三明野生香蕉Ran家族基因DNA序列克隆與生物信息學(xué)分析

張雅玲 方智振 賴鐘雄

摘 要 Ran是一類廣泛存在于真核生物中的極為保守的小G蛋白。本研究從三明野生香蕉中分離得到15條Ran家族基因DNA序列，并對基因結(jié)構(gòu)、序列特征和進(jìn)化關(guān)系等進(jìn)行分析。結(jié)果表明，三明野生香蕉Ran家族基因與小果野蕉Ran家族基因高度同源，且具有大量多態(tài)性位點。三明野生香蕉Ran蛋白與其他植物Ran蛋白高度同源，帶有GTP水解結(jié)構(gòu)域、RanGAP結(jié)合結(jié)構(gòu)域和酸性尾巴等Ran蛋白的典型結(jié)構(gòu)域，與擬南芥AtRan3親緣關(guān)系最近。三明野生香蕉中存在大量的Ran家族基因，預(yù)示著Ran可能具有重要的作用。本研究結(jié)果可為研究三明野生香蕉Ran家族基因的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 野生香蕉；Ran；生物信息學(xué)

中圖分類號 S668.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

香蕉是消費量最大的重要熱帶鮮食水果[1]，面積和產(chǎn)量僅次于柑桔，具有十分重要的經(jīng)濟地位。中國香蕉主要分布于亞熱帶北緣區(qū)域，低溫是影響中國香蕉產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一個重要限制因素[2]。近年來，在中國南方亞熱帶香蕉種植區(qū)域冬春寒流頻發(fā)，導(dǎo)致香蕉減產(chǎn)、遲產(chǎn)、劣產(chǎn)，甚至絕收[3]。香蕉脅迫響應(yīng)機制的研究，可為通過栽培措施和遺傳改良提高香蕉抗性提供科學(xué)依據(jù)，具有重要的意義。

植物不同于動物，只能通過大量基因表達(dá)的重編程，表達(dá)保護(hù)性蛋白，調(diào)整自身代謝和結(jié)構(gòu)以適應(yīng)外界環(huán)境條件的變化。各種環(huán)境信號需要通過許多特異的調(diào)控蛋白傳導(dǎo)到細(xì)胞核中以啟動基因的轉(zhuǎn)錄，并將mRNA運出細(xì)胞核并翻譯成蛋白質(zhì)。特異蛋白的核質(zhì)分區(qū)是調(diào)控植物溫度脅迫，光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和抗病性等諸多發(fā)育和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的重要方式[4]。越來越多的證據(jù)表明，核質(zhì)轉(zhuǎn)運是植物響應(yīng)激素、脅迫和環(huán)境變化等的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的一個關(guān)鍵步驟[5]。

Ran是一類在真核生物細(xì)胞核質(zhì)運輸中扮演重要角色的極為保守的小G蛋白[6]。Ran與蛋白質(zhì)和RNA的核質(zhì)轉(zhuǎn)運之間密切相關(guān)。因此，Ran必然參與植物脅迫響應(yīng)。超表達(dá)OsRAN2可改變水稻對鹽脅迫的敏感性[7]。研究表明，熱脅迫和低溫脅迫可影響植物Ran蛋白的表達(dá)[8-12]。Li等[13]研究表明低磷處理可影響玉米根系中Ran B1蛋白的表達(dá)。擬南芥Ran-1蛋白參與根系對鹽脅迫響應(yīng)[14]。Yoshimura等[15]發(fā)現(xiàn)Ran蛋白與野生西瓜根系對干旱脅迫響應(yīng)有關(guān)。Zhai等[16]發(fā)現(xiàn)長期積水可導(dǎo)致作用于Ran的miRNA的表達(dá)發(fā)生變化。Lee等[17]研究表明Ran基因可通過光敏色素介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與不同光源的響應(yīng)。光脅迫可顯著降低單細(xì)胞真核藻類中Ran的表達(dá)量[18]。Chen等[11]研究發(fā)現(xiàn)超表達(dá)OsRAN2可顯著提搞水稻對冷脅迫的抗性。以上研究均表明，植物Ran與植物脅迫響應(yīng)有關(guān)。開展Ran在植物脅迫響應(yīng)過程中的作用機制研究，對于進(jìn)一步探索植物脅迫響應(yīng)調(diào)控機制和提高植物抗逆性具有重要意義。

目前，關(guān)于Ran的研究主要集中在動物上，植物Ran的研究相對較少。香蕉Ran家族基因的相關(guān)研究尚未見報道。本研究以抗寒性較強的三明野生香蕉為材料克隆Ran家族基因DNA序列，并采用生物信息學(xué)手段進(jìn)行分析，以期為進(jìn)一步研究Ran家族基因在香蕉生長發(fā)育過程中的功能與表達(dá)調(diào)控機制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

以三明野生香蕉組培苗為材料。以三明野生香蕉吸芽為外植體進(jìn)行無菌培養(yǎng)體系的建立，香蕉組培苗每2個月繼代1次，香蕉組培苗的培養(yǎng)與繼代參照張銳[19]的方法。

