橡膠葉水浸提液對(duì)花生幼苗早期根系形態(tài)及其生理特性的影響

楊華庚 顏速亮 陳慧娟

摘 要 為深入理解橡膠樹的化感抑制作用，采用適當(dāng)濃度的橡膠葉水浸提液處理剛萌動(dòng)的花生種子10 d，測(cè)定花生幼苗早期根系形態(tài)及其生理指標(biāo)。結(jié)果表明：橡膠葉水浸提液能顯著降低花生幼苗胚根長(zhǎng)度、苗高、根鮮重、地上部鮮重以及根冠比，對(duì)根生長(zhǎng)的抑制作用比地上部強(qiáng)烈；能顯著降低根系總長(zhǎng)、根表面積、根體積和根尖數(shù)，但對(duì)根平均直徑有輕微的促進(jìn)作用，與對(duì)照相比，差異不顯著；能顯著降低根系SOD、POD、CAT活性、可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖、脯氨酸含量以及根系活力，卻明顯增加根系MDA含量和相對(duì)電導(dǎo)率。說明橡膠葉水浸提液可通過破壞花生幼苗的抗氧化防御機(jī)制，降低其滲透調(diào)節(jié)能力，減少根系的吸收面積，抑制根系的吸收活性來抑制花生幼苗的生長(zhǎng)。

關(guān)鍵詞 橡膠樹；化感作用；根系形態(tài)；抗氧化機(jī)制；滲透調(diào)節(jié)

中圖分類號(hào) S794.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

農(nóng)林復(fù)合系統(tǒng)是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中傳統(tǒng)的土地利用和經(jīng)營(yíng)模式，對(duì)于解決農(nóng)林用地矛盾、充分利用環(huán)境中的資源和能量、改善生態(tài)環(huán)境、提高土地生產(chǎn)力有重要作用。農(nóng)林復(fù)合系統(tǒng)內(nèi)的植物種間關(guān)系除存在光、熱、水、養(yǎng)分的競(jìng)爭(zhēng)外，還受植物種間化感作用的影響[1]。田楠等[2-3]研究了林（果）糧間作系統(tǒng)中的化感作用現(xiàn)象，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，泡桐、楊樹、蘋果、梨等12種樹木枯落葉對(duì)小麥、玉米存在促進(jìn)或抑制生長(zhǎng)的效應(yīng)。Lisanework等[4]研究發(fā)現(xiàn)，墨西哥柏木和3種桉樹對(duì)鷹嘴豆、玉米、豌豆、畫眉草4種農(nóng)作物的種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)均有抑制作用，抑制作用強(qiáng)度因樹木不同而有差異。可見，農(nóng)林生態(tài)系統(tǒng)中的化感作用現(xiàn)象是普遍存在的?；凶饔眯?yīng)引起的種間關(guān)系不協(xié)調(diào)會(huì)導(dǎo)致作物生長(zhǎng)受抑，生產(chǎn)效益下降[2]。因此，研究農(nóng)林復(fù)合系統(tǒng)中的化感作用現(xiàn)象，對(duì)農(nóng)林復(fù)合系統(tǒng)的種間優(yōu)化配置、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力提高以及可持續(xù)生產(chǎn)具有重要意義。膠園間作是中國(guó)橡膠生產(chǎn)的重要栽培模式。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)， 中國(guó)膠園間作面積約占全國(guó)植膠面積的4%，已引進(jìn)膠園間作的作物有20多種[5]。過去對(duì)橡膠人工間作系統(tǒng)的建立，往往只是從經(jīng)濟(jì)和資源利用的角度進(jìn)行人工組合，而忽視了橡膠樹與間作物之間存在的化學(xué)生態(tài)關(guān)系所引起的種間關(guān)系不協(xié)調(diào)問題。近年來的研究結(jié)果表明，膠園間作復(fù)合系統(tǒng)存在化感作用現(xiàn)象。曹潘榮等[6]研究了膠園長(zhǎng)期間作茶樹引起茶葉產(chǎn)量與品質(zhì)下降的化感作用因素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，一定濃度的橡膠葉水浸提液抑制了茶子萌發(fā)及其幼苗生長(zhǎng)。楊華庚等[7]研究了不同橡膠品系及其器官的化感作用效應(yīng)，結(jié)果表明，橡膠樹不同品系及其器官的水浸提液對(duì)花生、西瓜、玉米種子萌發(fā)及其幼苗生長(zhǎng)有促進(jìn)或抑制作用，同一品系不同器官、不同品系間的化感作用強(qiáng)度存在差異。顏桂軍等[8]也報(bào)道了一定濃度的橡膠葉水浸提液對(duì)玉米、黃豆、南瓜、花生的種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)有抑制作用。目前，雖然相關(guān)研究已對(duì)橡膠樹的化感作用進(jìn)行了生物測(cè)定，但尚未從組織形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理特性等方面對(duì)橡膠樹的化感作用機(jī)理進(jìn)行過探討。為此，本文在前期研究的基礎(chǔ)上，采用橡膠品系熱研7-33-97葉水浸提液對(duì)剛萌動(dòng)的花生種子進(jìn)行處理，研究葉水浸提液對(duì)花生幼苗早期根系形態(tài)及其抗氧化酶活性、膜脂過氧化、質(zhì)膜透性、滲透調(diào)節(jié)的影響，為深入理解橡膠樹的化感抑制作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 從橡膠品系熱研7-33-97的1年生莖干上選取新鮮、干凈、無病蟲危害的充分老熟葉片作為供體材料，以本地市場(chǎng)購(gòu)回的海南本地種紅皮花生種子為受體材料。

