安徽烏菜DNA提取與InDel引物篩選

馬福萌等

摘 要： 利用改良的SDS法提取了153個品種的安徽烏菜DNA，并進行2次重復，均獲得了較理想的DNA產物。通過試驗確定了安徽烏菜InDel-PCR的10 μL最佳反應體系：1× PCR Buffer 1 μL，dNTP 0.2 μL ， 引物1 μL，Taq E 0.1 μL，DNA 1 μL， ddH2O 6.7 μL； 最佳PCR擴增反應程序：94 ℃ 預變性5 min；94 ℃ 變性30 s，55 ℃ 退火40 s，72 ℃ 延伸40 s，共36個循環(huán)，最后72 ℃ 延伸10 min，10 ℃ 保存。從供試的66對InDel引物中篩選出31對適合安徽烏菜、條帶清晰、重復性高、多態(tài)性好的引物，為安徽烏菜品種鑒定、遺傳多樣性分析等奠定了基礎。

關鍵詞： 安徽烏菜； DNA提取； InDel； 引物篩選

Abstract： In this research，we extracted DNA 153 varieties of Wucai grown in Anhui with two replication by modified SDS method. We obtained good quality DAN. 10 μL optimum InDel-PCR reaction system was determined by the experiments： 1×PCR Buffer 1 μL，dNTP 0.2 μL，1 μL primer，Taq E0.1 μL，DNA 1 μL，6.7 μL ddH2O and the best PCR amplification reaction procedure： 94 ℃ pre degeneration in 5 min； 30 s 94 ℃ degeneration，annealing at 55 ℃ 40 s，72 ℃ for 40 s，a total of 36 cycles. The last 72 ℃ was 10 min，and the reaction solution preserved at 10 ℃. From 66 pairs of primers，we selected 31pairs of primers with clear band，high repeatability，and high polymorphism. These InDel markers are useful for Anhui Wucai variety identification and genetic diversity study.

Key words： Anhui Wucai； DNA extraction； InDel； Primer screening

烏菜（Brassica campestris L. ssp. Chinese（L.）Makino var. rosularis Tsen et Lee）別名烏塌菜、塌棵菜、黑菜等，2n=20，是十字花科蕓薹屬蕓薹種白菜亞種的一個變種 [1]。安徽烏菜原產于江淮之間的北部，是安徽省的著名特產之一[1]，在安徽省的栽培歷史悠久，栽培區(qū)域也越來越廣。目前對烏菜的研究主要致力于高產栽培技術的總結[2]、主要農藝性狀及相關分析[3]、植物學性狀[4]等方面，而缺乏分子生物學方面的深入研究。

InDel（insertion-deletion）標記是指在等位基因位點上一定數量的核苷酸插入或缺失一段相對短的核苷酸序列而產生的長度多態(tài)性變異[5]。它作為分子標記的一種，可以較容易地通過生物信息學的方法獲得，InDel標記檢測方法具有簡單、經濟實用、特異性高、穩(wěn)定性好[6]、分布廣[7]等特點，已在親緣關系鑒定[8]、多態(tài)性分析[9]、純度鑒定[10]、圖位克隆[11]等領域被廣泛應用。本試驗目的是篩選出適合安徽烏菜InDel-PCR反應的引物，為安徽烏菜遺傳多樣性分析及核心種質構建提供前提條件，對烏菜的種質資源鑒定、重要性狀基因定位與烏菜種質創(chuàng)新及新品種選育均具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗時間為2012年9月至2013年5月。供試材料為在安徽省合肥、六安、蚌埠等市收集的安徽烏菜品種及經自交、雜交所得的烏菜材料。本試驗所用引物均由中國農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取 播種后40 d，取幼嫩的葉片提取DNA，2次重復，DNA提取采用改良的SDS法[12]。

1.2.2 引物篩選 選取表現型差異較大的6個不同烏菜材料，利用InDel分子標記進行PCR擴增，篩選出適合的引物。篩選的標準是條帶清晰，多態(tài)性高，重復性好，無假帶。

1.2.3 Indel-PCR反應體系 InDel-PCR反應體系為10 μL，其中包括：1× PCR Buffer 1 μL，dNTP 0.2 μL， 引物1 μL，Taq E 0.1 μL（北京天根生化生物科技有限公司），DNA 1 μL，ddH2O 6.7 μL。PCR擴增反應程序為：94 ℃ 預變性5 min；94 ℃ 變性30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃ 延伸40 s，共36個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min，10 ℃ 保存。

1.2.4 擴增產物的電泳檢測 擴增產物用不同濃度的瓊脂糖凝膠電泳和不同濃度的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進行比較，篩選最佳電泳方法。

2 結果與分析

2.1 DNA質量檢測

隨機選取17個DNA樣品，在紫外分光光度計上測量其濃度和純度，其中DNA的OD260/OD280值大多介于1.8～2.0之間；用1% 的瓊脂糖電泳檢測，烏菜DNA均呈現1條可見的亮帶，無明顯彌散狀（圖1），說明無RNA、蛋白質、酚等污染或污染較少，符合Indel-PCR分子標記反應要求。

2.2 電泳方法的選擇

本試驗分別采用瓊脂糖水平電泳與非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳對PCR擴增產物進行檢測，結果顯示，6%的非變性聚丙烯酰胺垂直電泳條帶較清晰，片段長度多在100～250 bp之間（圖2）。而瓊脂糖水平電泳的DNA條帶很弱，難以分辨（圖略）。

2.3 Indel標記的引物篩選

本試驗從66對引物中淘汰掉無條帶、條帶模糊、無多態(tài)性的引物，初步篩選出條帶清晰、多態(tài)性好、重復性好的的引物共31對，篩選率為46.97%，擴增出的條帶最多為7條，最少為1條。圖3為5對引物分別對6個DNA樣品的擴增效果圖，此圖表明此5對引物條帶清晰，多態(tài)性條帶數量為1～4條，片段長度在50～300 bp之間，均可作為烏菜Indel-PCR所需引物。

3 討 論

本試驗采用改良的SDS法提取DNA，利用去污劑SDS使細胞膜、細胞核膜分解，釋放出核酸，然后通過氯仿抽取蛋白[13]，使DNA含有較少的蛋白質及其他抑制酶活性物質如多糖等，加入抗氧化劑β-巰基乙醇，防止酚類氧化，然后通過有機試劑異丙醇沉淀出DNA，經紫外分光光度計和1%瓊脂糖電泳檢測結果表明此方法獲得了較純的DNA。此方法較CTAB法操作簡單，方便快捷，比試劑盒提取法節(jié)約成本。

本試驗所用引物是從白菜上開發(fā)出來的，雖經前期驗證可用于安徽烏菜Indel分子標記，但并不是每對引物都適合各個品種，并能擴增出清晰的DNA條帶。本試驗通過大量對比試驗確定了適合安徽烏菜的凝膠電泳方法和Indel-PCR反應體系，篩選出31對烏菜Indel-PCR反應的引物，這為以后構建烏菜的核心種質、利用烏菜中的優(yōu)良基因開展分子標記輔助育種提供了理論依據，也對安徽烏菜種質資源保存、保護和可持續(xù)利用以及安徽烏菜分類、起源、演化和育種研究，特別是對防止資源流失，遺傳性狀的早期鑒定等都具有重要的意義。

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