柑橘黃龍病可視化LAMP檢測(cè)技術(shù)的建立及應(yīng)用

王賢達(dá) 林雄杰 胡菡青等

摘 要 建立柑橘黃龍病（HLB）可視化環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）檢測(cè)方法，為HLB的快速檢測(cè)提供有力的技術(shù)支持。根據(jù)LAMP技術(shù)原理，針對(duì)柑橘黃龍病菌16S rDNA靶序列的6個(gè)位點(diǎn)設(shè)計(jì)4條特異性引物，通過(guò)對(duì)反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化，并在反應(yīng)前的體系中加入1 ∶ 10的鈣黃綠素（calcein）和氯化錳（MnCl2）混合液作為熒光顯色劑，建立可視化LAMP檢測(cè)技術(shù)，同時(shí)對(duì)該技術(shù)的特異性、靈敏度和樣品檢測(cè)進(jìn)行了測(cè)試。該檢測(cè)方法具有很高的特異性，反應(yīng)體系中除了HLB具有特異性的擴(kuò)增，產(chǎn)生黃綠色熒光擴(kuò)增產(chǎn)物，其他供試菌株均無(wú)特異擴(kuò)增。對(duì)柑橘黃龍病菌總DNA的檢測(cè)限為1.51×10-3 ng/μL，而對(duì)含有目的基因的CG-pMD18-T質(zhì)粒DNA的檢測(cè)限為2.12×10-6 ng/μL，與定量PCR靈敏度相當(dāng)，而比常規(guī)PCR靈敏度高1 000倍。利用可視化LAMP技術(shù)和定量PCR對(duì)來(lái)自漳州、南平、福州等地的樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果2種技術(shù)的檢出率均為76.7%，符合率達(dá)到100%。

關(guān)鍵詞 柑橘黃龍病菌；鈣黃綠素；環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）；可視化

中圖分類(lèi)號(hào) S436.66 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

柑橘黃龍?。–itrus Huanglongbing，HLB）是世界柑橘生產(chǎn)上的毀滅性病害，該病害是由一種限于韌皮部?jī)?nèi)寄生的革蘭氏陰性細(xì)菌引起，能夠侵染包括柑橘屬（Citrus spp.）、枳屬（Poncirus trifoliata）、金柑屬（Fortunella spp.）和九里香（Murraya paniculata）等多種蕓香科植物[1]。柑橘感染黃龍病菌后，病害迅速蔓延，3～13年果園內(nèi)95%的植株將被感染而發(fā)病[2]；發(fā)病植株葉片大量脫落，樹(shù)勢(shì)減弱、產(chǎn)量降低、果質(zhì)變差[3]；一般，柑橘樹(shù)的經(jīng)濟(jì)壽命可達(dá)幾十年，甚至上百年，但是感染黃龍病后，柑橘樹(shù)勢(shì)衰退，經(jīng)濟(jì)壽命大大縮減，大約僅有十年左右[4]。中國(guó)有柑橘栽培的19個(gè)省、區(qū)已有11個(gè)受到嚴(yán)重的黃龍病害威脅[5]。對(duì)于黃龍病菌的培養(yǎng)，最早于20個(gè)世紀(jì)80年代就有報(bào)道[6-7]，但并未得到認(rèn)可；Davis等[8]和Sechler等[9]分別通過(guò)共培養(yǎng)和純培養(yǎng)獲得病原菌，但是獲得的病原菌均無(wú)法完成繼代培養(yǎng)。對(duì)于柑橘黃龍病的防治主要采用抗生素，如四環(huán)素等，但經(jīng)過(guò)3～4年后，黃龍病癥狀出現(xiàn)反復(fù)[1]。Zhang等[10-11]報(bào)道1.0 g/L盤(pán)尼西林和100 mg/L鏈霉素混合液對(duì)黃龍病菌有很好的抑制作用，但作用效果持續(xù)時(shí)間并未得到驗(yàn)證。黃龍病在防治上主要采用防治傳播媒介、砍除病樹(shù)、使用無(wú)病苗等方法實(shí)現(xiàn)對(duì)病害的控制。