1.1.2 主要試劑 次氯酸鈉、氯化三苯基四氮唑、硫代巴比妥酸、茚三酮、蒽酮、考馬斯亮藍(lán)G-250、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、氯化硝基四氮唑藍(lán)（NBT）、30%過氧化氫等。

1.2 方法

1.2.1 橡膠葉水浸提液的制備 水浸提液的制備參考曹潘榮等[6]的方法。將橡膠葉片洗凈、自然晾干、剪碎，稱取鮮重，加入相當(dāng)于材料鮮重5倍的蒸餾水，在25 ℃下浸提24 h，期間多次攪拌，然后用雙層紗布過濾1次，再用濾紙過濾2次，即可得到有效抑制濃度為200 g/L（w/v）的水浸提液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 試驗(yàn)處理及指標(biāo)測(cè)定 選取新鮮、飽滿、大小基本一致、無病蟲害的花生種子，用5%次氯酸鈉溶液消毒10 min，經(jīng)蒸餾水沖洗3～4次后浸種、催芽，萌發(fā)后從中選取萌發(fā)一致的種子，播于培養(yǎng)皿（Φ=10 cm）中，其內(nèi)鋪有厚度為 0.5 cm，經(jīng)清水洗滌及高溫消毒的細(xì)砂，每皿20粒種子，然后加入橡膠葉水浸提液10 mL，使砂層濕潤(rùn)，對(duì)照加相同體積的蒸餾水，每處理重復(fù)6次。將種子放置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)于（25±1）℃、110 μmol/（m2·s）條件下進(jìn)行培養(yǎng)，每天光照12 h。在培養(yǎng)期間每皿定時(shí)加入10 mL水浸液或蒸餾水以保持砂層濕潤(rùn)。10 d后取出所有的幼苗測(cè)定幼苗根長(zhǎng)、苗高，根鮮重和地上部鮮重。然后取經(jīng)充分洗凈的根系進(jìn)行掃描，將完整的根系圖像存入計(jì)算機(jī)，再用WinRhizo 2008a（Regent Instruments Inc.，Canada）根系分析系統(tǒng)對(duì)根系總長(zhǎng)、根表面積、根平均直徑、根體積、根尖數(shù)進(jìn)行定量分析。取根尖1 cm根段測(cè)定根系活力、相對(duì)電導(dǎo)率、丙二醛（MDA）、可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸含量、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）活性。

