濃度（mg/mL），C2：處理后的多糖濃度（mg/mL）。

其中，C3：脫蛋白前的蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），C4：脫蛋白后的蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酶添加量對(duì)紫薯多糖蛋白質(zhì)脫除率和多糖損失率的影響

由圖1可知，蛋白質(zhì)脫除率隨著酶添加量的增加而增大，在460 U/mL時(shí)達(dá)到最大；多糖損失率也隨著酶添加量的增加而緩慢增大。這可能是因?yàn)楸３址磻?yīng)體系中其它成分不變，隨著酶濃度的上升，酶與底物接觸的機(jī)會(huì)增加，蛋白質(zhì)脫除效果明顯增大；而多糖有一部分發(fā)生水解，并且隨著蛋白質(zhì)脫除率的增大也造成多糖的一部分損失，但并不明顯。同時(shí)，在酶添加量為460 U/mL時(shí)蛋白質(zhì)脫除率已高達(dá)88.47%，考慮到酶的成本與生產(chǎn)效益及多糖的損失，選擇460 U/mL為酶解的最適酶添加量。

2.2 不同溫度對(duì)紫薯多糖蛋白質(zhì)脫除率和多糖損失率的影響

由圖2可知，在20～50 ℃溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，蛋白質(zhì)脫除率基本不變；當(dāng)溫度高于50 ℃，蛋白質(zhì)脫除率顯著增加。這與酶的作用最適溫度有關(guān)，低溫抑制了酶的活性，而溫度大于50 ℃可激發(fā)酶的活性。多糖損失率隨著溫度的升高而增大，50 ℃后基本保持不變。這可能是因?yàn)槊复俜磻?yīng)的加劇造成部分多糖的損失，并且隨著溫度的升高部分多糖發(fā)生水解[19]。但多糖損失增大的趨勢(shì)并不明顯，因此選擇70 ℃為酶解的最適溫度。

2.3 不同時(shí)間對(duì)紫薯多糖蛋白質(zhì)脫除率和多糖損失率的影響

由圖3可知，當(dāng)酶解時(shí)間在40～70 min 時(shí)，蛋白質(zhì)脫除率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，70 min后蛋白脫除率幾乎不變。這可能是因?yàn)樵?0 min時(shí)酶促反應(yīng)基本完成，當(dāng)酶濃度不變時(shí)，延長(zhǎng)酶促反應(yīng)的時(shí)間并不能使蛋白質(zhì)脫除率顯著增加[13]。而多糖隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)發(fā)生部分水解，多糖損失率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而緩慢增加。因此，選擇70 min為最佳酶解時(shí)間。

2.4 不同pH值對(duì)紫薯多糖蛋白質(zhì)脫除率和多糖損失率的影響

由圖4可知，當(dāng)pH值為4.0時(shí)，蛋白質(zhì)基本被脫除干凈，隨著pH值的增大，蛋白質(zhì)脫除率顯著下降，在pH值為7.0～9.0時(shí)，蛋白質(zhì)脫除率基本保持不變，停留在20%左右的較低水平；而多糖損失率在酸、堿條件下顯著提高。這可能是因?yàn)樗?、堿易造成糖苷鍵斷裂，使多糖發(fā)生水解。因此，選擇原液的pH為脫除蛋白質(zhì)的最適pH值既方便、效果也最好。

2.5 正交試驗(yàn)

以蛋白質(zhì)脫除率為指標(biāo)，對(duì)酶添加量（A）、溫度（B）和時(shí)間（C）3個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，得到酶法脫除紫薯粗多糖中蛋白質(zhì)的最佳工藝參數(shù)。正交試驗(yàn)因素水平表和正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1和表2。

由表2可以看出，影響蛋白質(zhì)脫除率的主次因素是A>B>C。酶法脫除紫薯粗多糖蛋白質(zhì)的最優(yōu)工藝參數(shù)為A3B1C1，即酶添加量460 U/mL，溫度50 ℃，作用時(shí)間60 min。在此條件下，蛋白質(zhì)脫除率為87.71%，多糖損失率為29.55%。對(duì)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析（表3），結(jié)果可以看出酶添加量達(dá)極顯著水平（p<0.01），溫度和時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)脫除率效果影響不顯著。

