正交試驗(yàn)優(yōu)化豬血制備亞硝基血紅蛋白

程燕 姜無(wú)邊 符紹輝

摘 要：以豬血為原料，經(jīng)過(guò)血細(xì)胞分離、破裂提純得到血紅蛋白，與NaNO2反應(yīng)制取亞硝基血紅蛋白，并采用正交試驗(yàn)法討論NaNO2添加量、VC添加量、pH值、加熱時(shí)間對(duì)合成試驗(yàn)結(jié)果的影響，以O(shè)D值評(píng)價(jià)試驗(yàn)結(jié)果。該方法是一種低成本、高效益的方法。結(jié)果顯示：血紅蛋白、NaNO2、VC物質(zhì)的量比l∶2∶6、pH6.0、加熱至60 ℃保持30 min為亞硝基血紅蛋白合成試驗(yàn)的最佳工藝條件，可簡(jiǎn)單而快速的制得亞硝基血紅蛋白。

關(guān)鍵詞：豬血；血紅蛋白；NaNO2；VC；亞硝基血紅蛋白

An Optimized Method for Preparing Nitrosohemoglobin from Pig Blood

CHENG Yan1， JIANG Wu-bian1， FU Shao-hui2

（1. Hubei Baodi Agri & Tech （Group） Co. Ltd.， Anlu 432602， China；

2. Tianjin Baodi Agri & Tech （Group） Co. Ltd.， Tianjing 301800， China）

Abstract： Hemoglobin was extracted from the ruptured red blood cells from pigs and then allowed to react with sodium nitrite to form nitrosohemoglobin. The efficiency of nitrosohemoglobin synthesis as evaluated by OD575 nm was investigated with respect to four reaction conditions including the amounts of sodium nitrite and vitamin C， pH and heating time using an orthogonal array design. As a result， a simple， rapid and cost-effective method for preparing nitrosohemoglobin was established by heating a mixture of hemoglobin， sodium nitrite and vitamin C at a molar ratio of l：2：6 adjusted to pH 6.0 to 60 ℃ and maintaining the temperature for 30 minutes.

Key words： pig blood； hemoglobin； sodium nitrite； vitamin C； nitrosohemoglobin

中圖分類號(hào)：TS201.7 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2014）03-0010-04

具有良好色澤的食品，往往能刺激人們的食欲和購(gòu)買欲，其色澤更是常作為鑒定品質(zhì)的指標(biāo)[1]。目前，國(guó)內(nèi)外肉類企業(yè)大多采用亞硝酸鹽作為肉品的發(fā)色劑，來(lái)獲得理想的色澤和風(fēng)味，延長(zhǎng)保質(zhì)期[2]。但是，肉制品在熱處理加工過(guò)程中，亞硝酸鹽容易受熱形成亞硝胺類的致癌、致畸和致突變物質(zhì)，從而嚴(yán)重威脅人們的生命健康[3]，故迫切需要一種穩(wěn)定而安全的亞硝酸鹽取代劑。

豬血中蛋白質(zhì)含量約19%[4]，其主要成分為血紅蛋白（hemoglobin，Hb），占全血蛋白總量的2/3[5]。血紅蛋白分子由珠蛋白和血紅素構(gòu)成的亞基組成，正常情況下，血紅素包被于珠蛋白中；變性后的血紅蛋白，血紅素暴露出來(lái)，與NaNO2在酸性條件下產(chǎn)生的NO-結(jié)合，生成紅色的亞硝基血紅蛋白（nitrosohemoglobin，HbNO）[6-8]。HbNO在一定的條件下分解，緩慢地釋放NO-，與肌紅蛋白（myoglobin，Mb）結(jié)合而呈現(xiàn)鮮艷的紅色[9]，起發(fā)色作用。HbNO色澤鮮紅、對(duì)熱和氧穩(wěn)定[10]，相比于NaNO2，它在肉品內(nèi)自發(fā)形成，直接添加避免了NaNO2危害，更有利于食品的安全與健康。本實(shí)驗(yàn)從豬血中提取血紅蛋白，純化后與NaNO2作用生成HbNO，并討論各個(gè)因素對(duì)提取與合成工藝的影響，以期為實(shí)際生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮豬血 湖北寶迪農(nóng)業(yè)科技有限公司；