根系活力參照孔祥生等[9]的方法，采用氯化三苯基四氮唑（TTC）法測(cè)定；質(zhì)膜透性參照郝建軍等[10]的方法，采用電導(dǎo)率儀法測(cè)定；丙二醛含量參照孔祥生等[9]的方法，采用硫代巴比妥酸法測(cè)定；脯氨酸含量參照李合生等[11]的方法，采用茚三酮法測(cè)定；可溶性糖含量參照李合生等[11]的方法，采用蒽酮比色法測(cè)定；可溶性蛋白質(zhì)含量參照李合生等[11]的方法，采用考馬斯亮藍(lán)G-250 染色法測(cè)定。

粗酶液提?。悍Q取0.5 g根樣放入研缽內(nèi)，加入少量經(jīng)預(yù)冷的50 mmol/L pH7.8磷酸緩沖液（內(nèi)含1% PVP），在冰浴上研磨，磨成勻漿后移入離心管內(nèi)，并用上述磷酸緩沖液分2次沖洗研缽，轉(zhuǎn)入離心管內(nèi)，使提取液終體積為5 mL。將提取液放置于4 ℃ 11 000 ×g冷凍離心機(jī)內(nèi)離心20 min，上清液用于SOD、POD、CAT活性、可溶性蛋白質(zhì)含量測(cè)定。

酶活性測(cè)定：SOD活性參照李合生等[11]的方法，采用氮藍(lán)四唑（NBT）法測(cè)定，以抑制NBT光化還原的50%為1個(gè)酶活性單位。POD活性參照鄭炳松等[12]的方法，采用分光光度計(jì)法測(cè)定，以每分鐘吸光度增加0.1的酶量為1個(gè)酶活單位（U）。CAT活性參照孔祥生等[9]的方法，采用紫外吸收法測(cè)定，以每分鐘吸光度減少0.1的酶量為1個(gè)酶活單位（U）。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析，應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析。根據(jù)測(cè)定值，采用Williamson等[13]的方法，計(jì)算化感效應(yīng)指數(shù)，用于化感作用分析。當(dāng)T≥C時(shí)，RI=1-C/T；當(dāng)T0時(shí)為促進(jìn)作用，RI<0時(shí)為抑制作用，其絕對(duì)值的大小反映了化感作用的強(qiáng)弱。

2 結(jié)果與分析

2.1 橡膠葉水浸提液對(duì)花生幼苗生長(zhǎng)的影響

橡膠葉水浸提液處理后，花生幼苗的胚根長(zhǎng)度、苗高、根鮮重、地上部鮮重極顯著降低，分別比對(duì)照處理的降低了79.31%，41.10%，92.28%，53.48%。胚根長(zhǎng)和根鮮重的化感效應(yīng)指數(shù)RI值分別為-0.79和-0.92，而苗高和地上部鮮重的化感效應(yīng)指數(shù)RI值分別為-0.41和-0.53，說明橡膠葉水浸提液對(duì)根生長(zhǎng)的抑制作用比地上部強(qiáng)烈。由于花生幼苗的根生長(zhǎng)比地上部生長(zhǎng)更容易受到水浸提液的嚴(yán)重抑制，導(dǎo)致了根冠比的極顯著降低，其值比對(duì)照處理的降低了81.48%，說明橡膠葉水浸提液對(duì)花生幼苗根冠比的抑制作用依然較為強(qiáng)烈（表1）。

