山西豬鏈球菌的分離鑒定及藥敏實驗

唐娟　劉華棟　王彩先　陸冰洋　詹海杰　詹麗娥

摘 要：豬鏈球菌是一種常見的病原菌，能引起動物和人類發(fā)生豬鏈球菌病，本實驗通過在山西靈石某豬場發(fā)病豬群中取樣，分離病原菌，并且對病原菌進(jìn)行培養(yǎng)、鏡檢、生化鑒定以及PCR的技術(shù)擴(kuò)增其gdh和16srRNA的序列，然后進(jìn)行藥敏實驗。鑒定出分離菌能夠在鮮血平板上形成溶血環(huán)、革蘭氏染色陽性、43種生化試驗結(jié)果以及擴(kuò)增出特異性條帶，表明分離到的病原菌為豬鏈球菌。藥敏實驗結(jié)果可見其對強力霉素等藥物敏感，而對頭孢曲松和磷霉素完全耐藥。為山西地區(qū)豬鏈球菌的防治提供參考。

關(guān)鍵詞：豬鏈球菌；分離鑒定；gdh；16srRNA；藥敏實驗

Abstract： Streptococcus suis is a common pathogenic bacteria which lead to Streptococcussuis in animal and human. This experiment sampled from a pig farm in Lingshi of Shanxi. We isolated and cultured the pathogenic bacteria. Then the pathogenic bacteria were observed by microscopic， identified by biochemical tests and PCR technology. The PCR was used to amplify sequences of gdh and 16s rRNA. Finally， we conducted the drug sensitive experiment on bacteria. The results showed that bacteria could form the hemolysis ring on blood flat plate， Gram-positive. 43 kinds of biochemical test and specific amplified fragment results showed that the pathogen was Streptococcus suis. Drug susceptibility test displayed the doxycycline was sensitive drug. But the Streptococcus suis were completely resistant to ceftriaxone and fosfomycin. This experiment provided a reference for the prevention and control of Streptococcus suis in Shanxi area.

Keywords： streptococcus suis；isolation and identification；gdh；16srRNA；drug sensitivity test

豬鏈球菌可引起豬的敗血癥、腦膜炎、心內(nèi)膜炎、關(guān)節(jié)炎等癥狀。它是世界范圍內(nèi)引發(fā)豬鏈球菌病最主要的病原，目前已確定有35（1～34及1/2）個血清型[1]，不同國家和地區(qū)具有不同的流行株，其中2型流行最廣、致病性最強。

豬鏈球菌不斷的在各地發(fā)生，其對藥物的敏感程度也在不斷的發(fā)生變化，特別是對一些常用藥的敏感性降低，甚至出現(xiàn)耐藥菌，趙慧梅等[2]對山西地區(qū)豬鏈球菌分離株進(jìn)行藥敏實驗可見大多對鏈霉素和慶大霉素耐藥。湖南分離到的豬鏈球菌對四環(huán)素和磺胺甲惡唑耐藥率達(dá)到100%[3]。

本研究對山西地區(qū)分離到的豬鏈球菌進(jìn)行藥敏實驗，通過對34種常用藥物的敏感性檢測，旨在為山西省篩選藥物防治豬鏈球菌病提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源 疑似豬鏈球菌感染的組織器官采集于山西靈石縣某豬場。

1.1.2 主要試劑 血瓊脂平板培養(yǎng)基購于鄭州安圖綠科生物工程有限公司。TSA和TSB培養(yǎng)基購于美國BD公司。新生牛血清購于杭州四季青生物公司。核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)物Trans2K plus DNA Marker購自北京東盛生物有限公司。細(xì)菌全基因組快速提取試劑盒購自北京捷瑞生物有限公司。鏈球菌參考血清購自丹麥皇家血清研究所（Statens Seruminstitut，Copenhagen，Denmar k），引物是由上海生工有限公司合成。測序由上海生工有限公司完成。生化鑒定由山西醫(yī)學(xué)科學(xué)院山西大醫(yī)院檢驗科完成。

1.1.3 藥敏紙片 藥敏紙片購于北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司，共34 種， 藥物如下： 青霉素、氨芐西林、鏈霉素、慶大霉素、硫酸新霉素、卡那霉素、紅霉素、阿奇霉素、頭孢噻吩、頭孢拉定、頭孢唑啉、氧氟沙星、諾氟沙星、強力霉素、環(huán)丙沙星、頭孢曲松、鹽酸林可霉素、鹽酸恩諾沙星、阿米卡星、磷霉素、磺胺嘧啶鈉、頭孢哌酮、頭孢呋辛鈉、頭孢吡肟、頭孢噻肟、頭孢他啶、苯唑西林、乙酰螺旋霉素、磺胺氯吡嗪鈉、硫酸粘桿菌素、鹽酸沙拉沙星、硫酸安普霉素、鹽酸林可霉素、鹽酸土霉素。

1.2 方法

1.2.1 病原的分離培養(yǎng) 無菌收集發(fā)病豬的關(guān)節(jié)液，肝臟，心臟，脾臟等器官，將采集的病料劃線接種于添加有5%新生牛血清的TSA培養(yǎng)基，37℃ 24 h后挑取針尖大小、灰白色、呈圓形、表面光滑、邊緣整齊的菌落純培養(yǎng)接種于鮮血瓊脂平板。