檸檬酸鈉、抗壞血酸、NaOH、NaNO2均為分析純 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AR224CN電子天平 奧豪斯儀器有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州榮冠實(shí)驗(yàn)分析儀器廠；722-紫外分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；PHS-3E數(shù)字式pH計(jì) 上海精科實(shí)業(yè)有限公司；DHG-9070A鼓風(fēng)干燥箱 上海飛越實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 血紅蛋白制備

1.3.1.1 血紅蛋白的提取

取新鮮豬血，以全血∶檸檬酸鈉為100∶0.5（mL/g）比例，快速加入檸檬酸鈉抗凝[11]，用玻璃棒沿一個(gè)方向攪拌與豬血充分混勻，低溫運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。攪拌5 min后過(guò)濾，3 000 r/min離心30 min，棄上層血清；加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%生理鹽水，攪拌均勻，3 000 r/min離心10 min、棄上清液（重復(fù)2 次）[12-13]，收集紅血球并記錄體積。

分別采用溶脹法[14]、凍融法[15]、超聲波法對(duì)血細(xì)胞進(jìn)行破壁[16]，并比較3 種方法效果。當(dāng)溶液由暗紅轉(zhuǎn)變?yōu)轷r紅時(shí)，以3 000 r/min離心15 min，用吸管小心吸取上清液，得血紅蛋白粗提取液，在顯微鏡下觀察細(xì)胞壁破裂情況，以細(xì)胞計(jì)數(shù)法評(píng)價(jià)比較。

溶脹法：加入紅血球細(xì)胞與蒸餾水體積比分別為1∶1、1∶1.5、1∶2的混合溶液，電磁攪拌30 min；凍融法：―20 ℃完全凍結(jié)后，室溫下融化；超聲波法：加入紅血球細(xì)胞與蒸餾水體積比分別為1∶1、1∶1.5、1∶2的混合溶液，超聲波處理5 min，功率100 W。

1.3.1.2 血紅蛋白純化

將粗提液中加入適量抗氧化劑VC，并通入N2排除空氣，60 ℃水浴30 min，使雜蛋白沉淀，于3 000 r/min離心15 min，吸取上清液。加入10 mg/mL甘油入上清液，后置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.3 血紅蛋白純度測(cè)定

采用堿性羥基高鐵血紅素法（Alkaline haematind-575，AHD-575）檢測(cè)血紅蛋白純度。測(cè)定原理：在堿性環(huán)境下，該試劑中的非離子型表面活性物質(zhì)會(huì)與血紅蛋白及其衍生物反應(yīng)，迅速形成復(fù)合物，該復(fù)合物穩(wěn)定且在波長(zhǎng)575 nm處有一吸收峰[17]，易觀察測(cè)定。此法應(yīng)用的AHD-575穩(wěn)定、無(wú)毒，且對(duì)血紅蛋白的結(jié)果無(wú)明顯影響。

AHD-575試劑配制：準(zhǔn)確稱取聚乙二醇辛基苯基醚25.0 g，加入0.1 mol/L NaOH溶液定容至1 L，攪拌均勻，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：配制成不同濃度的豬血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別吸取0.1 mL加入到30 mL AHD-575試劑中，靜置反應(yīng)5 min。以AHD-575試劑為空白，在575 nm波長(zhǎng)下，測(cè)定吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），吸光度為縱坐標(biāo)（Y），繪制血紅蛋白溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程。

樣品測(cè)定：吸取血紅蛋白提取液樣品0.1 mL，用標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法測(cè)定其在575 nm處吸光度，帶入回歸方程計(jì)算得血紅蛋白含量。

1.3.2 HbNO合成

以純化后血紅蛋白為原料，加入NaNO2、VC，調(diào)pH值至酸性，攪拌加熱得HbNO溶液[18]，真空冷凍干燥后生成紅色粉狀物。將合成的亞硝基血紅蛋白溶于80%丙酮水溶液中，離心取上清液，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在450～600 nm下掃描其吸收光譜[19]。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

NaNO2、VC量、pH值、加熱時(shí)間對(duì)合成試驗(yàn)都會(huì)產(chǎn)生影響，本試驗(yàn)根據(jù)嚴(yán)聃等[20]試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案。先討論NaNO2對(duì)合成試驗(yàn)的影響，再取最優(yōu)NaNO2添加量，依次研究VC添加量、pH值、加熱時(shí)間對(duì)合成試驗(yàn)的影響。

