超聲處理對(duì)堿法制備蠶蛹蛋白條件的優(yōu)化

穆利霞 廖森泰 詹寶瑟等

摘 要 通過單因素分析及響應(yīng)面優(yōu)化，研究超聲處理對(duì)堿法制備蠶蛹蛋白得率的影響，得到了蠶蛹蛋白得率的數(shù)學(xué)模型，優(yōu)化了制備條件，提高了堿法制備蠶蛹蛋白的得率。結(jié)果表明：NaOH濃度和液固比（V/m）對(duì)蠶蛹蛋白得率影響顯著（p<0.05）。蠶蛹蛋白浸提的最佳工藝條件為：超聲功率400 W，超聲時(shí)間20 min，浸提液固比（V/m）60 ∶ 1，NaOH濃度0.3%。在此工藝條件下，蠶蛹蛋白的得率為88.14%。制備的蠶蛹蛋白中的必需氨基酸含量符合FAO/WHO推薦標(biāo)準(zhǔn)，可以作為食品基料使用。

關(guān)鍵詞 超聲處理；蠶蛹蛋白質(zhì)；蛋白得率；優(yōu)化

中圖分類號(hào) S377 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

蠶絲業(yè)起源于中國，具有5 000多年的歷史。我國的蠶絲業(yè)長期以來在國際上占據(jù)壟斷地位，目前蠶繭和生絲產(chǎn)量占全球總產(chǎn)量的70%以上[1]。作為繅絲行業(yè)的副產(chǎn)物，蠶蛹因?yàn)楹械呢S富營養(yǎng)活性成分使其被衛(wèi)生部列為“食品新資源”中唯一的昆蟲類食品[2]。蠶蛹干物質(zhì)中蛋白含量可達(dá)到48.7%～52.5%[3]，蠶蛹蛋白中的必需氨基酸含量占總氨基酸含量的42%，必需氨基酸與非必需氨基酸的比值為0.7[4]，完全符合WHO/FAO提出的蛋白參考模式。

常用的蛋白制備方法主要有：堿法、酶法、Tris-HCl法、鹽法以及有機(jī)溶劑法，其中堿法和酶法在工業(yè)中應(yīng)用較多。相比于酶法，堿法制備的效率高、能耗和成本較低，更適合于工業(yè)化生產(chǎn)。蠶蛹蛋白的制備多采用堿法和有機(jī)溶劑法制備，有機(jī)溶劑法制備蠶蛹蛋白容易造成溶劑的殘留，陳芳艷等[5]則采用醇溶法制備蠶蛹蛋白，蛋白得率僅為8.47%，不能廣泛應(yīng)用。蠶蛹蛋白難溶于水，目前堿法制備蠶蛹蛋白的報(bào)道中，多采用高溫長時(shí)間浸提或極大的液料比來獲得較高的浸提率[6-8]。孫雁等[6]認(rèn)為：高溫長時(shí)間的浸提會(huì)使生成的蠶蛹蛋白蛹臭味濃，顏色較深，需要進(jìn)一步采用有機(jī)溶劑或者臭氧脫色脫臭，而且造成蛋白的過度降解，對(duì)其加工特性（如起泡性，溶解性等）造成不同程度的影響；較大的料液比在一定程度上增加了生產(chǎn)造成的占地規(guī)模、能耗、廢水處理等成本，不利于產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)。因此，改進(jìn)蠶蛹蛋白制備工藝的意義重大。

近年來，超聲波作為一種物理的手段和工具，為科研工作者提供了一條能夠把能量引入到分子中的高效途徑和方法。超聲波是頻率大于20 kHz的聲波，具有波動(dòng)與能量的雙重屬性，能改變蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)，破壞蛋白質(zhì)分子內(nèi)鍵，對(duì)蛋白質(zhì)溶解性有一定影響[9-10]。因此，超聲的應(yīng)用有助于提取過程中蛋白的溶出，從而提高蛋白的得率。超聲協(xié)助堿法制備蛋白的方法已經(jīng)在花生分離蛋白、芡實(shí)蛋白、松仁蛋白等方面展開，并取得顯著的成效[11-13]。

