轉(zhuǎn)基因西瓜研究進(jìn)展

李金超 馬三梅 王永飛 孫小武

摘 要： 綜述了西瓜轉(zhuǎn)基因常用的方法、目前已獲得的轉(zhuǎn)基因西瓜性狀以及轉(zhuǎn)基因西瓜安全性等方面的研究進(jìn)展，并提出了今后進(jìn)一步的研究方向。西瓜轉(zhuǎn)基因常用方法為葉盤(pán)轉(zhuǎn)化法；將外源基因?qū)氲轿鞴匣蚪M中常用的方法主要有農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和花粉管介導(dǎo)法；常采用PCR、Southern和Western等方法來(lái)檢測(cè)和鑒定外源基因是否成功整合到西瓜基因組中；目前利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良的西瓜性狀主要集中在培育抗病毒、抗枯萎病和耐旱、耐鹽堿等方面；對(duì)轉(zhuǎn)基因西瓜的安全性研究主要包括生態(tài)安全性和食品安全性2個(gè)方面。今后應(yīng)利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)一步提高西瓜營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)、耐貯性和抗凍性等性狀，并進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)轉(zhuǎn)基因西瓜安全性的研究。

關(guān)鍵詞： 西瓜； 轉(zhuǎn)基因； 安全性

西瓜[Citrullus lanatus（Thunb.）Mansfeld]是一種深受人們喜愛(ài)的經(jīng)濟(jì)水果，屬于葫蘆科植物。西瓜不但汁多味甜、清涼解暑，而且含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分[1]，在夏季，世界各地對(duì)西瓜都有極大的消費(fèi)量。然而，西瓜的遺傳基礎(chǔ)狹窄，種質(zhì)資源有限，難以通過(guò)傳統(tǒng)的育種手段來(lái)培育出優(yōu)良性狀的品種[2]。近年來(lái)，西瓜的病毒病、土壤病菌感染病等日益嚴(yán)重，給世界各地的瓜農(nóng)帶來(lái)巨大的損失[3]。另外，西瓜的抗旱能力弱也是西瓜向干旱地區(qū)推廣種植的一個(gè)重要的瓶頸。

轉(zhuǎn)基因技術(shù)作為農(nóng)作物改良的有效手段，已被成功地應(yīng)用到西瓜的品種改良上。世界各國(guó)的育種者用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育出許多品質(zhì)優(yōu)良的西瓜品系，豐富了西瓜的種質(zhì)資源，提高了西瓜對(duì)眾多病害的抗性。同時(shí)，轉(zhuǎn)基因西瓜對(duì)種植地的環(huán)境安全性和作為食品的安全性也得到重視。本文對(duì)國(guó)內(nèi)外西瓜育種者通常使用的西瓜轉(zhuǎn)基因方法、已獲得的轉(zhuǎn)基因西瓜，以及轉(zhuǎn)基因西瓜的安全性3方面進(jìn)行了綜合歸納，旨在為西瓜的轉(zhuǎn)基因研究提供一些參考。

1 西瓜轉(zhuǎn)基因的方法

隨著各種轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的層出不窮，植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)日趨成熟。在培育轉(zhuǎn)基因西瓜方面，國(guó)內(nèi)外育種者使用的轉(zhuǎn)基因方法及技術(shù)基本上是相似的，其中最常用的是葉盤(pán)法[4]。圖1總結(jié)了轉(zhuǎn)基因西瓜培育的基本流程。

圖1 轉(zhuǎn)基因西瓜的基本培育流程

1.1 外源基因?qū)胛鞴匣蚪M的方法

將外源基因重組到西瓜基因組中最常用的方法是農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染法。在轉(zhuǎn)染前，通常先通過(guò)植物組織培養(yǎng)得到西瓜子葉的愈傷組織，隨后將子葉愈傷組織與帶有目標(biāo)基因的農(nóng)桿菌共培養(yǎng)一段時(shí)間完成轉(zhuǎn)染，子葉愈傷組織再經(jīng)組織培養(yǎng)即可得到轉(zhuǎn)基因的西瓜苗[5-7]。另一種方法是花粉管介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因，即外源基因通過(guò)花粉管通道進(jìn)入西瓜雌花的卵巢中而完成轉(zhuǎn)基因。Chen等[8]用此法培育出了對(duì)枯萎病有抗性的轉(zhuǎn)基因西瓜。