2.6 Sevag法脫蛋白

使用Sevag試劑對(duì)紫薯粗多糖溶液進(jìn)行脫蛋白處理5次，蛋白質(zhì)脫除率和多糖損失率情況見表4。

表4可知，Sevag法脫蛋白3次后，蛋白質(zhì)脫除率穩(wěn)定，但多糖損失率卻逐漸上升。經(jīng)過5次脫蛋白后，蛋白質(zhì)脫除率只有64.99%，多糖損失率卻高達(dá)46.48%。因此選擇Sevag法脫蛋白3次為最佳，此時(shí)蛋白質(zhì)脫除率62.89%，多糖損失率31.19%。

2.7 不同脫蛋白方法的比較

對(duì)不同脫蛋白方法的蛋白質(zhì)脫除率和多糖損失率進(jìn)行對(duì)比研究，由表5可知，酶法是最佳的紫薯粗多糖脫蛋白方法，蛋白脫除率可高達(dá)87.71%，而多糖損失率僅為29.55%。

3 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以蛋白脫除率和多糖損失率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用蛋白酶法、Sevag法和三氯乙酸法對(duì)紫薯多糖溶液進(jìn)行脫蛋白處理，通過對(duì)比可知，Sevag法與三氯乙酸法脫蛋白工藝有機(jī)溶劑回收的工作量大，易造成環(huán)境污染，且多糖損失率較高；而酶法操作過程簡(jiǎn)單，蛋白質(zhì)脫除效果最好，且多糖損失率較低，是最好的脫蛋白方法。其脫蛋白最佳工藝為：酶添加量460 U/mL、溫度50 ℃、酶解時(shí)間60 min。在此工藝條件下，紫薯多糖蛋白質(zhì)脫除率為87.71%，多糖的損失率為29.55%。

此結(jié)果與已報(bào)道的其它紫薯多糖脫蛋白的研究結(jié)果相一致。高秋萍等[19]采用Sevag法、三氯乙酸法、Sevag法和三氯乙酸法相結(jié)合的方法對(duì)紫薯多糖進(jìn)行了脫蛋白，結(jié)果表明三氯乙酸法是相對(duì)較好的脫蛋白方法。賈琳璐[20]比較研究了Sevag法、三氯乙酸法、硫酸銨沉淀法對(duì)紫薯多糖的脫蛋白效果，結(jié)果表明Sevag法脫蛋白效率低，有機(jī)溶劑易殘留，且多糖的損失較大；三氯乙酸法脫蛋白效率較高，但容易引起多糖的降解；硫酸銨沉淀法為相對(duì)較好的脫蛋白方法，硫酸銨飽和度為40%，其蛋白質(zhì)脫除率為80.75%，多糖損失率為25.98%，此結(jié)果與酶法脫蛋白效果相似。但硫酸銨沉淀法與酶法相比操作更加繁瑣，耗時(shí)更久，而且會(huì)增加多糖溶液的體積，降低多糖溶液的濃度，影響對(duì)紫薯多糖的進(jìn)一步研究。因此，酶法脫蛋白是相對(duì)較好的脫蛋白方法。

同時(shí)，張怡等[13]研究了金柑多糖酶法脫蛋白工藝，結(jié)果表明酶法脫蛋白的效率較高，蛋白質(zhì)脫除率可達(dá)75.88%，多糖的損失率為5.45%；張一芳等[21]研究了枸杞多糖酶法脫蛋白工藝，結(jié)果表明酶法脫蛋白效果優(yōu)于Sevag法，其蛋白質(zhì)脫除率為78.56%，多糖損失率為10.53%；邱承軍等[22]在研究酶法脫蛋白提取大棗多糖工藝時(shí)也證實(shí)了酶法脫蛋白效果最好。

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