番茄SlSnRK2s基因表達(dá)在促進(jìn)葉片衰老中的作用

楊陽 唐寧 李正國

摘 要 SnRK2（sucrose non-fermenting 1一related protein kinase2）是脫落酸（ABA）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的正調(diào)控因子，廣泛參與了植物的生長發(fā)育、病蟲害防御、ABA和非生物脅迫等多種信號的應(yīng)答反應(yīng)。從番茄中分離了3個與SnRK2.2、SnRK2.3和SnRK2.6同源的基因，分別命名為SlSnRK2.2、SlSnRK2.3和SlSnRK2.6，同時構(gòu)建了SlSlSnRK2.2/2.3/2.6 RNAi載體，并通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化番茄，得到轉(zhuǎn)基因番茄植株。初步表型分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株呈葉片早衰的現(xiàn)象。通過對乙烯信號相關(guān)基因的檢測可知，轉(zhuǎn)基因植株中除了ERF2表達(dá)量低于野生型，其余3個基因（ACO4、ERF1B、ERF1）的表達(dá)量均高于野生型，表明SlSnRK2.2、SlSnRK2.3和SlSnRK2.6與葉片衰老有關(guān)，可能參與ABA和乙烯信號互作，此結(jié)果對揭示植物衰老機(jī)理具有重要意義。

關(guān)鍵詞 SnRK2s；ABA；乙烯；葉片衰老；RNAi

中圖分類號 Q943.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

脫落酸（abscisic acid，ABA）是一種重要的植物激素，參與植物的干旱、鹽害、病害、高低溫等脅迫反應(yīng)，調(diào)控種子發(fā)育和休眠，影響果實成熟和氣孔關(guān)閉，促進(jìn)葉片衰老[1]。然而ABA信號通路是一個復(fù)雜的系統(tǒng)，2009年以前，人類對它的調(diào)控機(jī)制和途徑尚不是很清楚，直到2個獨立的研究小組發(fā)現(xiàn)了ABA受體，才使得ABA的相關(guān)研究取得突破性進(jìn)展[2-3]。ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑主要包括3個核心成分：ABA受體——PYR/PYL/RCAR，負(fù)調(diào)控因子——2C類蛋白磷酸酶（PP2C）和正調(diào)控因子--SNF1相關(guān)蛋白激酶2（SnRK2）， 它們共同構(gòu)成一個雙重負(fù)調(diào)控系統(tǒng)[4]。

SnRK2（SNF1-related protein kinase 2）屬于Ser/Thr蛋白激酶家族，為植物特有的蛋白。在擬南芥、水稻中，SnRK2s都有10個成員，分別命名為SnRK2.1～SnRK2.10和SAPK1～SAPK10[5-6]。根據(jù)被ABA和NaCl誘導(dǎo)情況的不同，SnRK2s可以分為3個亞類，第三亞類包括SnRK2.2、SnRK2.3和SnRK2.6，能被滲透脅迫和ABA迅速誘導(dǎo)，在ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮了重要的作用[7]。除此之外，研究還發(fā)現(xiàn)SnRK2Ⅲ類基因具有如下功能：擬南芥的3個突變體srk2d/srk2e/srk2i對干燥的敏感性增強(qiáng)，對ABA敏感性降低，種子萌發(fā)率雖然提高，但是在生長過程中有缺陷[8]；超表達(dá)SnRK2.6 不僅增強(qiáng)了植物的含糖量、抗鹽性，還能使植株長得更茂盛[9-10]。

然而以往的研究大多數(shù)都集中于SnRK2Ⅲ類基因?qū)BA的敏感性、種子萌發(fā)、抗逆性方面的影響，而關(guān)于其對植物生長發(fā)育的影響及其他信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究較少。本研究構(gòu)建了SlSlSnRK2.2/2.3/2.6 RNAi干擾載體，通過轉(zhuǎn)基因植株對SlSnRK2.2，SlSnRK2.3和SlSnRK2.6的表達(dá)進(jìn)行分析，探究了SlSnRK2s對植物生長發(fā)育和其它信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