柑橘黃龍病的檢測(cè)主要包括傳統(tǒng)檢測(cè)和分子生物學(xué)檢測(cè)。傳統(tǒng)檢測(cè)方法不僅耗時(shí)、耗力，且檢測(cè)結(jié)果可靠性低；分子生物學(xué)方法主要包括常規(guī)PCR、巢式PCR（nest-PCR）和定量PCR（real-time PCR）等，雖然能夠較快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)出病原，但需要特定的試驗(yàn)儀器設(shè)備且檢測(cè)成本較高，不適宜基層檢驗(yàn)檢疫部門(mén)田間大規(guī)模應(yīng)用，使田間病情無(wú)法得到及時(shí)、準(zhǔn)確的檢測(cè)和有效的控制，嚴(yán)重阻礙了國(guó)內(nèi)柑橘產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。為加強(qiáng)柑橘無(wú)病苗木檢測(cè)及田間黃龍病發(fā)生動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，確保福建省柑橘產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，需建立一種經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、有效的柑橘黃龍病菌檢測(cè)方法。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)是由Notomi等[12]于2000年開(kāi)發(fā)的一種高效的核酸恒溫?cái)U(kuò)增方法。LAMP反應(yīng)在等溫條件下，短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物的大量擴(kuò)增，具有很高的特異性和靈敏度，且操作步驟簡(jiǎn)便，檢測(cè)結(jié)果可由肉眼判斷，因此更適合于基層檢驗(yàn)檢疫部門(mén)開(kāi)展工作。LAMP技術(shù)已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用在細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲(chóng)檢測(cè)中，已成功建立沙門(mén)氏菌[13-14]、金黃色葡萄球菌[15-17]、鴨瘟病毒[18]、口蹄疫病毒[19-20]、惡性瘧原蟲(chóng)[21-22]等LAMP檢測(cè)體系。目前，對(duì)LAMP檢測(cè)結(jié)果的分析方法主要包括肉眼觀察反應(yīng)液是否產(chǎn)生焦磷酸鎂鹽沉淀[23]、瓊脂糖凝膠電泳[24-25]及加入SYBR Green I是否發(fā)熒光來(lái)判斷[26-27]。LAMP反應(yīng)因其靈敏度高、產(chǎn)物量大的特點(diǎn)，使反應(yīng)過(guò)程極易受到產(chǎn)物污染而出現(xiàn)假陽(yáng)性現(xiàn)象。采用肉眼觀察焦磷酸鎂鹽沉淀方法在焦磷酸鎂鹽沉淀濃度較低時(shí)容易誤判，而其余2種分析方法雖然結(jié)果準(zhǔn)確、方便，但是都需要進(jìn)行開(kāi)蓋操作，這無(wú)疑會(huì)增加假陽(yáng)性的概率。因此，筆者通過(guò)反應(yīng)前在體系中加入適量的鈣黃綠素和氯化錳，利用1 ∶ 10的鈣黃綠素和氯化錳混合液能很好的發(fā)揮熒光顯色指示作用[28-29]，從而實(shí)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果的可視化，同時(shí)還可有效避免反應(yīng)后由于開(kāi)蓋操作而產(chǎn)生的假陽(yáng)性，建立了一種柑橘黃龍病菌的可視化快速恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn) 本研究田間試驗(yàn)于2012年在福州新店埔黨福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所試驗(yàn)基地進(jìn)行，室內(nèi)試驗(yàn)于2013年在福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑橘黃龍病研究中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1.2 試驗(yàn)材料 柑橘潰瘍病菌、大腸桿菌、根癌農(nóng)桿菌、亞洲梨火疫病菌、葡萄炭疽病菌等DNA樣品由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所提供；馬鈴薯晚疫病菌、大豆疫霉菌、辣椒疫霉菌、放線菌等DNA樣品由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供。Bst DNA Polymerase Large Fragment、10×Thermopol緩沖液購(gòu)自NEB公司；鈣黃綠素、MgSO4、MnCl2、Betaine購(gòu)自O(shè)mega公司；TWeen-20購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；2×SYBR Premix Ex TaqTM、rTaq DNA聚合酶、dNTPs、100 bp DNA Ladder Marker均購(gòu)自TaKaRa公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GeneBank中登錄的“Ca. L. asiaticus”基因組的16s r-DNA基因序列（GeneBank： KF510119.1），利用PrimerExplorer V4在線軟件（http：//primerexplorer.jp/e/）設(shè)計(jì)外引物（F3和B3）和內(nèi)引物（FIP和BIP）；引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物序列信息詳見(jiàn)表1。