1.2.2 鏡檢 對可見溶血環(huán)的疑似菌落進(jìn)行革蘭氏染色，結(jié)晶紫1 min，碘液1 min，酒精脫色30 s，復(fù)紅50 s，油鏡下鏡檢觀察。

1.2.3 生化鑒定 挑取TSA培養(yǎng)基上純培養(yǎng)的單個菌落接種于TSB 中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h后的菌液送檢。

1.2.4 細(xì)菌DNA提取及PCR擴(kuò)增 對病原菌使用細(xì)菌全基因組快速提取試劑盒，鏡檢呈陽性，生化鑒定為鏈球菌，提取全基因組。具體步驟為：挑取TSA復(fù)蘇的單菌落，在含5%新生牛血清的TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)約10 h，取2 mL菌液4 000 rpm離心5 min以收集菌液，將菌沉淀重懸，加10 μL 10 mg/mL溶菌酶溶液，充分混勻后于37 ℃靜置30 min以上，以破除細(xì)胞壁。破壁后加入混有SDS的15 mg/mL蛋白酶K 30 μL，于55 ℃水浴2 h，加等量酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1），8 000 rpm離心10 min。此時吸取上層清液于另一EP管中，于其中加異丙醇使DNA完全沉淀，8 000 rpm離心5 min取沉淀。使用冷乙醇洗滌沉淀，同上步離心棄上清液， 向沉淀中加DNA洗脫液靜置充分溶解DNA，4 ℃保存?zhèn)溆?。以提取出來的基因組為模板，對分離菌的gdh基因和16SrRNA序列擴(kuò)增的方法進(jìn)行分子鑒定，使用華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物重點實驗室設(shè)計的引物擴(kuò)增。

1.2.5 藥敏實驗 采用K-B紙片擴(kuò)散法[4]，挑取豬鏈球菌單個菌落密集均勻地涂布整個平板，將含有抗生素藥物的濾紙片用燒灼滅菌的鑷子分別貼于平板表面，相互間應(yīng)間隔一定距離，37℃培養(yǎng)24 h后，觀察結(jié)果。判定標(biāo)準(zhǔn)：應(yīng)按抑菌圈直徑大小作為判定敏感度高低的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 病原分離培養(yǎng)結(jié)果

從發(fā)病豬內(nèi)臟器官和關(guān)節(jié)等部位分離到的病原菌在鮮血瓊脂培養(yǎng)基上生長良好，菌落周圍有透明溶血環(huán)。

2.2 病原菌鏡檢結(jié)果

病原菌革蘭氏染色鏡檢為G+，染成紫色的球菌呈單個、兩個相連或連接呈現(xiàn)短鏈狀（見圖1）。

2.3 生化鑒定結(jié)果

經(jīng)43種生化試驗，分離菌株符合豬鏈球菌的生化培養(yǎng)特性，鑒定為豬鏈球菌（見表2）。

2.4 PCR擴(kuò)增結(jié)果

擴(kuò)增豬鏈球菌的gdh基因后得到566 bp的條帶（見圖2）。16srRNA基因擴(kuò)增可見有1411 bp的條帶（見圖3）。

2.5 藥敏試驗結(jié)果

用34種藥物對分離到的豬鏈球菌進(jìn)行藥敏實驗，結(jié)果見表3。

由表可見，豬鏈球菌分離株對強力霉素、卡那霉素等藥物敏感，而對頭孢曲松和磷霉素完全耐藥。

3 討論

豬鏈球菌的鑒定一般采用培養(yǎng)特性及生化實驗，溶血實驗等[2，5]，也有用PCR的方法擴(kuò)增其gdh基因[6-7]和16srRNA基因序列的[8-9]并將其擴(kuò)增測序以及同源性比對。還有人通過擴(kuò)增其cps和epf基因來鑒定豬鏈球菌[10]。本實驗結(jié)合傳統(tǒng)生長生化實驗，溶血實驗與PCR擴(kuò)增其gdh基因和16srRNA基因的方法來鑒定豬鏈球菌尚屬國內(nèi)首例。

由于藥物的不合理使用，導(dǎo)致豬鏈球菌耐藥株的出現(xiàn)，各地均出現(xiàn)了不同藥物的耐藥株，常見藥物對豬鏈球菌2型的敏感性呈現(xiàn)下降趨勢，耐藥普擴(kuò)大[11]。本實驗的結(jié)果卻是對生產(chǎn)中較為常用的強力霉素、卡那霉素、紅霉素及環(huán)丙沙星等藥物均敏感，而對頭孢曲松和磷霉素出現(xiàn)耐藥性。這可能與養(yǎng)殖場管理人員的思維定勢有關(guān)，認(rèn)為常用抗生素使用過頻，耐藥性肯定會嚴(yán)重，轉(zhuǎn)而使用生產(chǎn)中不常用的頭孢曲松和磷霉素，造成鏈球菌對這兩種藥物產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致防治不力。因此在生產(chǎn)用藥中應(yīng)該做到輪換用藥和聯(lián)合用藥，降低病原菌產(chǎn)生耐藥性的速度。■（編輯：狄慧）

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