本研究以繅絲蠶蛹為原料，通過單因素分析及響應(yīng)面優(yōu)化，研究了超聲處理對(duì)堿法制備蠶蛹蛋白的影響，建立超聲協(xié)助堿法制備蠶蛹蛋白的數(shù)學(xué)模型，并優(yōu)化制備條件，為蠶蛹蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料與試劑 繅絲后的蠶蛹由廣東韶關(guān)翁源信達(dá)繭絲綢有限公司提供。原料的具體制備參照穆利霞等[14]的方法。

牛血清白蛋白由華美生物技術(shù)有限公司提供；Folin酚試劑由鼎國生物技術(shù)有限公司提供；氨基酸測(cè)定所用試劑為色譜純；其它所用試劑均為分析純。

1.1.2 儀器 高速冷凍離心機(jī)（CR22G型，HITACHI，日本）；冷凍干燥機(jī)（ALPHA1-4/2-4型，德國）；精密pH計(jì)（320-S型，瑞士梅特勒-托利多儀器設(shè)備有限公司）；快速漩渦振蕩儀（MM-2型，江蘇省姜堰市沈高康建生化器具廠）；紫外/可見分光光度計(jì)（UV-2450，島津，日本）；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（DF-101S型，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；凱氏定氮儀（KDN-08，上海新嘉電子有限公司）；脂肪酸測(cè)定儀（SOX416型，GERHARDT，德國）；超聲設(shè)備（JY92-IIN型，寧波新芝生物技術(shù)股份有限公司）；水分測(cè)定儀（MA型，賽多利斯，德國）；氨基酸分析儀（L-8900型，HITACHI，日本）。

1.2 方法

1.2.1 蠶蛹蛋白的堿法制備 將脫脂蠶蛹粉與一定濃度的浸提液按照一定液固比（V/m）充分混合均勻，在不同的超聲條件下處理，得到的混合液過300目篩除去蛹皮等不溶物，得到的濾液為蛋白浸提液。以1 mol/L的HCl調(diào)節(jié)蛋白浸提液pH值為4.5，于4 ℃靜置2 h，得到蛋白沉淀。沉淀在室溫以4 000 r/min離心15 min分離。重新懸浮沉淀，并以2 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值為7.0，4 ℃透析24 h脫鹽（每4 h更換透析液）。脫鹽后的蛋白溶液冷凍干燥后得蠶蛹蛋白。

1.2.2 蠶蛹蛋白浸提條件的優(yōu)化 以超聲功率（W）（X1）、超聲時(shí)間（min）（X2）、浸提的液固比（V/m）（X3） 和NaOH添加量（%）（X4）等四因素為自變量，以蠶蛹蛋白得率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)了4因素3水平的中心組合試驗(yàn)[15]。試驗(yàn)各因素及其水平分別為：超聲功率（300～500 W），超聲時(shí)間（15～25 min），浸提液固比（V/m）（20 ∶ 1～60 ∶ 1），NaOH濃度（0.1%～0.5%）。將脫脂蠶蛹粉與試驗(yàn)濃度的浸提液按照試驗(yàn)體積比充分混合均勻，于試驗(yàn)的超聲條件下處理。以考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定過濾液中可溶性蛋白的含量[16]，并計(jì)算蛋白得率。計(jì)算公式如下：

蛋白得率=×100%

1.2.3 蠶蛹蛋白各指標(biāo)的檢測(cè) 脫脂蛹粉及蠶蛹蛋白的各指標(biāo)按照如下方法測(cè)定：水份測(cè)定采用常壓干燥法（GB/T14769-1993）；蛋白質(zhì)含量采用凱氏定氮法（GB/T 14771-1993，Nx6.25）；脂肪含量采用索氏抽提法（GB/T14772-1993）；灰分測(cè)定采用重量法（GB/T14770-1993）；總氨基酸組成采用Hitachi L-8900氨基酸分析儀進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定前用6 mol/L HCl于充氮管中充分酸水解（110 ℃，22 h）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行相關(guān)性分析，p<0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異；樣本數(shù)n≥3。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素分析

