金黃色葡萄球菌快速檢測(cè)方法的研究進(jìn)展

張穎

摘要：金黃色葡萄球菌是引起人類細(xì)菌性食物中毒及奶牛乳房炎的重要細(xì)菌之一，在自然界中廣泛分布。本文將重點(diǎn)介紹金黃色葡萄球菌的幾種快速檢測(cè)方法。

關(guān)鍵詞：金黃色葡萄球菌；快速檢測(cè)Research Advance on Staphylococcus Aureus Rapid Detection Method Zhang Ying

（Tianjin Animal Disease Prevention and Control Center, Tianjin, 300402）Abstract:Saphylococcus aureus is one of the most important bacterium which can cause bacterial food-poisoning and cow mastitis, it widespreads in nature. A few methods for the rapid detection of staphylococcus aureus are finally introduced.

Keywords: Saphylococcus aureus；rapid detection葡萄球菌屬革蘭氏陽性球菌，廣泛分布于空氣、水、土壤、飼料中，也存在于人、動(dòng)物的體表、鼻咽喉及腸道,屬于人獸共患病原菌。其中，金黃色葡萄球菌致病力最強(qiáng)，除引起皮膚組織及器官化膿炎癥外，所產(chǎn)生的毒素污染食物，導(dǎo)致食物中毒。近年來，由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒事件頗多。據(jù)美國(guó)疾控中心報(bào)道，由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒位居第2位，僅次于大腸桿菌，占整個(gè)細(xì)菌性食物中毒病例的33%，加拿大則高達(dá)45%。同時(shí)，金黃色葡萄球菌也是引起奶牛乳房炎的主要致病因子之一，給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

目前，金黃色葡萄球菌的快速檢測(cè)方法大致可分為3種：一是快速檢測(cè)培養(yǎng)基法；二是免疫學(xué)方法；三是以核酸為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)方法等[1]。

1快速檢測(cè)培養(yǎng)基法

1.1顯色培養(yǎng)基檢測(cè)

顯色培養(yǎng)基（Chromogenic/Fluorogenic Culture Media）是一類利用微生物自身代謝產(chǎn)生的酶與相應(yīng)顯色底物反應(yīng)顯色的原理來檢測(cè)微生物的新型培養(yǎng)基，減少了對(duì)菌株進(jìn)行純培養(yǎng)和進(jìn)一步生化鑒定的步驟[2]。

1974年Dr.Alain研制的CHROMagar Staph aureus（CSA）是以金黃色葡萄球菌的DNA酶和凝固酶為主要標(biāo)志酶，以甲苯胺藍(lán)、甲基綠、吖啶橙和5-溴-4-氯-3吲哚-胸苷-3磷酸等為顯色底物來鑒定該菌的顯色培養(yǎng)基。法國(guó)梅里埃公司研制的Baird Parker+Rabbit Plasma Fibrinogen(RPF)培養(yǎng)基，通過培養(yǎng)，生長(zhǎng)出的灰色到黑色的且不透明的菌落即為金黃色葡萄球菌，因該培養(yǎng)基中含有兔血漿，所以無需作血漿凝固酶試驗(yàn)做進(jìn)一步確認(rèn)[3]。黃吉城等[4]人曾用該培養(yǎng)基和國(guó)標(biāo)法相比較，總相符率達(dá)98%，且檢測(cè)時(shí)間大大縮短。另外，我國(guó)青島海博生物公司也研制出類似產(chǎn)品，現(xiàn)已被廣泛使用。

1.2紙片法

利用金黃色葡萄球菌在培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的熱穩(wěn)定核酸酶與顯色劑反應(yīng)形成粉紅色環(huán)來檢測(cè)該菌的存在。

美國(guó)3M公司生產(chǎn)的PetrifilmTM金黃色葡萄球菌測(cè)試片，該測(cè)試片有兩部分組成，一部分是經(jīng)改良的Baird-Parker培養(yǎng)基，對(duì)金黃色葡萄球菌有很強(qiáng)的選擇性，另一部分是含有顯色劑和脫氧核糖核酸（DNA）的反應(yīng)片。Schoeller[5]曾對(duì)食品中金黃色葡萄球菌進(jìn)行傳統(tǒng)方法和3M紙片法的比較，試驗(yàn)證明3M紙片的特異性強(qiáng)，檢測(cè)時(shí)間短。吳仲梁等[6]人曾用該測(cè)試片進(jìn)行食品檢樣，結(jié)果顯示，PetrifilmTM檢出率達(dá)93.3%。

2 免疫學(xué)檢測(cè)方法

利用抗原與相應(yīng)抗體特異性結(jié)合為理論基礎(chǔ)進(jìn)行金黃色葡萄球菌的檢測(cè)，操作簡(jiǎn)單，特異性強(qiáng)，靈敏度高，適用于大批量樣品的檢測(cè)。

2.1酶聯(lián)免疫（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA）技術(shù)

ELISA法是免疫診斷中最常用的方法，在進(jìn)行金黃色葡萄球菌的檢測(cè)中常采用“夾心法”。 Schotte[7]曾報(bào)道一種改良的ELISA方法——快速免疫色析手工操作法，能夠在15 min之內(nèi)檢測(cè)500 pg/mL的金黃色葡萄球菌腸毒素。但是ELISA法也存在一些缺陷，試驗(yàn)中所用到的試劑選擇性高，價(jià)格昂貴，易受環(huán)境、溫度、時(shí)間等條件的影響。

