薄皮甜瓜離體再生體系的優(yōu)化

付秋實(shí)等

摘 要： 通過(guò)器官發(fā)生途徑誘導(dǎo)形成不定芽，建立薄皮甜瓜‘IVF05 植株再生體系，探討不同外植體及不同的激素組合對(duì)不定芽再生的影響。結(jié)果表明，子葉近胚軸端外植體的不定芽再生率為 90.00%，子葉節(jié)的再生率為 85.00 %，子葉遠(yuǎn)胚軸端外植體的再生率為 31.43%，下胚軸的再生率為 0，子葉近胚軸端是‘IVF05不定芽分化的理想的外植體。不定芽誘導(dǎo)中最適宜的培養(yǎng)基為 MS + ABA 0.5 mg·L-1 + 6-BA 1.0 mg·L-1，在此培養(yǎng)基上產(chǎn)生的愈傷較少，能正常分化的不定芽較多，不定芽的生長(zhǎng)較快。在 MS + 6-BA 0. 05 mg·L-1 的不定芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基上，分化的不定芽能夠伸長(zhǎng)長(zhǎng)大。在 MS + IAA 0. 2 mg·L-1 的生根培養(yǎng)基上無(wú)根苗容易生根。從外植體培養(yǎng)到獲得完整再生植株需 50～60 d。

關(guān)鍵詞： 薄皮甜瓜； 離體再生； 子葉； 6-BA； ABA

Abstract： An efficient regeneration system of plantlets was established for melon（Cucumis melo L. ‘IVF05）. We investigated the influence of explant type and plant growth regulator combinations on regeneration rate of adventitious buds in this research. The results showed that the adventitious buds regeneration rates of cotyledon explants near the hypocotyl，cotyledonary nodes，cotyledon explants far from hypocotyl and hypocotyl were 90.00%，85.00%，31.43% and 0，respectively. Cotyledon explants near the hypocotyls were the optimal explants. The optimal concentrations of plant growth regulators were 0.5 mg·L-1 ABA plus 1.0 mg·L-1 6-BA. The buds elongation medium was MS + 6-BA 0.05 mg·L-1. The rooting medium was MS + IAA 0.2 mg·L-1. It took about 50 to 60 days from explants culture to obtain complete regeneration plant.

Key words： Oriental melon； Plant regeneration； Cotyledon； 6-BA； ABA

甜瓜（Cucumis melo L.）是世界重要的經(jīng)濟(jì)作物。隨著生活水平的提高，人們?cè)絹?lái)越重視其產(chǎn)量和品質(zhì)。近年來(lái)隨著植物基因工程技術(shù)的迅速發(fā)展，運(yùn)用生物技術(shù)手段進(jìn)行種質(zhì)創(chuàng)新，改良甜瓜品質(zhì)已經(jīng)成為甜瓜遺傳育種研究的新途徑。甜瓜高效再生體系的建立， 對(duì)于進(jìn)一步進(jìn)行甜瓜功能基因鑒定、轉(zhuǎn)基因等方面的研究十分必要。目前已有通過(guò)真葉[1]、子葉[2-5]、下胚軸[6]等多種外植體再生完整植株的報(bào)道，但是研究主要集中在厚皮甜瓜上[7-11]，對(duì)薄皮甜瓜的研究較少，我國(guó)有豐富的薄皮甜瓜種質(zhì)資源，對(duì)薄皮甜瓜的遺傳改良具有較大潛力。而且不同的甜瓜品種以及不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)甜瓜離體再生體系的建立影響較大，再生潛力依基因型而明顯不同[12]。在前人的研究中，采用外植體直接器官發(fā)生途徑時(shí)，一般在培養(yǎng)基中僅添加細(xì)胞分裂素或極少量生長(zhǎng)素[13-14]。6-BA 作為一種細(xì)胞分裂素，在促進(jìn)細(xì)胞分裂和不定芽發(fā)生方面具有很好的效果[15-17]。前人以子葉作外植體，6-BA 為主要誘導(dǎo)激素，輔之以 ABA，通過(guò)器官直接發(fā)生途徑，建立了不同基因型黃瓜子葉的再生體系[18-20]。前人在黃瓜上的研究結(jié)果表明，6-BA 是不定芽分化所必需的，而 ABA 能明顯提高芽的分化速度和不定芽數(shù)目。甜瓜也屬于葫蘆科作物，但是關(guān)于 ABA 對(duì)甜瓜離體再生的影響還未見(jiàn)報(bào)道。因此本文以薄皮甜瓜 ‘IVF05 為材料，研究了不同外植體、不同 6-BA 與 ABA 組合對(duì)其離體再生的影響，旨在建立高效的薄皮甜瓜離體再生體系，以期為甜瓜轉(zhuǎn)基因技術(shù)以及培育優(yōu)良的薄皮甜瓜品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為薄皮甜瓜 ‘IVF05，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所甜瓜課題組選育。