1.2 外源基因?qū)氲蔫b定

外源基因是否成功整合到西瓜基因組中，常采用PCR、Southern-blot和western-blot等方法來(lái)檢測(cè)和鑒定[9-11]。PCR可擴(kuò)增外源DNA以及質(zhì)粒中的其他報(bào)告基因，擴(kuò)增產(chǎn)物再經(jīng)電泳或Southern雜交鑒定。Southern-blot是指用與外源基因同源配對(duì)的基因探針對(duì)西瓜基因組中的外源基因進(jìn)行檢測(cè)，從DNA水平檢測(cè)轉(zhuǎn)基因是否成功。Western-blot用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因西瓜表達(dá)產(chǎn)生的外源蛋白，從蛋白質(zhì)水平驗(yàn)證外源基因的成功導(dǎo)入并且表達(dá)出相應(yīng)產(chǎn)物。

外源基因及其表達(dá)產(chǎn)物被檢測(cè)后，還需要進(jìn)一步考察轉(zhuǎn)基因植株是否產(chǎn)生了期望的性狀。例如，應(yīng)奇才等[12]將西瓜花葉病毒采用磨擦接種法接種到轉(zhuǎn)有該病毒外殼基因的西瓜植株的嫩葉上，通過(guò)比較轉(zhuǎn)基因植株和陰性對(duì)照植株對(duì)該病毒的易感性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因西瓜能有效地抵御西瓜花葉病毒的感染。這表明轉(zhuǎn)基因西瓜植株表現(xiàn)出了抗病毒的新性狀。

1.3 外源基因的遺傳穩(wěn)定性

外源基因被成功導(dǎo)入西瓜基因組后，外源基因能否正常地復(fù)制表達(dá)并遺傳給下一代，是決定轉(zhuǎn)基因成功與否的一個(gè)關(guān)鍵因素。外源基因在傳代過(guò)程中可能會(huì)發(fā)生分離、丟失等，不能穩(wěn)定的遺傳[13-14]。一般來(lái)說(shuō)，轉(zhuǎn)基因西瓜要進(jìn)行自交，外源基因純合后，并且能表現(xiàn)出相應(yīng)的性狀，才能說(shuō)明轉(zhuǎn)基因的成功。王慧中等[11]培育了轉(zhuǎn)WMV-2病毒外殼蛋白基因的西瓜植株，發(fā)現(xiàn)WMV-2病毒外殼蛋白基因在自交子一代的分離符合孟德?tīng)?∶1 的分離比。經(jīng)過(guò)連續(xù)4代的選擇和鑒定，他們最終篩選得到純合的遺傳穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因西瓜株系。

2 利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得的轉(zhuǎn)基因西瓜

目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者培育轉(zhuǎn)基因西瓜新品種的熱點(diǎn)主要集中在培育高抗逆性西瓜品種上，尤其是抗病毒、抗枯萎病和耐旱、耐鹽堿等方面。