2.1.1 超聲功率對(duì)蛋白得率的影響 圖1結(jié)果表明，當(dāng)超聲時(shí)間（10 min）和液固比（10 ∶ 1）恒定時(shí)，與對(duì)照相比，超聲處理能夠顯著改善蠶蛹蛋白的得率。在超聲功率為100 W時(shí)，得率比較低，在超聲輔助提取的條件下，蛋白得率明顯提高，當(dāng)超聲功率大于400 W， 繼續(xù)增大超聲功率時(shí)，得率逐漸降低。

超聲功率是描述超聲能量輸入的一個(gè)重要指標(biāo)，在介質(zhì)相同的情況下，不同的功率會(huì)導(dǎo)致介質(zhì)中不同的溫度變化，從而影響蛋白的溶出率；同時(shí)適當(dāng)?shù)某曁幚頃?huì)改變蛋白的結(jié)構(gòu)，從而改善蛋白的溶解性，增加蛋白的得率。而過高的功率會(huì)導(dǎo)致溶液的局部溫度增加過快，使溶出的可溶性蛋白重新聚集沉淀，使蛋白的得率在一定程度上有所降低。

2.1.2 超聲時(shí)間對(duì)蛋白得率的影響 圖2結(jié)果表明，在超聲功率（400 W）和液固比（10 ∶ 1）恒定的條件下，蠶蛹蛋白的得率隨著超聲時(shí)間的延長先升高后逐漸降低，這與超聲本身對(duì)蛋白的影響有關(guān)。在提取時(shí)間為5～20 min之間，提取效率逐漸增加，5～10 min增幅最大，20 min之后，時(shí)間越長，反而不利于蛋白的提取。湯虎等[10]的研究結(jié)果表明，在適當(dāng)?shù)某暪β蕳l件下，蛋白質(zhì)的溶解性隨著超聲時(shí)間的延長出現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，這是因?yàn)樵诔暡ǖ淖饔孟?，蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)變得疏松，蛋白質(zhì)溶解性增加，隨著處理時(shí)間的延長，蛋白質(zhì)展開的肽鏈重新聚集，蛋白的溶解性降低。

2.1.3 液固比對(duì)蛋白得率的影響 當(dāng)超聲功率（400 W）和時(shí)間（20 min）恒定時(shí)，介質(zhì)溶液的濃度直接會(huì)影響到超聲的作用效果[17]。圖3結(jié)果表明，在超聲功率和超聲時(shí)間恒定的條件下，隨著溶液中脫脂蛹粉濃度的增加，超聲協(xié)助堿法制備蠶蛹蛋白的得率先增加后變化不明顯。

提取時(shí)液固比過小時(shí)，蠶蛹中蛋白質(zhì)不易從溶劑中被提出，故而蛋白的得率很低。提取液固比越大，蛋白質(zhì)得率越大，這是由于蠶蛹蛋白多數(shù)為球蛋白，其蛋白溶解性低，因此增加溶劑的量能夠增加蛋白的得率。但液料比過大時(shí)，如液固比>40時(shí)，得率增長緩慢，這可能是因?yàn)檫^低的反應(yīng)底物濃度導(dǎo)致提取過程中蛋白損失的比重增加，從而使蛋白的得率改善不明顯甚至略有降低?？紤]到以上因素和工業(yè)生產(chǎn)的可行性，提取時(shí)液固比40 ∶ 1。超聲介質(zhì)中蛋白的濃度會(huì)影響超聲波的作用效果，在適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)濃度范圍內(nèi)，超聲波的空化作用隨著蛋白含量的增大而增大，蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)變得疏松，導(dǎo)致蛋白的溶解性發(fā)生變化，蛋白得率增加；當(dāng)?shù)鞍缀吭龃髸r(shí)，在相等時(shí)間內(nèi)，超聲波空化作用減弱，過高的濃度導(dǎo)致相同時(shí)間內(nèi)超聲波對(duì)反應(yīng)體系的作用減弱，從而影響其產(chǎn)生特殊的物理化學(xué)效應(yīng)[18]。