1.3.3.1 NaNO2添加量

以純化后血紅蛋白為原料，pH5、加熱時(shí)間20 min。測(cè)量產(chǎn)物紫外吸光度，固定Hb1 mol、VC添加量4 mol，研究NaNO2添加量為1、2、3 mol對(duì)合成試驗(yàn)的影響。

1.3.3.2 VC添加量

調(diào)pH5、加熱時(shí)間20min，固定Hb1mol、NaNO2

2mol，研究VC添加量為4、6、8 mol對(duì)合成試驗(yàn)的影響。

1.3.3.3 pH值

在NaNO2∶VC∶Hb物質(zhì)的量的比2∶6∶1、加熱時(shí)間20 min的條件下，研究pH值為4.5、5、5.5、6、6.5對(duì)合成試驗(yàn)的影響。

1.3.3.4 加熱時(shí)間

在NaNO2∶VC∶HD物質(zhì)的量的比2∶6∶1、pH值為5的條件下，研究加熱時(shí)間為20、25、30、35、40 min對(duì)合成試驗(yàn)的影響。

1.3.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，對(duì)影響HbNO合成效率的NaNO2添加量、VC添加量、pH值、加熱時(shí)間設(shè)計(jì)四因素三水平正交試驗(yàn)（表1）。

表 1 HbNO合成正交試驗(yàn)因素水平表

Table 1 Factor and coded levels used in orthogonal array design for the optimization of in nitrosohemoglobin synthesis

水平 因素

A NaNO2添加量/mol B VC添加量/mol C pH D加熱時(shí)間/min

1 1 4 5 20

2 2 6 5.5 30

3 3 8 6 40

因亞硝基血紅蛋白在540 nm處有特征紫外吸收峰，則分別取等體積產(chǎn)物，用540 nm處紫外吸收峰大小即產(chǎn)物量評(píng)價(jià)上述添加方案。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取方法的確定

表 2 三種不同方法的破壁效果

Table 2 Comparison of efficiencies of three cell disruption methods

方法 溶脹法（血細(xì)胞∶水（V/V）） 凍融法 超聲波法（血細(xì)胞∶水（V/V））

1∶1 1∶1.5 1∶2 1∶1 1∶1.5 1∶2

破壁率/% 86 96 100 92 82 95 100

如表2所示，采用3 種方法都可以得到很好血紅蛋白溶液，其中凍融的方法耗時(shí)較長(zhǎng)，影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)度，首先排除；理論上超聲波法的破壁率應(yīng)高于溶脹法，但蛋白質(zhì)經(jīng)超聲處理易發(fā)生變性沉淀的現(xiàn)象[21]，因此排除；加入血細(xì)胞體積2 倍蒸餾水，用溶脹法處理血細(xì)胞，可以使血細(xì)胞完全溶脹破壁，但增大了提取液的體積，更增加了血紅蛋白與空氣的接觸時(shí)間與表面積，使真空濃縮時(shí)間加長(zhǎng)，使提取效率降低；而當(dāng)加入蒸餾水體積為1.5 倍時(shí)，破壁率即可達(dá)96%，故選擇此方法。

2.2 血紅蛋白純度的測(cè)定

配制一系列質(zhì)量濃度梯度的豬血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以AHD-575法測(cè)定吸光度A575，繪得標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.002 8x+0.006 1（R2=0.9917）。此時(shí)吸光度0.2378，血紅蛋白質(zhì)量濃度（C1）=82.75 g/L，蛋白質(zhì)總質(zhì)量濃度

（C2）=108.53 g/L，則純化后血紅蛋白純度得率為：

2.3 紫外光譜掃描結(jié)果

圖 1 紅蛋白水溶液（a）和硝基血紅蛋白丙酮提取液（b）紫外掃描圖

Fig.1 UV spectra of aqueous hemoglobin solution （a） and nitrosohemoglobin in acetone （b）

紫外可見(jiàn)吸收峰的形狀、波峰與波谷位置、吸收峰個(gè)數(shù)都可以反應(yīng)該物質(zhì)的結(jié)構(gòu)。物質(zhì)不同。分子結(jié)構(gòu)不同，決定了吸收光譜也不同。從圖1可看出，血紅蛋白液與反應(yīng)后所得HbNO的吸收曲線明顯不同，即吸光度曲線形狀、吸收峰處波長(zhǎng)均不同，從而證明生成了新物質(zhì)。