2.2 橡膠葉水浸提液對(duì)花生幼苗根系形態(tài)的影響

從表2可見，橡膠葉水浸提液處理后，花生幼苗根系總長(zhǎng)、根表面積、根體積、根尖數(shù)極顯著減少，分別比對(duì)照處理的降低了72.22%，71.02%，69.76%，41.79%。抑制作用以根系總長(zhǎng)、根表面積和根體積為最強(qiáng)，RI值大約均在0.7左右。橡膠葉水浸提液對(duì)根平均直徑有輕微的促進(jìn)作用，但根增粗不顯著?？梢?，橡膠葉水浸提液對(duì)花生幼苗根系的抑制作用主要表現(xiàn)在降低根系的吸收面積。

2.3 橡膠葉水浸提液對(duì)花生幼苗根系膜脂過氧化、質(zhì)膜透性和抗氧化酶活性的影響

MDA是膜脂過氧化作用的末端產(chǎn)物，其含量的多少反映了膜脂過氧化的程度，而相對(duì)電導(dǎo)率則是衡量質(zhì)膜透性大小的指標(biāo)，其值的大小反映了質(zhì)膜系統(tǒng)受損的程度。由表3可知，橡膠葉水浸提液處理后，花生幼苗根系的MDA含量、相對(duì)電導(dǎo)率極顯著上升，分別比對(duì)照處理的增加了43.04%和3.49倍，RI值分別為0.30和0.78，表明橡膠葉水浸提液促進(jìn)了花生幼苗根系的質(zhì)膜過氧化過程，使質(zhì)膜的完整性受到破壞。

SOD、POD、CAT是細(xì)胞內(nèi)清除活性氧毒害的抗氧化酶系統(tǒng)。從表3可看出，橡膠葉水浸提液處理后，花生幼苗根系的SOD、POD活性極顯著降低，CAT活性顯著減少，分別比對(duì)照處理的降低了34.00%，17.99%和25.02%。說明橡膠葉水浸提液明顯降低了花生幼苗根系抗氧化酶清除活性氧的能力。水浸提液對(duì)抗氧化酶活性的抑制作用，以SOD活性為最強(qiáng)，其次是CAT活性，最后是POD活性。

2.4 橡膠葉水浸提液對(duì)花生幼苗根系滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量和根系活力的影響

橡膠葉水浸提液處理后，花生幼苗根系的可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖、脯氨酸含量極顯著降低，分別比對(duì)照處理的減少了51.53%，67.92%，55.74%（表4）。表明橡膠葉水浸提液能顯著減弱花生幼苗根系的滲透調(diào)節(jié)能力。其中，以對(duì)可溶性糖積累的抑制作用最強(qiáng)。此外，橡膠葉水浸提液處理后，花生幼苗的根系活力極顯著降低，下降幅度可達(dá)37.43%。暗示橡膠葉水浸提液能明顯降低花生幼苗根系對(duì)養(yǎng)分和水分的吸收能力。