野生型番茄（Solanum lycopersicum， cv Micro Tom）于溫室內(nèi)種植，種植條件為：光照16 h，溫度（25±2）℃；黑暗8 h，（20±2）℃，濕度80%左右。大腸桿菌JM109和農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞由本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 SlSnRK2s基因的序列分析 從NCB1數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/）獲得研究報道的擬南芥SnRK2.2、SnRK2.3和SnRK2.6序列，將其提交到番茄EST數(shù)據(jù)庫（http：//solgenomics.net/tools/blast/index.pl）中對比，尋找同源序列，利用DNAMAN分析其開放閱讀框，比較番茄中SlSnRK2s的氨基酸序列與其他物種中該蛋白的同源性；經(jīng)Conserved Domain Search Service（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）及SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）分析蛋白保守域；利用MEGA4.0軟件中的Neighbor-Joining（N-J）方法構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.2.2 構(gòu)建RNAi 表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化番茄 （1）番茄總RNA的提取及cDNA的合成：采用Trizol法提取番茄葉片RNA，稀釋50倍后測其OD260/OD280，經(jīng)凝膠電泳驗證質(zhì)量后保存?zhèn)溆?。? μg RNA為模板，參照Revert AidTM First Stand cDNA Synthesis Kit說明書合成第1鏈cDNA，其反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物保存于-20 ℃。

（2）擴(kuò)增SlSnRK2s共同保守片段：分析SlSnRK2.2、SlSnRK2.3和SlSnRK2.6的共同保守序列，在保守序列內(nèi)設(shè)計RNAi引物，以保存的cDNA為模板，擴(kuò)增正向和反向2段保守序列。PCR反應(yīng)體系為：PCR Mixture（2×）12.5 μL，正反引物（正向F：5′-TCTAGACTCTAATGCGGGGCGCT

（3）構(gòu)建RNAi表達(dá)載體：正向引物加的接頭為XbaⅠ和SalⅠ的酶切位點。首先將本實驗保存的pcambia-HP干擾載體的質(zhì)粒和正向片段用這2種酶進(jìn)行雙酶切，再用T4 DNA連接酶連接。連接產(chǎn)物經(jīng)電泳回收后轉(zhuǎn)化大腸桿菌。將長出來的單菌落進(jìn)行PCR檢測和酶切鑒定，保存驗證為陽性的轉(zhuǎn)化子菌液，參照質(zhì)粒提取試劑盒說明書提取質(zhì)粒。

反向引物加的接頭為SmaⅠ和SacⅠ的酶切位點，因此先將反向保守片段和上一步得到的陽性轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒用這2種酶進(jìn)行酶切處理，分別經(jīng)電泳回收后再連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選出陽性轉(zhuǎn)化子并提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101。

（4）轉(zhuǎn)基因植株的獲得及檢測：采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法[11]轉(zhuǎn)化野生型番茄獲得再生植株。經(jīng)GUS染色初步篩選出轉(zhuǎn)基因植株后，通過熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)基因植株抑制干擾程度。定量引物見表1。具體操作按照SYBR Green/ROX Master Mix試劑盒（Fermentas），儀器是Bio-Rad熒光定量PCR儀。以番茄組成型表達(dá)基因actin為內(nèi)參，每個反應(yīng)設(shè)置3次重復(fù)，Ct值取平均值，以2-△△Ct法計算相對表達(dá)量。反應(yīng)體系為（25 μL）：2 ×SYBR Green/ROX Master Mix 12.5 μL，正反引物（5 μmol/L）各1 μL，模板1 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 30 s，1個循環(huán)；95 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s， 42個循環(huán)。

1.2.3 乙烯相關(guān)基因定量分析 收取確定為轉(zhuǎn)基因植株的T0代種子栽種培養(yǎng)，并在T1代轉(zhuǎn)基因植株中檢測乙烯相關(guān)基因ACO4、ERF1B、ERF1、ERF2的表達(dá)水平，以野生型番茄為對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 SlSnRK2s序列分析

