干旱脅迫對中粒種咖啡幼苗膜脂過氧化、抗氧化酶活性和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

楊華庚 顏速亮 陳慧娟 鄧志聲

摘 要 以苗齡約8個(gè)月的中粒種咖啡袋育苗為材料，測定3種干旱脅迫強(qiáng)度下咖啡幼苗葉片的生理指標(biāo)變化，旨在了解其對干旱脅迫的生理響應(yīng)。結(jié)果表明：在輕度干旱脅迫下（土壤相對含水量為55%～60%），與對照相比，中粒種咖啡幼苗葉片的可溶性蛋白、可溶性糖、脯氨酸含量、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）活性極顯著增加，而丙二醛（MDA）含量和相對電導(dǎo)率沒有顯著變化。但在中度干旱或重度干旱脅迫下（土壤相對含水量為40%～45%或25%～30%），可溶性蛋白含量、SOD、POD、CAT活性顯著或極顯著減少，而可溶性糖、脯氨酸的積累減緩，MDA含量和相對電導(dǎo)率迅速上升。在適度干旱脅迫下，中粒種咖啡幼苗可通過提高抗氧化酶活性和滲透調(diào)節(jié)能力來增強(qiáng)其對干旱脅迫的耐性。

關(guān)鍵詞 中粒種咖啡；干旱脅迫；抗氧化作用；滲透調(diào)節(jié)；膜脂過氧化；質(zhì)膜透性

中圖分類號(hào) S571.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

水分虧缺是影響咖啡生產(chǎn)的主要環(huán)境脅迫因子[1]。干旱不僅影響咖啡的生長發(fā)育，還會(huì)造成咖啡的大幅度減產(chǎn)及品質(zhì)下降，給生產(chǎn)帶來重大損失。據(jù)報(bào)道，2010年4月下旬，由于嚴(yán)重干旱，有近1.60 萬hm2的咖啡樹受害，約占云南當(dāng)年咖啡種植面積的60%，造成的經(jīng)濟(jì)損失近6億元[2]。冬春干旱和夏秋間歇干旱在中國咖啡種植區(qū)普遍發(fā)生，對中國咖啡生產(chǎn)造成不同程度的影響，是中國咖啡生產(chǎn)上不可忽視的重要問題。因此，研究咖啡的抗旱性對中國咖啡生產(chǎn)具有重要意義。水分虧缺影響咖啡植株的生理生態(tài)過程，已有研究結(jié)果表明，在干旱脅迫下，咖啡植株凈光合速率下降[3-4]，PSII有效光量子產(chǎn)額和電子傳遞活性減弱[5]，光抑制增強(qiáng)[3]，碳代謝酶活性發(fā)生變化，糖類物質(zhì)增加而淀粉含量減少[1-3]，蒸騰作用降低，葉水勢減少[4]，膜脂過氧化作用加劇[6]，抗氧化酶活性增強(qiáng)[5，7]。目前，相關(guān)研究較多集中于干旱脅迫對咖啡光合作用的影響，而缺乏對干旱脅迫下咖啡植株的抗氧化和滲透調(diào)節(jié)機(jī)制的系統(tǒng)深入研究。為此，本試驗(yàn)采用人工控水的方法設(shè)置不同的土壤水分梯度，研究不同干旱脅迫強(qiáng)度對中粒種咖啡幼苗的抗氧化酶活性、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量、膜脂過氧化、質(zhì)膜透性的影響，旨在了解中粒種咖啡幼苗對干旱脅迫的生理響應(yīng)，為中粒種咖啡栽培的水分管理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