1.2.2 LAMP反應(yīng)體系和反應(yīng)條件優(yōu)化 參考Xu等[30]和Bobby等[31]及LAMP反應(yīng)試劑盒推薦的體系，對(duì)反應(yīng)體系（CG-FIP/BIP、CG-F3/B3、Mg2+、dNTPs、Betaine的終濃度等）和反應(yīng)條件（反應(yīng)溫度和時(shí)間）進(jìn)行優(yōu)化。CG-FIP/BIP終濃度分別為0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 μmol/L；CG-F3/B3終濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 μmol/L；Mg2+終濃度分別為2、4、6、8、10 mmol/L；dNTPs終濃度分別為0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mmol/L；Betaine終濃度分別為0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mol/L；反應(yīng)溫度分別為57、59、61、63、65 ℃；反應(yīng)時(shí)間分別為10、20、30、40、50、60、70、80、90 min。每個(gè)因子設(shè)置3個(gè)重復(fù)，以確定最佳反應(yīng)體系及反應(yīng)條件。

1.2.3 LAMP特異性檢測(cè) 以柑橘黃龍病菌總DNA及柑橘潰瘍病菌、大腸桿菌、根癌農(nóng)桿菌、亞洲梨火疫病菌、葡萄炭疽病菌、馬鈴薯晚疫病菌、大豆疫霉菌、辣椒疫霉菌、放線菌等參試菌株的DNA為模板，以健康葉片總DNA為陰性對(duì)照、ddH2O為空白對(duì)照，采用優(yōu)化后的反應(yīng)體系及條件進(jìn)行LAMP反應(yīng)，檢測(cè)可視化LAMP方法的特異性。反應(yīng)結(jié)果分別通過(guò)肉眼觀察和1%瓊脂凝膠電泳進(jìn)行分析。

1.2.4 LAMP靈敏度檢測(cè)

（1）基因組DNA檢測(cè)靈敏度。參照試劑盒的方法，提取染病柑橘中脈總DNA，用超微量分光光度計(jì)（NanoDrop）測(cè)定總DNA濃度，取1 μL DNA按照10倍進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)?00～10-9），為了避免稀釋過(guò)程中出現(xiàn)誤差，每個(gè)梯度分別重復(fù)3次，再將每個(gè)梯度的3個(gè)重復(fù)混合，取1 μL作為模板，進(jìn)行LAMP靈敏度檢測(cè)。

（2）LAMP與普通PCR、定量PCR靈敏度比較。利用CG03F/CG05R引物擴(kuò)增含有目的基因的DNA片段[32]，回收純化PCR產(chǎn)物，并連接到pMDTM18-T載體上，構(gòu)建CG-pMD18-T重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆子進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒DNA，用超微量分光光度計(jì)（NanoDrop）測(cè)定質(zhì)粒DNA濃度，并進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)?00～10-9），方法同上。定量PCR和普通PCR的引物均為L(zhǎng)AMP的外引物（F3/B3）。常規(guī)PCR反應(yīng)體系：2×Mix 12.5 μL、CG-F3/B3 1 μL、模板1 μL，加ddH2O補(bǔ)足至25 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 3 min，95 ℃ 35 s，58 ℃ 35 s，72 ℃ 35 s，擴(kuò)增32個(gè)循環(huán)，72 ℃ 7 min。反應(yīng)產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳分析。定量PCR反應(yīng)體系：2×SYBR Premix ExTMⅡ 12.5 μL、5 μmol/L CG-F3/B3引物各 1 μL、模板DNA 1 μL，加ddH2O補(bǔ)足到25 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 35 s，95 ℃ 5 s，58 ℃ 35 s，擴(kuò)增42個(gè)循環(huán)，58 ℃同步采集熒光；溶解曲線為65 ℃開(kāi)始，每隔5 s升高0.5 ℃，連續(xù)升高60次至95 ℃結(jié)束。以上試驗(yàn)均設(shè)置3次重復(fù)。

1.2.5 樣品檢測(cè) 從福建漳州、南平、福州等地采集柑橘黃龍病疑似病例的蘆柑葉片30份，洗凈后置于4 ℃冰箱短期保存；剪取蘆柑葉片中脈0.5 g，剪碎后用液氮磨成粉末，用CTAB法提取蘆柑葉中脈總DNA：細(xì)粉加入CTAB提取液，混勻后65 ℃水浴1 h，12 000 r/min離心10 min，取上清，加入等體積氛 ∶ 氯仿 ∶ 異戊醇（25 ∶ 24 ∶ 1）提純，無(wú)水乙醇沉淀，將沉淀風(fēng)干后溶于30 μL TE（含RnaseA 50 μg/mL）中，沉淀溶解后置于-20 ℃保存、備用。

分別采用可視化LAMP和定量PCR檢測(cè)，比較2種檢測(cè)結(jié)果的檢出率和2個(gè)檢測(cè)結(jié)果間的符合率，以驗(yàn)證LAMP技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 LAMP反應(yīng)體系和反應(yīng)條件優(yōu)化