2.1 抗病毒的轉(zhuǎn)基因西瓜

病毒病是西瓜3大主要病害之一，很容易造成西瓜大面積的減產(chǎn)。對(duì)西瓜種植危害最大的病毒主要有3種，分別為西瓜花葉病毒（Watermelon mosaic virus，WMV）、西葫蘆黃花葉病毒（Zucchini yellow mosaic virus，ZYMV）和黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）[15]。目前，育種者主要通過(guò)以下2種方法獲得抗病毒的轉(zhuǎn)基因西瓜：一是向西瓜基因組中導(dǎo)入病毒外殼基因。病毒外殼基因表達(dá)出病毒的外殼蛋白，現(xiàn)在普遍認(rèn)為這些病毒外殼蛋白在西瓜中的積累可以抑制病毒侵染西瓜時(shí)的脫外殼過(guò)程[16-17]。如將西瓜花葉病毒（WMV-2）的外殼蛋白基因?qū)胛鞴匣蚪M，可獲得對(duì)WMV-2有較好抗性的轉(zhuǎn)基因西瓜[11]；將黃瓜綠斑駁花葉病毒外殼基因（CGMMV-CP）導(dǎo)入西瓜基因組，獲得的西瓜可有效對(duì)抗CGMMV的感染[18]。Curuk等[19]培育的轉(zhuǎn)ZYMV外殼蛋白基因的西瓜可以抵抗ZYMV的侵染，并且能保持西瓜原來(lái)優(yōu)良的農(nóng)藝性狀。美國(guó) Asgrow 種子公司將WMV、CMV 和ZYMV 這3種病毒的外殼基因一起轉(zhuǎn)入與西瓜同為葫蘆科植物的西葫蘆植株的基因組中，獲得了高抗病毒病的轉(zhuǎn)基因西葫蘆品種，并已獲準(zhǔn)上市[20-21]。二是向西瓜基因組中導(dǎo)入病毒的復(fù)制酶基因。如我國(guó)學(xué)者牛勝鳥(niǎo)等[15]構(gòu)建了由ZYMV復(fù)制酶基因、CMV復(fù)制酶基因和WMV外殼蛋白基因組成的三價(jià)植物表達(dá)載體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)染到西瓜植株中，得到的轉(zhuǎn)基因西瓜的抗病能力普遍達(dá)到中等水平以上，并保持了受體西瓜品系原有的優(yōu)良農(nóng)藝性狀。

2.2 抗土壤病菌的轉(zhuǎn)基因西瓜

由土壤病菌造成的西瓜病害種類多、危害大。如由尖孢鐮刀菌導(dǎo)致的西瓜枯萎病是西瓜生產(chǎn)上危害最嚴(yán)重的病害之一， 在世界各西瓜產(chǎn)區(qū)均造成重大損失。由于這些病菌在土壤中可長(zhǎng)期存在，傳統(tǒng)的防治手段如打農(nóng)藥、輪作等都難以有好的防治效果[22]。西瓜育種者們一直致力于運(yùn)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)來(lái)提高西瓜對(duì)土壤病菌的抵抗能力。國(guó)內(nèi)學(xué)者張志忠等[23]培育出了轉(zhuǎn)有番茄幾丁質(zhì)酶基因（Chi3）的西瓜植株，這種具有合成幾丁質(zhì)酶能力的西瓜植株可以降解真菌細(xì)胞壁的幾丁質(zhì)， 從而破壞細(xì)胞壁致使病原體死亡[24-25]。張志忠等[22]培育了同時(shí)含有番茄幾丁質(zhì)酶基因和β-1，3-葡聚糖酶基因（Glu-Ac）的雙價(jià)抗真菌西瓜植株[22]。β-1，3-葡聚糖酶可將真菌表層的多糖水解，暴露出內(nèi)層的幾丁質(zhì)，有利于幾丁質(zhì)酶發(fā)揮作用，進(jìn)而增強(qiáng)了轉(zhuǎn) Chi3基因西瓜對(duì)真菌的抗性[26-27]。

2.3 耐旱、耐鹽堿的轉(zhuǎn)基因西瓜

西瓜的種植需要大量的灌溉水，這不利于西瓜在干旱、鹽堿地帶的種植。運(yùn)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育耐旱、耐鹽堿的轉(zhuǎn)基因西瓜的西瓜品種，是西瓜育種中的一個(gè)重要方向。Ellul等[28]發(fā)現(xiàn)，將釀酒酵母的耐鹽基因HAL1轉(zhuǎn)入西瓜，可有效提高西瓜對(duì)NaCl的耐受能力。Han等[29]將Ca2+/H+的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白sCAX2B的基因轉(zhuǎn)入用于嫁接西瓜苗的葫蘆砧木中，可增強(qiáng)葫蘆砧木根部對(duì)水分和營(yíng)養(yǎng)鹽的轉(zhuǎn)運(yùn)能力，從而提高了寄主西瓜苗的接穗率。Kajikawa等[30]發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)在沙漠地區(qū)的野生型西瓜比普通的西瓜品種具有更發(fā)達(dá)強(qiáng)壯的根系，并且具有優(yōu)越的保水抗旱能力。為此他們建立一套可高效率地對(duì)這2種西瓜根系進(jìn)行基因操作的方法體系，以便對(duì)這2種西瓜根系進(jìn)行對(duì)比研究，從而探明該沙漠野生西瓜根系在干旱條件下的生長(zhǎng)及保水的分子機(jī)制。