從中粒種咖啡無性系興隆24-2植株上采摘充分成熟的果實(shí)，去除果肉后取出咖啡豆，經(jīng)洗滌、適當(dāng)晾干后，在砂床中播種催芽。當(dāng)種子萌發(fā)至子葉平展后移入裝有等量培養(yǎng)土的育苗缽中，育苗缽的規(guī)格為口徑寬10 cm，高12 cm，培養(yǎng)土按腐熟牛糞 ∶ 壤土 ∶ 沙土=2 ∶ 7 ∶ 1進(jìn)行配制，每缽定植咖啡苗1株。在育苗過程中，給予適當(dāng)?shù)氖a蔽，做好正常的水肥管理。當(dāng)幼苗經(jīng)8個(gè)月左右的生長，高約10 cm，有8片葉左右時(shí)，選取株齡、生長一致的咖啡幼苗120株，參照Hsiao[8]的方法劃分，對其進(jìn)行4種水分處理：對照（土壤相對含水量為75%～80%）、輕度干旱脅迫（土壤相對含水量為55%～60%）、中度干旱脅迫（土壤相對含水量為40%～45%）、重度干旱脅迫（土壤相對含水量為25%～30%）。每處理重復(fù)5次，每重復(fù)6缽苗。干旱脅迫前，對各苗缽進(jìn)行充分澆水，待缽內(nèi)水分自然消耗至設(shè)定土壤含水量標(biāo)準(zhǔn)范圍后，每天早上8： 00和傍晚18： 00用稱重補(bǔ)水法控制土壤含水量在設(shè)定范圍內(nèi)，維持2 d后結(jié)束脅迫處理。隨即采摘幼苗植株頂端往下第2片成熟葉測定相關(guān)生理指標(biāo)。在試驗(yàn)期間，苗木生長的室內(nèi)環(huán)境溫度處于24～30 ℃范圍內(nèi)，相對濕度處于60%～75%范圍內(nèi)。

1.2 生理指標(biāo)測定

粗酶液提?。悍Q取葉樣0.5 g放入研缽內(nèi)，加入少量經(jīng)預(yù)冷的50 mmol/L pH7.8磷酸緩沖液（內(nèi)含1%PVP），在冰浴上研磨，磨成勻漿后移入離心管內(nèi)，使提取液終體積為5 mL。將提取液放置于4 ℃ 11 000 ×g冷凍離心機(jī)內(nèi)離心20 min，上清液用于SOD、POD、CAT 活性、可溶性蛋白質(zhì)含量的測定。酶活性的測定：SOD活性采用氮藍(lán)四唑（NBT）法[9]測定，以抑制NBT光化還原的50%為1個(gè)酶活性單位；POD活性采用分光光度計(jì)法[10]測定，以每分鐘吸光度增加0.01的酶量為1個(gè)酶活單位（U）；CAT活性采用紫外吸收法[11]測定，以每分鐘吸光度減少0.01的酶量為1個(gè)酶活單位（U）。質(zhì)膜透性采用電導(dǎo)率儀法[12]測定，MDA含量采用硫代巴比妥酸法[11]測定，脯氨酸含量采用茚三酮法[9]測定，可溶性糖含量采用蒽酮比色法[9]測定，可溶性蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法[9]測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel軟件進(jìn)行整理分析，采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件中的Duncan法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫對咖啡幼苗膜脂過氧化和質(zhì)膜透性的影響

MDA是膜脂過氧化的主要產(chǎn)物之一，其含量高低反映了膜脂過氧化作用的強(qiáng)弱。相對電導(dǎo)率是衡量質(zhì)膜透性大小的指標(biāo)，其數(shù)值的大小反映了質(zhì)膜受損的程度。由圖1和圖2可知，MDA含量和相對電導(dǎo)率隨干旱脅迫強(qiáng)度的增加呈上升的趨勢。輕度干旱脅迫時(shí)，MDA含量比對照的增加了7.03%，但兩者間差異不顯著。隨著干旱脅迫程度的進(jìn)一步加深，MDA含量顯著增加。中度干旱脅迫和重度干旱脅迫時(shí)，MDA含量分別比對照的增加了17.48%和33.87%。輕度干旱脅迫時(shí)，相對電導(dǎo)率略有降低，只比對照的下降了1.11%，但兩者間差異不顯著。隨著干旱脅迫強(qiáng)度的進(jìn)一步增加，相對電導(dǎo)率極顯著上升。中度干旱脅迫和重度干旱脅迫時(shí)，相對電導(dǎo)率分別比對照的增加了1.21、2.58倍。不斷加大的干旱脅迫強(qiáng)度，促進(jìn)了咖啡幼苗膜脂過氧化和質(zhì)膜的損傷。