1.2 方法

2.1 不同外植體對(duì)不定芽誘導(dǎo)的影響

外植體的部位是離體培養(yǎng)時(shí)的關(guān)鍵因素。3 結(jié)論與討論

外植體的選擇是進(jìn)行組織培養(yǎng)及植株再生的關(guān)鍵。師桂英等[21]研究表明，厚皮甜瓜‘黃河蜜的極性現(xiàn)象不受外植體切割方式和切塊大小的影響，而與子葉外植體的切口位置有關(guān)，靠近胚軸的切口容易產(chǎn)生不定芽，遠(yuǎn)離胚軸的切口難以形成不定芽。子葉近胚軸部位的子葉塊不定芽的誘導(dǎo)率高于遠(yuǎn)離胚軸端的子葉塊，多數(shù)不定芽都是在靠近胚軸端的子葉塊中產(chǎn)生。本試驗(yàn)中也表明最適宜作為薄皮甜瓜組織培養(yǎng)的外植體材料為子葉近胚軸端，其不定芽誘導(dǎo)率在 90% 以上。通過(guò)子葉近胚軸端直接誘導(dǎo)不定芽途徑，成苗時(shí)間短，能快速建立起甜瓜的高頻穩(wěn)定再生體系，這與王志強(qiáng)等[22]、陶興林等[12]試驗(yàn)結(jié)果一致。

雖然甜瓜子葉節(jié)也有較高不定芽分化率，但前人的研究結(jié)果表明，子葉節(jié)去除生長(zhǎng)點(diǎn)之后，由于生長(zhǎng)點(diǎn)周圍細(xì)胞分裂旺盛，即使未接觸芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，仍然會(huì)有不定芽的生長(zhǎng)[23]。不論是加入還是不加入6-BA，每個(gè)子葉節(jié)幾乎都可以誘導(dǎo)出不定芽，增加6-BA的質(zhì)量濃度可以增加叢生芽的分化數(shù)量。在子葉節(jié)基部除不定芽分化外，還有大量叢生畸形葉生長(zhǎng)，無(wú)生長(zhǎng)點(diǎn)，不能進(jìn)一步培養(yǎng)成正常植株[24]。若在遺傳轉(zhuǎn)化選擇培養(yǎng)階段，由于生長(zhǎng)點(diǎn)部位不能完全接觸選擇培養(yǎng)基，此部位分化出的不定芽得到許多假陽(yáng)性植株，從而加大后續(xù)工作量。