將SlSnRK2s基因的氨基酸序列與其他物種進(jìn)行同源性比較，從中可以看出所推測的氨基酸序列含有磷酸化位點、活性環(huán)和SnRK2s保守區(qū)（SnRK2 box）。黑色區(qū)域表示完全相同的氨基酸殘基，灰色區(qū)域表示50%以上相同，橫線區(qū)域表示活性環(huán)，是蛋白激酶磷酸化的靶位點，虛線區(qū)域是SnRK2 box，“+”號表示可能的磷酸化氨基酸殘基。

用MEGA4.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，使用的是最小進(jìn)化法，可以看出SlSnRK2.6與擬南芥中的AtSnRK2.6同源性最高，達(dá)99%；SlSnRK2.2與玉米的ZmSnRK2.3同源性較高；SlSnRK2.3與擬南芥中的AtSnRK2.2和AtSnRK2.3同源性較高。SlSnRK2.2，SlSnRK2.3，SlSnRK2.6屬于SnRK2家族的第3亞類。

2.2 構(gòu)建SlSnRK2s RNAi 表達(dá)載體

利用設(shè)計的特異性引物擴(kuò)增SlSnRK2s共同保守序列，得到正向和反向2個片段，大小為385 bp，回收目標(biāo)片段。將正向片段與載體連接后先用PCR驗證是否插入，再用XbaⅠ和SalⅠ雙酶切驗證插入方向。將得到的陽性重組子再與反向片段連接，通過PCR和SmaⅠ、SacⅠ酶切驗證后，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌最終得到正確的陽性重組子，如圖3-B。

2.3 轉(zhuǎn)基因番茄鑒定及分析

2.4 轉(zhuǎn)基因植株葉片衰老初步分析

試驗觀察到T0代轉(zhuǎn)基因植株有早衰現(xiàn)象，并且在T1代這種現(xiàn)象仍然存在。檢測了ACO4、ERF1B、ERF1和ERF2的相對表達(dá)情況，結(jié)果見圖6[n=3，0.05>p>0.01（*）或者p<0.01（**）]。在轉(zhuǎn)基因植株中，ACO4、ERF1B、ERF1的表達(dá)量都高于野生型番茄，而ERF2低于野生型。

3 討論與結(jié)論

引起葉片衰老的成因很多，葉片衰老不僅受到周圍環(huán)境的影響，也受到內(nèi)部信號的調(diào)控，植物激素就是影響因素之一。生長素、細(xì)胞分裂素、赤霉素能減緩葉片衰老，而乙烯和脫落酸則加速葉片衰老。

乙烯可促進(jìn)衰老，是典型的促衰激素。S-腺苷甲硫銨酸在ACC合成酶和ACC氧化酶的催化下形成乙烯[12]。乙烯響應(yīng)元件結(jié)合蛋白（ERF轉(zhuǎn)錄因子）處于乙烯信號通路的下游，能識別乙烯合成基因的啟動子，激活相關(guān)基因表達(dá)，促進(jìn)乙烯合成[13]。ABA可誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉，是僅次于乙烯的第二個促衰劑，它對衰老的作用體現(xiàn)在基因轉(zhuǎn)錄水平上，表現(xiàn)為直接控制mRNA合成，或者影響mRNA的穩(wěn)定性，在翻譯水平上控制基因表達(dá)[14]。SlSnRK2.2、SlSnRK2.3和SlSnRK2.6與擬南芥中的SnRK2.2、SnRK2.3和SnRK2.6同源，屬于SnRK2 Ⅲ亞類，參與ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[7]，進(jìn)而可能調(diào)控植物衰老。本研究構(gòu)建了SlSnRK2s RNAi載體，得到的轉(zhuǎn)基因植株中有葉片早衰現(xiàn)象，同時，ACO4、ERF1B和ERF1在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)量均高于野生型，特別是ACO4和ERF1B表達(dá)量明顯上升，促進(jìn)了乙烯的合成，加速葉片衰老，表明SlSnRK2s與葉片衰老有關(guān)。

另外有研究報道，乙烯信號通路與ABA信號通路有一定的交叉互作，比如ERF家族中的一些基因就位于信號交叉途徑中，作為連接因子促進(jìn)ABA和乙烯協(xié)同調(diào)節(jié)[15]。由此初步推測SlSnRK2.2、SlSnRK2.3和SlSnRK2.6可能與ABA和乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的互作有關(guān)，但具體作用方式及機(jī)制需要后續(xù)的深入研究。

本研究揭示了SlSnRK2s基因的表達(dá)與植物衰老之間有著密切的聯(lián)系，對進(jìn)一步從分子水平上闡明其發(fā)生過程和作用機(jī)制具有重要作用，同時為植物衰老的調(diào)控技術(shù)提供重要的理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1] Leung J， Giraudat J. Abscisic acid signal transduction[J]. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology， 1998， 49： 199-222.