2.1.2 反應(yīng)條件優(yōu)化

（2）反應(yīng)時(shí)間。如圖2-c、d所示，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為30 min時(shí)，可以觀察到反應(yīng)液顏色由橙色變?yōu)榫G色，且瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)可見(jiàn)明顯的梯度條帶；當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為70 min時(shí)，反應(yīng)液顏色變化非常明顯，且電泳條帶也非常的清晰，為了提高試驗(yàn)效率，故確定反應(yīng)時(shí)間為70 min。

2.2 LAMP特異性檢測(cè)

2.3 LAMP靈敏度檢測(cè)

3 討論與結(jié)論

LAMP是一種在恒溫條件下，高效、特異、快速的擴(kuò)增靶標(biāo)序列的核酸擴(kuò)增技術(shù)。本研究在柑橘黃龍病菌16S r-DNA基因序列的6個(gè)位點(diǎn)設(shè)計(jì)4條引物。通過(guò)對(duì)反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了可視化LAMP檢測(cè)方法。該方法對(duì)柑橘黃龍病菌總DNA及其他參試菌株DNA進(jìn)行特異性檢測(cè)，結(jié)果表明該可視化LAMP具有良好的特異性。對(duì)柑橘黃龍病總DNA和質(zhì)粒DNA的最低檢測(cè)限分別為1.51×10-3 ng/μL和2.12×10-6 ng/μL，與定量PCR靈敏度相當(dāng)，而比常規(guī)PCR靈敏度高1 000倍。采用該方法對(duì)田間樣品進(jìn)行實(shí)測(cè)，檢測(cè)結(jié)果和real-time PCR檢測(cè)結(jié)果完全一致。

熒光顯色劑的應(yīng)用使LAMP檢測(cè)結(jié)果可視化得以實(shí)現(xiàn)。目前，在熒光顯色劑應(yīng)用的研究中多數(shù)采用SYBR Green I[33-34]，該方法需在反應(yīng)結(jié)束后打開(kāi)蓋子，加入SYBR Green I才能發(fā)揮顯色指示作用，從而判定檢測(cè)結(jié)果。黃麗等[34]在柑橘黃龍病LAMP檢測(cè)中，利用SYBR Green I指示作用實(shí)現(xiàn)了LAMP檢測(cè)結(jié)果的可視化。但是，開(kāi)蓋添加SYBR Green I時(shí)容易產(chǎn)生氣溶膠，而引起擴(kuò)增產(chǎn)物污染實(shí)驗(yàn)室，導(dǎo)致假陽(yáng)性出現(xiàn)。孔德英等[35]在柑橘黃龍病LAMP檢測(cè)中使用濁度儀實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)LAMP反應(yīng)結(jié)果，但該方法在實(shí)際操作中要使用價(jià)格昂貴的濁度儀，不利于實(shí)驗(yàn)設(shè)備較落后的實(shí)驗(yàn)室的科研人員開(kāi)展工作。筆者利用calcein與Mn2+結(jié)合而不發(fā)熒光，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，產(chǎn)生了大量更易與Mn2+結(jié)合的焦磷酸根離子，從而釋放calcein，游離的calcein可自發(fā)熒光，且Mg2+存在的環(huán)境中熒光效果得到加強(qiáng)[28，36]的原理，使用calcein+MnCl2混合液替代SYBR Green I進(jìn)行結(jié)果顯色指示，無(wú)需開(kāi)蓋，直接通過(guò)肉眼觀察顏色變化即可判定檢測(cè)陰（橙色）陽(yáng)（綠色）性結(jié)果，實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)結(jié)果的可視化，同時(shí)有效地避免了因開(kāi)蓋引起反應(yīng)產(chǎn)物污染而出現(xiàn)的假陽(yáng)性現(xiàn)象。該方法在柑橘黃龍病可視化LAMP檢測(cè)中的應(yīng)用尚屬首次，為柑橘黃龍病的檢測(cè)工作提供了有力的技術(shù)支持。

雖然本研究在柑橘黃龍病可視化LAMP檢測(cè)中獲得了比較的好結(jié)果，但是在反應(yīng)體系和反應(yīng)條件優(yōu)化等方面還存在一些不足。應(yīng)采用更加科學(xué)合理的方法（正交試驗(yàn)）等進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。由于在對(duì)可視化LAMP結(jié)果的評(píng)價(jià)中無(wú)法對(duì)其反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行量化，因此要采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)比較困難。在今后的研究中重點(diǎn)要解決如何將可視化LAMP的結(jié)果進(jìn)行量化，從而更加明確反應(yīng)體系中各組分對(duì)反應(yīng)結(jié)果的影響。

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