2.4 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 NaNO2添加量

從圖2可知，隨著加入反應(yīng)物量的增加，產(chǎn)物量先增加后趨于平衡，在Hb1 mol、VC 4 mol條件下，當(dāng)NaNO2為2 mol時(shí)，產(chǎn)物量基本達(dá)最大，NaNO2與Hb完全反應(yīng)。

圖 2 NaNO2添加量對(duì)合成試驗(yàn)的影響

Fig.2 Effect of sodium nitrite dosage on nitrosohemoglobin synthesis

2.4.2 VC添加量

圖 3 VC添加量對(duì)合成試驗(yàn)的影響

Fig.3 Effect of vitamin C dosage on nitrosohemoglobin synthesis

從圖3可知，隨著加入反應(yīng)物量的增加，產(chǎn)物量先增加后趨于平衡，在Hb1 mol、NaNO2 2 mol條件下，VC添加量為6 mol時(shí)，產(chǎn)物量基本達(dá)最大，VC抗氧化效果顯著，故選取VC添加量為6 mol。

2.4.3 pH值

圖 4 pH值對(duì)合成試驗(yàn)的影響

Fig.4 Effect of reaction pH on nitrosohemoglobin synthesis

從圖4可知，pH值對(duì)合成試驗(yàn)影響十分明顯，OD值先增加后趨于平衡，故取pH6.0為最佳反應(yīng)條件。

2.4.4 加熱時(shí)間

由圖5可知，加熱時(shí)間對(duì)OD值曲線先增加后下降，在30 min處取最大值。合成反應(yīng)需要一定的時(shí)間，但時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，產(chǎn)物會(huì)接觸空氣氧化或受熱分解，故選擇加熱時(shí)間為30 min。

圖 5 加熱時(shí)間對(duì)合成試驗(yàn)的影響

Fig.5 Effect of heating time on nitrosohemoglobin synthesis

2.5 正交試驗(yàn)結(jié)果

表 3 合成HbNO正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

Table 3 Orthogonal array design with experimental results for the optimization of in nitrosohemoglobin synthesis

試驗(yàn)號(hào) A B C D OD值

1 1 1 1 1 0.388

2 1 2 2 2 0.451

3 1 3 3 3 0.608

4 2 1 2 3 0.755

5 2 2 3 1 0.832

6 2 3 1 2 0.624

7 3 1 3 2 0.786

8 3 2 1 3 0.536

9 3 3 2 1 0.651

K1 1.447 1.929 1.548 1.871

K2 2.211 1.819 1.857 1.861

K3 1.973 1.883 2.226 1.899

k1 0.482 0.643 0.516 0.624

k2 0.737 0.606 0.619 0.620

k3 0.658 0.628 0.742 0.633

R 0.276 0.037 0.226 0.013

由表3可知，9個(gè)試驗(yàn)號(hào)中A2B2C3D1組合所得產(chǎn)品OD值最高為0.832。從R值可以看出單因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響依次為NaNO2添加量>pH值>VC添加量>加熱時(shí)間，隨著NaNO2添加量、VC添加量、pH值、加熱時(shí)間的增加，OD值變大，且當(dāng)Hb∶NaNO2∶VC=1∶2∶6（n/n）時(shí)不再增加，比較A2B1C2D3與A3B1C3D2發(fā)現(xiàn)2者相差很小，對(duì)比pH值的主因素作用，則此水平下加熱時(shí)間達(dá)到30 min后OD值減小，單因素試驗(yàn)中A2B2C3D2的OD值為0.841，大于A2B2C3D1組合所得OD值0.832，故分析正交試驗(yàn)結(jié)果最佳組合為A2B2C3D2，此時(shí)試驗(yàn)條件為Hb∶NaNO2∶VC物質(zhì)的量比1∶2∶6、pH 6.0、加熱時(shí)間30 min。

3 結(jié) 論

以豬血為原料，分離得到Hb∶NaNO2∶VC物質(zhì)的量比1∶2∶6、pH 6.0、加熱至60 ℃保持30 min可以簡(jiǎn)單而快捷的制得HbNO。此方法不斷解決了豬血浪費(fèi)而產(chǎn)生的污染，更提供了一種無(wú)污染的食品添加劑制作方法。

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