1.2 方法

1.2.1 三明野生香蕉組培苗葉片DNA的提取 采用CATB法提取三明野生香蕉組培苗葉片的DNA，并用1.0%非變性瓊脂糖凝膠電泳結(jié)合超微量紫外分光光度計，選擇符合要求的DNA用于后續(xù)研究。

1.2.2 三明野生香蕉Ran基因DNA序列的克隆

1.2.3 三明野生香蕉Ran基因DNA序列及其編碼的Ran蛋白的生物信息學(xué)分析 采用DNAMAN 6.0對三明野生香蕉Ran基因DNA序列及其編碼的Ran蛋白進(jìn)行比對分析。將三明野生香蕉Ran蛋白與擬南芥、毛果楊、葡萄和水稻Ran蛋白序列用MEGA5軟件自帶的ClustalW進(jìn)行對，并采用鄰接算法進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建，Bootstrap值設(shè)為1 000。用于進(jìn)化樹分析的擬南芥、毛果楊、葡萄和水稻Ran蛋白序列從植物基因組數(shù)據(jù)庫（http：//www.phytozome.net/）提取。

2 結(jié)果與分析

2.1 三明野生香蕉Ran家族基因DNA序列克隆與序列分析

2.2 三明野生香蕉Ran蛋白氨基酸序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化分析

3 討論與結(jié)論

家族成員數(shù)少是Ran家族基因不同于其他小G蛋白的一個重要特點，許多物種中均只有1個Ran基因，如人類和裂殖酵母[20]。模式植物擬南芥基因組中含有4個Ran基因[21]。根據(jù)全基因組基因預(yù)測結(jié)果，小果野蕉基因組中Ran家族基因共有9個成員。本研究共從三明野生香蕉中分離得到15條Ran家族基因DNA序列，且這些Ran家族基因僅分別與小果野蕉基因組中的4個Ran家族基因高度同源。三明野生香蕉中可能還存在與其他5個小果野蕉Ran家族基因成員同源的基因。以上結(jié)果表明，三明野生香蕉中可能存在大量的Ran家族基因成員。小果野蕉屬于AA類群，僅擁有香蕉的A基因組，而三明野生香蕉屬于AB類群[22]，同時擁有A和B基因組，這可能是三明野生香蕉含有大量的Ran家族基因成員的原因之一。本研究中分離得到的15條Ran家族基因DNA序列中有11條均與小果野蕉基因組中1個成員高度同源。這可能是在香蕉進(jìn)化過程中發(fā)生的全基因組復(fù)制或部分基因復(fù)制的結(jié)果。研究表明香蕉可能經(jīng)歷過3次全基因組復(fù)制有關(guān)[23]。三明野生香蕉中Ran家族基因成員的具體數(shù)量還有待進(jìn)一步研究確定。同時，香蕉基因組中大量Ran家族成員的存在預(yù)示著Ran基因可能在香蕉的生長發(fā)育過程中具有重要的作用。

三明野生香蕉、擬南芥、水稻、毛果楊和葡萄Ran蛋白的序列進(jìn)行序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明Ran蛋白高度保守。表明三明野生香蕉Ran蛋白可能與其他植物的Ran蛋白具有相同或類似的功能。已有研究表明Ran參與植物脅迫響應(yīng)。Chen等[11]分析了不同脅迫下水稻OsRAN2的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)與鹽脅迫和干旱脅迫相比，低溫可顯著影響OsRAN2的表達(dá)，且超表達(dá)OsRAN2可通過促進(jìn)細(xì)胞核內(nèi)微管蛋白的輸出以及維持細(xì)胞分裂提高轉(zhuǎn)基因植株的抗寒性。Paul和Kumar[12]研究發(fā)現(xiàn)低溫可導(dǎo)致茶葉休眠組織和旺盛生長的組織中CsRan2表達(dá)量上升，而室溫條件下休眠組織中CsRan2表達(dá)量下降。用150 mmol/L NaCl處理48 h后，擬南芥根系中Ran-1蛋白的豐度顯著提高，表明Ran可能在鹽脅迫條件下發(fā)揮著特殊的作用[14]。鹽脅迫、滲透脅迫和ABA處理可降低水稻OsRAN2的轉(zhuǎn)錄水平，超表達(dá)OsRAN2的水稻和擬南芥植株對鹽脅迫和ABA高度敏感，植株中與ABA和脅迫響應(yīng)有關(guān)的基因表達(dá)量提高[7]。低溫和鹽漬等脅迫是導(dǎo)致香蕉生產(chǎn)損失的重要因素。目前，Ran在香蕉脅迫響應(yīng)過程中的作用的相關(guān)研究還未見報道。三明野生香蕉具有較強的抗寒性[22]。本研究的結(jié)果為進(jìn)一步研究Ran在三明野生香蕉對脅迫（尤其是低溫脅迫）響應(yīng)過程中的生物功能奠定了基礎(chǔ)。

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責(zé)任編輯：葉慶亮