2.2 干旱脅迫對中粒種咖啡幼苗抗氧化酶活性的影響

SOD、POD和CAT是清除活性氧毒害的重要抗氧化酶。其中，SOD處于核心酶的地位，催化O2·- 發(fā)生歧化反應(yīng)生成H2O2，而生成的H2O2則由POD和CAT清除。輕度干旱脅迫時(shí)，SOD、POD和CAT活性迅速增強(qiáng)，分別比對照的增加了37.52%、42.59%和1.41倍，差異達(dá)極顯著水平。隨著干旱脅迫強(qiáng)度的進(jìn)一步增加，SOD、POD和CAT活性顯著或極顯著下降。重度干旱脅迫時(shí)，SOD、POD活性顯著或極顯著低于對照水平，分別比對照的下降了13.07%、56.36%，而CAT活性仍極顯著高于對照水平，比對照的增加了43.59%。SOD、POD和CAT活性的提高起到了保護(hù)咖啡幼苗免受活性氧毒害的作用。

2.3 干旱脅迫對中粒種咖啡幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸是植物細(xì)胞內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在逆境脅迫中發(fā)揮滲透調(diào)節(jié)作用。輕度干旱脅迫時(shí)，可溶性蛋白含量極顯著增加，比對照的增加了4.74%。隨著干旱脅迫強(qiáng)度的進(jìn)一步增加，可溶性蛋白含量顯著或極顯著下降。重度干旱脅迫時(shí)，可溶性蛋白含量略比對照的下降了0.59%，但兩者間差異不顯著。輕度干旱脅迫時(shí)，脯氨酸含量極顯著增加，比對照的增加了35.40%。隨著干旱脅迫強(qiáng)度的不斷增加，脯氨酸積累趨緩，中度干旱或重度干旱脅迫時(shí)，脯氨酸含量分別比輕度干旱脅迫的增加了8.29%和9.94%，但3種脅迫處理間差異不顯著。干旱脅迫下，隨著脅迫強(qiáng)度的加深，可溶性糖分含量顯著增加；但在重度干旱脅迫時(shí)，可溶性糖含量增幅趨緩，此時(shí)可溶性糖含量僅比中度干旱脅迫的增加了7.54%，且兩者間差異不顯著。綜上所述，干旱脅迫下，可溶性蛋白、脯氨酸和可溶糖的積累，提高了咖啡幼苗的滲透調(diào)節(jié)能力。

3 討論與結(jié)論

干旱脅迫對植物的危害首先表現(xiàn)在對質(zhì)膜系統(tǒng)的傷害，而膜脂過氧化和質(zhì)膜相對透性則反映了質(zhì)膜受損傷的過程。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，干旱脅迫下，膜脂過氧化加劇，質(zhì)膜透性明顯增大，是導(dǎo)致中粒種咖啡幼苗嚴(yán)重受害的重要原因之一。這與在小粒種咖啡的研究結(jié)果[6]一致。

干旱脅迫下，自由基的產(chǎn)生與清除機(jī)制失衡，O2·- 和H2O2等活性氧大量積累[13-15]。此時(shí)，維持較高的SOD、POD、CAT活性，有利于抑制O2·- 和H2O2的積累，防止膜系統(tǒng)遭受嚴(yán)重破壞，從而有利于增強(qiáng)植株的耐旱性[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在輕度干旱脅迫下，中粒種咖啡幼苗的SOD、POD、CAT活性極顯著增強(qiáng)，三者協(xié)同作用，極大地提高了清除活性氧的能力，從而減緩了膜脂過氧化，使質(zhì)膜系統(tǒng)損傷輕微，表現(xiàn)為MDA含量和相對電導(dǎo)率并沒有顯著的變化。Pinheiro等[7]也報(bào)道了干旱脅迫下中粒種咖啡的SOD、POD、CAT活性增強(qiáng)的結(jié)果。隨著干旱脅迫強(qiáng)度超出咖啡幼苗自身的抵御能力時(shí)，活性氧的代謝平衡遭到破壞，過量積累的活性氧對酶結(jié)構(gòu)造成損傷，使SOD、POD、CAT活性顯著或極顯著降低。由于不能有效地清除過量的活性氧，從而導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)及核酸、脂類和蛋白質(zhì)分子的氧化破壞，引發(fā)或加劇膜脂過氧化作用，使質(zhì)膜的流動(dòng)性降低，滲漏量增加，膜蛋白、失活受體、酶和離子通道遭受損傷，破壞了質(zhì)膜的結(jié)構(gòu)和功能，影響了細(xì)胞內(nèi)各種生理代謝的正常進(jìn)行，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡[16]，咖啡植株受害日趨嚴(yán)重，甚至死亡。董建華等[6]研究表明，隨著干旱脅迫天數(shù)的增加，小粒種咖啡幼苗的POD活性不斷上升。這與本研究結(jié)果不同，可能與試驗(yàn)材料和方法有關(guān)。