2.1.4 NaOH添加量對(duì)蛋白得率的影響 當(dāng)超聲功率（400 W）、超聲時(shí)間（20 min）和液固比恒定（40 ∶ 1）時(shí)，適當(dāng)提高溶液的pH值有利于增加蛋白的溶解性，因此NaOH濃度對(duì)蛋白的得率有一定的影響。圖4結(jié)果表明，隨著NaOH濃度的增加，蠶蛹蛋白的得率先增后減，當(dāng)NaOH濃度在0.3%～0.5%之間時(shí)，蛋白得率達(dá)到最高。這是因?yàn)殡S著NaOH濃度增加，溶液中OH-的數(shù)量增加，蠶蛹蛋白的溶解性也增加，但過高的NaOH濃度會(huì)造成蠶蛹蛋白的部分降解，使得浸提液中可溶性蛋白含量降低。

2.1.5 NaCl添加量對(duì)蛋白得率的影響 圖5結(jié)果表明，當(dāng)超聲功率（400 W）、超聲時(shí)間（20 min）、液固比恒定（40 ∶ 1）和NaOH濃度（0.3%）恒定時(shí)，隨著NaCl濃度的增加，蠶蛹蛋白得率先增后減，但與對(duì)照相比，無明顯增加趨勢(shì)。浸提液中NaCl濃度的增加導(dǎo)致鹽的含量增加，促進(jìn)了蛋白質(zhì)在溶液中的鹽溶作用，過高的NaCl濃度會(huì)導(dǎo)致溶液中離子強(qiáng)度過高，蛋白質(zhì)分子因帶電荷而產(chǎn)生的斥力使其溶解度降低。但在本研究中，NaCl的添加對(duì)蛋白得率并無顯著增加，因此，選擇不添加NaCl進(jìn)一步開展研究。

2.1.6 底料溫度對(duì)蛋白得率的影響 由圖6結(jié)果可以看出，當(dāng)超聲功率（400 W）、超聲時(shí)間（20 min）、液固比（40 ∶ 1）、NaOH濃度（0.3%）和NaCl添加量（0）恒定時(shí)，隨著提取體系溫度的升高，蠶蛹蛋白質(zhì)的得率下降。這可能是因?yàn)榈琢蠝囟雀?，超聲過程中還有熱量的釋放，混合液溫度再次升高，從而使蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生更加劇烈的變化，造成原來可溶的蛋白再度變性聚集。此外，溫度過高，降溫時(shí)間延長，該過程也容易引起微生物的滋生，所以綜合考慮這些因素及節(jié)約能源消耗，底料溫度應(yīng)控制在常溫（當(dāng)時(shí)室溫在16～20 ℃）。

2.2 響應(yīng)面分析優(yōu)化提取條件及試驗(yàn)結(jié)果

以影響顯著的單因素指標(biāo)超聲功率（W）、超聲時(shí)間（min）、浸提的液固比（V/m）和NaOH添加量（%）的最佳處理?xiàng)l件為中心點(diǎn)，建立超聲協(xié)助蠶蛹蛋白浸提組合設(shè)計(jì)方案（表1），該條件在超聲初始溫度為常溫、不添加NaCl的條件下進(jìn)行。

由Design-Expert7.0統(tǒng)計(jì)軟件的可知，蠶蛹蛋白制備的組合試驗(yàn)共有29個(gè)處理，試驗(yàn)結(jié)果列于表2。由數(shù)據(jù)可知，堿提法所得的蠶蛹蛋白得率在30.82%～87.03%之間。采用Design-Expert7.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，建立響應(yīng)面的回歸模型，進(jìn)而尋求最優(yōu)響應(yīng)值的因素水平。以蛋白得率為響應(yīng)值，回歸擬合后各因子對(duì)響應(yīng)值的影響用以下方程表示：