6-BA是甜瓜再生分化的關(guān)鍵物質(zhì)。本試驗(yàn)中不定芽誘導(dǎo)最適6-BA質(zhì)量濃度為1.0 mg·L-1。在誘導(dǎo)不定芽的增殖生長(zhǎng)中，加入較高質(zhì)量濃度的6-BA，雖然對(duì)芽的分化有促進(jìn)作用，但是容易產(chǎn)生叢芽，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)分化出的叢生芽中存在大量簇生畸形葉（圖1-B），無(wú)明顯生長(zhǎng)點(diǎn)，即使進(jìn)一步培養(yǎng)也不能長(zhǎng)成正常植株，并且外植體有黃化現(xiàn)象，這與孫天國(guó)等[25]的研究結(jié)果一致。因此在繼代過(guò)程中適當(dāng)降低細(xì)胞分裂素濃度對(duì)芽的正常生長(zhǎng)是有利的。同時(shí)，還應(yīng)該及時(shí)轉(zhuǎn)移分化完全的不定芽至伸長(zhǎng)培養(yǎng)基上，避免外植體在含有高濃度激素的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上停留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。

本試驗(yàn)中 ABA 對(duì)甜瓜子葉的芽分化也有促進(jìn)作用，6-BA和ABA的不同配比影響甜瓜子葉不定芽的分化，不定芽誘導(dǎo)中最適宜的激素組合為MS+ABA 0.5 mg·L-1 +6-BA 1.0 mg·L-1，在此培養(yǎng)基上產(chǎn)生的愈傷較少，能正常分化的不定芽較多并明顯伸長(zhǎng)，不定芽的生長(zhǎng)較快（表2，圖1-A）。在只添加2.0 mg·L-1 6-BA的培養(yǎng)基上，外植體表現(xiàn)為輕度黃化（圖1-B）。添加ABA是多種難以再生植物組織培養(yǎng)的有效措施，應(yīng)用到黃瓜組培上也獲得相似的結(jié)果，以黃瓜子葉作外植體，6-BA為主要誘導(dǎo)激素，輔之以ABA，通過(guò)器官直接發(fā)生途徑，建立了不同基因型黃瓜子葉的再生體系。李泠等[20]報(bào)道，ABA在黃瓜再生中起到了重要的作用，與激動(dòng)素相配合能促進(jìn)植株分化，并能抑制異常胚狀體，促進(jìn)正常胚狀體的發(fā)生。梅茜和張興國(guó)[19] 研究也表明，在培養(yǎng)基中添加ABA可明顯提高黃瓜的芽再生能力，且以 1.0 mg·L-1 為最適宜，如果不添加ABA，則很難產(chǎn)生不定芽。Sekioka等 [26] 的研究表明在黃瓜的組織培養(yǎng)中，低質(zhì)量濃度的 ABA（0.1 mg·L-1）促進(jìn)胚狀體的正常發(fā)育，而高質(zhì)量濃度的ABA（1.0 mg·L-1）能顯著減少培養(yǎng)物的愈傷組織化，并控制胚狀體處于球形胚或球形胚后期。Han等[27] 研究認(rèn)為，添加ABA可明顯提高芽誘導(dǎo)率，6-BA和ABA的組合可適用于不同的黃瓜品種。從激素的影響效應(yīng)來(lái)說(shuō)，6-BA屬于細(xì)胞分裂素類，對(duì)植物的生長(zhǎng)分化起促進(jìn)作用，而ABA是一種生長(zhǎng)抑制劑，可能兩者對(duì)于維持外植體的激素平衡起到了重要作用，相關(guān)機(jī)理需進(jìn)一步作研究。因此，在植物組織培養(yǎng)研究中，選擇合適的激素及其配比濃度是獲得再生植株的關(guān)鍵。

本試驗(yàn)中將誘導(dǎo)的不定芽轉(zhuǎn)入伸長(zhǎng)培養(yǎng)基中（MS + 6-BA 0.05 mg·L-1），分化的不定芽能夠伸長(zhǎng)長(zhǎng)大，在生根培養(yǎng)基中（MS + IAA 0.2 mg·L-1） 容易生根。從外植體培養(yǎng)到獲得完整再生植株需 50～60 d，建立了薄皮甜瓜遺傳轉(zhuǎn)化和快繁的子葉再生體系。

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