[2] Ma Y， Szostkiewicz I， Korte A， et al. Regulators of PP2C phosphatase activity function as abscisic acid sensors[J]. Science， 2009， 324（5 930）： 1 064-1 068.

[3] Park S Y， Fung P， Nishimura N， et al， Abscisic acid inhibits type 2C protein phosphatases via the PYR/PYL family of START proteins[J]. Science， 2009， 324（5 930）： 1 068-1 071.

[4] Fujii H， Chinnusamy V， Rodrigues A， et al. In vitro reconstitution of an abscisic acid signalling pathway[J]. Nature， 2009， 462： 660- 664.

[5] Hrabak E M， Chan C W M， Gribskov M， et al. The Arabidopsis CDPK-SnRK superfamily of protein kinases[J]. Plant Physiology， 2003， 132（2）： 666-680.

[6] Kobayashi Y， Yamamoto S， Minami H， et al. Differential activation of the rice sucrose nonfermenting 1-related protein kinase2 family by hyperosmotic stress and abscisic acid[J]. Plant Cell， 2004， 16（5）： 1 163-1 177.

[7] Boudsocq M， Barbier-Brygoo H， Laurière C. Identification of nine sucrose nonfermenting 1-related protein kinases 2 activated by hyperosmotic and saline stresses in Arabidopsis thaliana[J]. Journal of Biological Chemistry， 2004， 279（40）： 41 758-41 766.

[8] Nakashima K， Fujita Y， Kanamori N， et al. Three Arabidopsis SnRK2 protein kinases， SRK2D/SnRK2.2，SRK2E/SnRK2.6/OST1 and SRK2I/SnRK2.3， involved in ABA signaling are essential for the control of seed development and dormancy[J]. Plant& Cell Physioogy， 2009， 50（7）： 1 345-1 363.

[9] Zheng Z， Xu X P， Rodney A， et al. The protein kinase SnRK2.6 mediates the regulation of sucrose metabolism and plant growth in Arabidopsis[J]. Plant Physiology， 2010， 153（1）： 99-113.

[10] Ying S， Zhang D F， Li H Y， et al. Cloning and characterization of a maize SnRK2 protein kinase gene confers enhanced salt tolerance in transgenic Arabidopsis[J]. Plant Cell Reports， 2011， 30（9）： 1 683-1 699.

[11] Fillatti J J， Kiser J， Rose R， et al. Efficient transfer of a glyphosate tolerance gene into tomato using a binary Agrobacterium tumefaciens vector[J]. Nature Biotechnology， 1987， 5： 726-730.

[12] Adams D O， Yang S F. Ethylene biosynthesis： identification of 1-aminocy clobutance-1-carboxylic acid as an intermediate in the conversion of methionine to ethylene[J]. Proc Natl Acad sci USA， 1979， 76（1）： 170-174.

[13] Park J M， Park C J， Lee S B， et al. Overexpression of the tobacco Tsi1 gene encoding an EREBP/AP2-type transcription factor enhances resistance against pathogen attack and osmotic stress in tobacco[J]. Plant Cell， 2001， 13（5）： 1 035-1 046.

[14] Nooden L D， Guiamet J J， John I. Senescence mechanisms[J]. Physiol Plant， 1997， 101（4）： 746-753.

[15] Fujita M， Fujita Y， Noutoshi Y， et al. Crosstalk between abiotic and biotic stress responses： a current view from the points of convergence in the stress signaling networks[J]. Current Opinion in Plant Biology，2006，9（4）：436-442.

責(zé)任編輯：林海妹