3 轉(zhuǎn)基因西瓜的安全性評(píng)價(jià)

轉(zhuǎn)基因西瓜的安全性研究集中在以下2個(gè)方面：一是外源基因?qū)ΨN植地環(huán)境安全性的影響。西瓜中轉(zhuǎn)入的外源性基因被認(rèn)為可能轉(zhuǎn)移到土壤中的微生物基因組中，并且存在擴(kuò)散至種植地周圍的近親植物的風(fēng)險(xiǎn)。二是轉(zhuǎn)基因西瓜作為食品時(shí)可能對(duì)人體產(chǎn)生的危害。Lee等[31]將轉(zhuǎn)基因西瓜的葉子和砧木埋在西瓜田的淺層土壤，觀察隨著植物材料的腐敗降解外源基因的消除過(guò)程，并觀察外源基因被土壤微生物捕獲的可能性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)外源基因在3個(gè)月后已完全降解，在這些腐敗的植物材料附近也沒(méi)有檢測(cè)到含有西瓜外源基因的微生物。Yi等[32]檢測(cè)了轉(zhuǎn)基因西瓜根系附近的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，并與非轉(zhuǎn)基因西瓜根系附近的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)作比較，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)顯著的差異，說(shuō)明并沒(méi)有微生物可以獲得西瓜的外源基因而獲得生存優(yōu)勢(shì)。然而，值得警惕的是，F(xiàn)uchs等[33]發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)有病毒外殼基因的南瓜可以將病毒基因轉(zhuǎn)移到野生的近親植物中，他們還認(rèn)為轉(zhuǎn)有多種病毒基因的植物可能會(huì)在植株內(nèi)發(fā)生病毒基因的融合和重組，從而產(chǎn)生新的危險(xiǎn)病毒。

在轉(zhuǎn)基因西瓜作為食品的安全性問(wèn)題方面，國(guó)內(nèi)外的報(bào)道較少。我國(guó)學(xué)者應(yīng)奇才等[34]用轉(zhuǎn)WMV-2病毒外殼基因的西瓜飼喂小鼠，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組小鼠的各項(xiàng)生命體征均無(wú)明顯差異，初步表明了該轉(zhuǎn)基因西瓜對(duì)小鼠沒(méi)有毒性， 屬安全食品。

4 結(jié)語(yǔ)與展望

綜上所述，轉(zhuǎn)基因西瓜的培育技術(shù)已比較成熟，基因工程應(yīng)用在改良西瓜品種上也取得了許多成功，西瓜轉(zhuǎn)基因的安全問(wèn)題也有較多的討論。但還有以下兩個(gè)問(wèn)題值得進(jìn)一步研究：

第一，目前對(duì)西瓜轉(zhuǎn)基因的研究主要集中在抗病性等方面，關(guān)于提高西瓜營(yíng)養(yǎng)水平、耐貯存能力、抗凍能力等方面的研究還少見(jiàn)報(bào)道。目前，秋冬季節(jié)市場(chǎng)上還鮮有西瓜出售。若能培育出抗凍的西瓜，使之可以在秋冬季節(jié)和高緯度地區(qū)種植，即可打破西瓜種植的季節(jié)限制和緯度限制；或者提高西瓜的耐貯存能力，延遲西瓜的保藏時(shí)間，以滿足大眾在秋冬季節(jié)對(duì)西瓜消費(fèi)的需求。

第二，關(guān)于轉(zhuǎn)基因西瓜的安全問(wèn)題尤其是作為食品的安全性問(wèn)題研究得還不多。對(duì)于轉(zhuǎn)基因食品，大眾普遍過(guò)于憂慮?？梢詫?duì)西瓜的外源基因及其表達(dá)的蛋白質(zhì)在動(dòng)物體內(nèi)的消化和吸收過(guò)程進(jìn)行詳細(xì)的研究，證明它的無(wú)害性，從而減輕大眾的憂慮和擔(dān)心。

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