蛋白得率/%=74.73-1.12X1+1.08X2+18.29X3+7.06X4-1.91X1X2-1.52X1X3-0.38X1X4+4.38X2X3-3.65X2X4-1.07X3X4-12.81X12-8.93X22-5.17X32-7.40X42

（式中X1、X2、X3、X4為各因素水平的代碼）。

從表3可以看出，液料比和NaOH添加量對(duì)蛋白得率影響顯著（p<0.05），超聲功率和時(shí)間對(duì)蛋白得率影響不顯著（p>0.05）。此外，各因素對(duì)蛋白得率的影響大小依次為：X3>X4>X1>X2。由表4可知：回歸方程的R2=0.926 5，失擬項(xiàng)不顯著（1.013 7>0.100 0），說明回歸方程的擬合程度較好，模型是顯著的?；貧w模型的F-檢驗(yàn)顯著，說明所擬合的二次回歸方程合適，該模型的預(yù)測(cè)值和實(shí)際值比較接近。

對(duì)超聲協(xié)助制備蠶蛹蛋白的蛋白得率的模型進(jìn)行數(shù)學(xué)分析，優(yōu)化的最佳處理?xiàng)l件為超聲功率391 W、超聲時(shí)間20.1 min、浸提的液固比（V/m）59.4 ∶ 1和NaOH添加量0.308%，所得到蛋白得率為87.97?？紤]到可操作性，本研究選擇超聲功率400 W、超聲時(shí)間20 min、浸提的液固比（V/m）60 ∶ 1和NaOH添加量0.3%等條件對(duì)上述模型進(jìn)行驗(yàn)證，獲得的蛋白得率為88.14%，驗(yàn)證結(jié)果與理論預(yù)測(cè)值接近。

2.3 蠶蛹蛋白的主要化學(xué)指標(biāo)

利用優(yōu)化工藝制備的蠶蛹蛋白的粗蛋白含量達(dá)92.30%，灰分含量4.19%，沒有檢測(cè)出粗脂肪，外觀淡黃，無明顯的蛹臭味，具有較好的感官色澤。

蛋白質(zhì)的氨基組成和比例往往決定了它的性質(zhì)和品質(zhì)，本研究制備的蠶蛹蛋白的氨基酸含量及評(píng)分見表6，結(jié)果表明：蠶蛹蛋白的氨基酸評(píng)分均相對(duì)較高，接近甚至超過了FAO/WHO推薦標(biāo)準(zhǔn)[19]，因此可以作為食品基料來使用。

3 討論與結(jié)論

超聲波作為一種物理的手段和工具，有助于提取過程中蛋白的溶出，從而提高蠶蛹蛋白的得率。試驗(yàn)得到的超聲協(xié)助堿法制備蠶蛹蛋白的數(shù)學(xué)模型，堿法制備蠶蛹蛋白的浸提條件中，液固比（V/m）和NaOH濃度對(duì)蠶蛹蛋白的得率影響顯著；通過響應(yīng)面優(yōu)化獲得蠶蛹蛋白的最佳制備工藝條件為：超聲功率400 W，超聲時(shí)間20 min，浸提液固比（V/m）60 ∶ 1，NaOH濃度0.3%。在此工藝條件下浸提，蛋白得率的實(shí)測(cè)值為88.14%，該得率顯著高于醇提法的8.47%[5]和普通堿提法的78.69%[6]。本研究制備的蠶蛹蛋白氨基酸比例基本符合FAO/WHO推薦標(biāo)準(zhǔn)，可以作為食品基料使用，為蠶蛹蛋白的規(guī)?；_發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

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責(zé)任編輯：沈德發(fā)