可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸作為重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，能增加細(xì)胞內(nèi)的溶質(zhì)濃度，降低植物體內(nèi)的滲透勢和水勢，防止細(xì)胞脫水，有利于細(xì)胞保水和維持一定的膨壓，以保證正常生理代謝活動(dòng)的進(jìn)行[17]。此外，可溶性糖和脯氨酸還起到了清除活性氧（ROS），保持膜結(jié)構(gòu)完整性的作用[18]。本實(shí)驗(yàn)中，輕度干旱脅迫時(shí)，可溶性蛋白、可溶性糖和脯氨酸含量極顯著增加，有助于降低咖啡幼苗細(xì)胞的滲透勢，增強(qiáng)細(xì)胞的防脫水和保水能力，從而維持了細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性，這是中粒種咖啡幼苗主動(dòng)防御干旱脅迫的適應(yīng)性反應(yīng)。隨著干旱脅迫強(qiáng)度的進(jìn)一步增加，咖啡幼苗的可溶性蛋白含量顯著下降，而可溶性糖和脯氨酸的積累趨緩。這表明在嚴(yán)重干旱脅迫下，咖啡幼苗的可溶性蛋白、可溶性糖和脯氨酸的積累機(jī)制受到了嚴(yán)重破壞，從而減弱了滲透調(diào)節(jié)對咖啡幼苗的保護(hù)作用，使咖啡幼苗受害趨于嚴(yán)重。輕度干旱脅迫可能誘導(dǎo)了咖啡幼苗的脅迫應(yīng)答基因的表達(dá)[19-20]，合成了包括抗旱防御蛋白在內(nèi)的差異蛋白[21-24]，從而增加了可溶性蛋白含量。然而在重度干旱脅迫下，由于蛋白水解酶活性提高，加快了蛋白質(zhì)的水解[25]，并抑制了蛋白質(zhì)的合成活性，使蛋白質(zhì)合成量減少，導(dǎo)致可溶性蛋白含量顯著下降。干旱脅迫可能通過增強(qiáng)谷氨酰胺合成酶活性[23]，減弱脯氨酸氧化酶活性[26]來促進(jìn)咖啡幼苗葉片脯氨酸的積累；也可能通過增強(qiáng)淀粉磷酸化酶和蔗糖磷酸合成酶活性，降低轉(zhuǎn)化酶活性[27]來增加咖啡幼苗葉片可溶性糖的積累。董建華等[6]研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫下，小粒種咖啡幼苗可溶性蛋白含量不斷下降，而脯氨酸含量持續(xù)上升。Praxedes等[1]研究表明，在干旱脅迫下，耐旱性強(qiáng)的中粒種咖啡無性系的可溶性糖含量顯著增加，而其余無性系的可溶性糖含量均無顯著變化。上述結(jié)果表明，可溶性糖和脯氨酸是咖啡植株抵御干旱脅迫的2種重要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，可在一定程度上緩解干旱脅迫對咖啡植株所造成的傷害。

綜上所述，在輕度干旱脅迫下，中粒種咖啡幼苗通過增強(qiáng)抗氧化酶活性和滲透調(diào)節(jié)能力來主動(dòng)防御干旱危害，以維持其正常的生長發(fā)育。隨著干旱脅迫強(qiáng)度的增加，咖啡幼苗的防御機(jī)制受到削弱，甚至受到嚴(yán)重破壞，植株受害日趨嚴(yán)重?？梢?，中粒種咖啡幼苗對干旱脅迫較敏感。在生產(chǎn)上，可通過維持輕度干旱脅迫來提高咖啡植株的抗旱能力，以增強(qiáng)在干旱條件下的生長適應(yīng)性。

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責(zé)任編輯：黃東杰