3 討論與結(jié)論

植物的根系形態(tài)及其生理特性影響根系對(duì)養(yǎng)分、水分的吸收能力。根系長(zhǎng)度、根表面積、根體積是反映根系發(fā)育狀況的重要指標(biāo)，是植物對(duì)養(yǎng)分、水分吸收能力的重要決定因子[14]，而根平均直徑和根尖數(shù)也能在一定程度上反映出根系吸收能力的大小[15]。根系活力是根系生理特性的重要指標(biāo)，其值的大小反映了根系吸收及合成代謝能力的強(qiáng)弱[16]。研究顯示，植物根系的解剖結(jié)構(gòu)和根系形態(tài)及其構(gòu)型在化感脅迫下會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化。Chon等[17]研究結(jié)果表明，一定濃度的紫花苜蓿葉提取物顯著抑制紫花苜蓿和稗草的根生長(zhǎng)和形態(tài)分化，使根生長(zhǎng)受阻并產(chǎn)生腫脹。Cruz-Ortega等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在一定濃度的葫蘆科植物棘瓜水滲出液的處理下，供試的受體植物的胚根生長(zhǎng)顯著受抑，根尖變褐而且增厚；根冠細(xì)胞出現(xiàn)無定形和不分裂的細(xì)胞核、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，而液泡則發(fā)生內(nèi)陷；菜豆根尖圍繞靜態(tài)中心周圍的細(xì)胞出現(xiàn)壓縮，組織雜亂無章，缺乏明顯的細(xì)胞分化，而夏枯草和黑籽南瓜根組織內(nèi)某些細(xì)胞器、質(zhì)膜和細(xì)胞壁的超微結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。蔡世林等[19]研究指出，一定濃度的曼陀羅葉水浸提液處理下，大豆幼根縮短變粗，根尖嚴(yán)重彎曲；根長(zhǎng)、根尖長(zhǎng)、側(cè)根數(shù)目、根毛區(qū)長(zhǎng)、根毛區(qū)占根尖比例、根毛長(zhǎng)及根毛密度均下降。特別是在高濃度的處理下，這種抑制作用更為顯著。本研究結(jié)果表明，橡膠葉水浸提液對(duì)花生幼苗根系的抑制作用比地上部分強(qiáng)烈，對(duì)根的抑制作用主要表現(xiàn)在顯著降低花生根系總長(zhǎng)、根體積、根表面積和根尖數(shù)，而對(duì)根平均直徑有輕微的促進(jìn)作用，與對(duì)照相比，根增粗不顯著。根直徑增加可能是由于根冠細(xì)胞再生受抑，維管柱增大和皮層細(xì)胞層數(shù)增加的緣故[17，20]，而根增粗可以彌補(bǔ)因須根數(shù)量減少所造成的吸收面積降低[21]。橡膠葉水浸提液可能通過擾亂根組織的脂質(zhì)代謝，抑制蛋白質(zhì)合成，降低根組織的運(yùn)輸或分泌能力[20]；破壞根組織的激素平衡，降低赤霉素（GA3）、生長(zhǎng)素（IAA）等促進(jìn)生長(zhǎng)的激素水平，而增加脫落酸（ABA）等抑制生長(zhǎng)的激素水平[22-23]；誘發(fā)活性氧代謝失調(diào)致使細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷，抑制了根尖組織的有絲分裂，并影響根成熟區(qū)的細(xì)胞長(zhǎng)度[19，24-26]等方式來抑制花生幼苗根系的生長(zhǎng)發(fā)育，從而導(dǎo)致根系的有效吸收面積明顯下降。又由于花生幼苗根系活力受到橡膠葉水浸提液的顯著抑制，因而減弱了花生幼苗根系吸收和合成代謝能力，影響了花生幼苗對(duì)養(yǎng)分離子的吸收[16，27-28]，從而抑制了地上部分的生長(zhǎng)。

在正常情況下，植物細(xì)胞中自由基的生成與清除處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，自由基的積累處于不會(huì)對(duì)細(xì)胞造成損害的較低水平上。然而在化感脅迫下，這種平衡被破壞，植物體內(nèi)的O2·- 、H2O2等活性氧大量增加，從而引發(fā)膜脂過氧化，損傷細(xì)胞質(zhì)膜的結(jié)構(gòu)與功能，使細(xì)胞受傷害[29-32]。許多研究結(jié)果表明，化感脅迫引發(fā)的氧化脅迫，提高了SOD、POD、CAT、APX、GPX、GR、GST等抗氧化酶的活性[29-30]，以清除過量的活性氧傷害。SOD、POD、CAT是細(xì)胞內(nèi)抵御活性氧傷害的重要保護(hù)酶系統(tǒng)。SOD催化O2·- 發(fā)生歧化反應(yīng)生成H2O2，H2O2則在CAT和POD的催化下轉(zhuǎn)化成H2O和O2，三者協(xié)調(diào)一致，共同作用，可使活性氧維持在較低水平上。本試驗(yàn)結(jié)果表明，橡膠葉水浸提液引發(fā)活性氧代謝失調(diào)，導(dǎo)致活性氧不斷積累，從而對(duì)抗氧化酶結(jié)構(gòu)造成損傷，使其活性下降，阻礙了活性氧的清除，從而加劇了膜脂過氧化作用，使MDA含量顯著增加，不斷增加的MDA與脂類、核酸、糖類和蛋白質(zhì)分子發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，使質(zhì)膜結(jié)構(gòu)和功能嚴(yán)重受損，質(zhì)膜的通透性明顯增大，細(xì)胞內(nèi)含物大量滲漏，引起花生幼苗體內(nèi)生理代謝的紊亂，從而抑制了花生幼苗根系和地上部分的生長(zhǎng)?？梢姡鹉z葉水浸提液誘導(dǎo)的活性氧代謝失調(diào)是導(dǎo)致花生幼苗產(chǎn)生化感抑制作用的一個(gè)重要原因。繆麗華等[33]研究結(jié)果表明，較高濃度的再力花地下部水浸提液對(duì)5種水生植物幼苗體內(nèi)SOD、POD和CAT活性有顯著的抑制作用，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。

脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白是植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，能維持或降低植物體內(nèi)細(xì)胞滲透勢(shì)，增強(qiáng)細(xì)胞的持水能力，在保護(hù)蛋白質(zhì)分子、抵御氧化脅迫，減輕逆境對(duì)生物膜傷害等方面發(fā)揮了重要作用[34]。有研究報(bào)道稱，一定強(qiáng)度的化感脅迫下，可溶性蛋白、可溶性糖、脯氨酸會(huì)在植物體內(nèi)積累[31，35]，以增強(qiáng)植物對(duì)化感脅迫的適應(yīng)能力。但在高強(qiáng)度的化感脅迫下，可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸的含量水平受到明顯的抑制，并且顯著低于對(duì)照水平[35-37]。本試驗(yàn)結(jié)果與黃溦溦等[35]、李翔等[36]、郝飛等[37]研究結(jié)果相同。表明在嚴(yán)重化感脅迫下，花生幼苗體內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)作用受到破壞，減弱了滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用，從而加重了花生幼苗的傷害。橡膠葉水浸提液可能通過改變控制這些滲透物質(zhì)合成途徑的基因表達(dá)下調(diào)有關(guān)合成途徑的酶活性和上調(diào)有關(guān)降解途徑的酶活性，來抑制這些滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量水平[38]，從而影響細(xì)胞內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)能力。

綜上所述，在一定濃度的橡膠葉水浸提液處理下，花生幼苗的抗氧化酶防御機(jī)制和滲透調(diào)節(jié)機(jī)制受到破壞，導(dǎo)致細(xì)胞膜脂過氧化加劇，引起細(xì)胞的氧化損傷，從而顯著抑制了花生幼苗根系的生長(zhǎng)發(fā)育，導(dǎo)致根系吸收面積明顯減少，根系活力顯著降低，因而減弱了根系吸收和合成代謝能力，影響了根系對(duì)養(yǎng)分的吸收，從而抑制花生幼苗地上部分的生長(zhǎng)。本試驗(yàn)結(jié)果深化了對(duì)橡膠樹化感抑制作用的理解，但要切實(shí)反映橡膠樹對(duì)受體植物根系形態(tài)和生理代謝的化感作用影響，還需進(jìn)一步模擬自然條件進(jìn)行研究。根據(jù)先前的研究[6-8]以及本研究結(jié)果，推測(cè)橡膠樹體內(nèi)含有影響受體植物生長(zhǎng)發(fā)育的化感物質(zhì)，今后還需對(duì)橡膠樹體內(nèi)的化感物質(zhì)進(jìn)行鑒定分析，以明確橡膠樹化感作用的主要物質(zhì)及其作用效應(yīng)，為深入揭示橡膠樹化感作用機(jī)理奠定理論基礎(chǔ)。

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