2.2免疫熒光（Immunofluorescence Assay,IFA）技術(shù)

根據(jù)抗原抗體特異性結(jié)合的反應(yīng)特點(diǎn)，將已知抗體與熒光色素以化學(xué)方法結(jié)合制成熒光標(biāo)記物，在特定條件下，使樣品與其發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，之后在熒光顯微鏡下觀察是否有熒光標(biāo)記的抗原抗體復(fù)合物存在，若存在則證明該樣品含有金黃色葡萄球菌。1991年，Rowe等[8]用免疫熒光法分別達(dá)到了檢測(cè)出混合樣品中高分子量的金黃色葡萄球菌腸毒素和低分子量的金黃色葡萄球菌腸毒素的目的。2004年，Tim Alefantis[9]開發(fā)出一種基于免疫雙抗體夾心熒光法的快速檢測(cè)金葡菌腸毒素的方法，相比傳統(tǒng)方法，檢測(cè)時(shí)間大大縮短，全程需40～50 min。

2.3反向被動(dòng)乳膠凝集試驗(yàn)（Reverse Passive Latex Agglutination,RPLA）

RPLA法是采用間接凝集反應(yīng)的原理，將特異性抗體吸附于乳膠顆粒上，當(dāng)抗原抗體發(fā)生特異性結(jié)合時(shí)，乳膠發(fā)生凝集反應(yīng)，其凝集程度與待測(cè)樣品中細(xì)菌含量成正比。法國(guó)梅里埃公司的Slidex Staph-kit 在檢測(cè)樣品時(shí)，20 s即可讀出結(jié)果[10]。Trisum 公司的Aureus TsetTM則1 min內(nèi)可觀察結(jié)果[11]。RPLA雖簡(jiǎn)單易行，但是致敏的乳膠易發(fā)生自凝，從而影響反應(yīng)的靈敏度，造成檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確，另外，該方法只能檢測(cè)金黃色葡萄球菌的腸毒素。

3 分子生物學(xué)檢測(cè)

3.1聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction,PCR）

該方法克服了傳統(tǒng)檢測(cè)方法的不足，近年來發(fā)展比較迅速且被多種領(lǐng)域所應(yīng)用。國(guó)外最早采用PCR方法從食品中檢測(cè)金黃色葡萄球菌的報(bào)道是在1991年，WILSON等[12]采用該方法，8 h內(nèi)即可檢出人工污染的干燥脫脂奶中的金黃色葡萄球菌腸毒素B和C1，靶DNA檢出限達(dá)到1 fg（<10個(gè)細(xì)胞），靈敏度非常高。該方法由高溫變性、低溫退火（復(fù)性）及適溫延伸等幾步反應(yīng)組成一個(gè)周期，循環(huán)進(jìn)行，使目的DNA得以迅速擴(kuò)增。李秀娟等[13]人曾利用PCR對(duì)金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶（nuc）保守區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增并進(jìn)行特異性檢測(cè)，結(jié)果顯示用PCR法檢出的陽性率為37.5%，而傳統(tǒng)細(xì)菌分離培養(yǎng)法檢出的陽性率為31.3%。但是，PCR技術(shù)也有一些弊病，如試驗(yàn)費(fèi)用高，試驗(yàn)技術(shù)要求較高，不適合向基層推廣。

3.2核酸探針技術(shù)

該技術(shù)具有快速、靈敏、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。Noterman等人最早應(yīng)用于檢測(cè)金黃色葡萄球菌腸毒素的方法。其原理是利用了核苷酸堿基序列互補(bǔ)的原則，用特異的DNA探針通過核酸分子雜交來檢測(cè)未知樣品的抗原。近年來，Gene Tark推出檢測(cè)金黃色葡萄球菌的探針，采用浸染棒比色法，敏感性達(dá)100%，假陽性率為9.3%，人工感染樣品中沒有假陽性結(jié)果發(fā)生[14]。但是該技術(shù)操作也較繁瑣、費(fèi)時(shí)。

3.3基因芯片技術(shù)

基因芯片技術(shù)是近年來才迅速發(fā)展起來的一種反向固相雜交的高新技術(shù)，具有高通量、快速、靈敏的特點(diǎn)，其原理是設(shè)計(jì)一種檢測(cè)金黃色葡萄球菌的寡核苷酸探針，以一定方式固定在硝酸膜上，制成基因芯片，利用引物對(duì)靶基因進(jìn)行擴(kuò)增和標(biāo)記，并與基因芯片在適當(dāng)條件下雜交，根據(jù)雜交結(jié)果鑒定金黃色葡萄球菌是否存在。李秀萍等[15]人曾利用該技術(shù)對(duì)奶牛乳房炎主要致病菌進(jìn)行檢測(cè)，特異性較好，準(zhǔn)確率高，可操作性強(qiáng)，為臨床治療提供有力的依據(jù)。

3.4 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)

該技術(shù)通過針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域而設(shè)計(jì)4種特異性引物，利用鏈置換DNA聚合酶在等溫條件下進(jìn)行反應(yīng)，1 h內(nèi)可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)，呈現(xiàn)出LAMP特征性梯狀條帶，擴(kuò)增結(jié)果可通過肉眼觀察判定結(jié)果。不需要模板的熱變性、長(zhǎng)時(shí)間的溫度循環(huán)以及繁瑣的電泳等過程，同時(shí)也不需要昂貴的儀器設(shè)備，快速靈敏，特異性強(qiáng)，成本低，尤其適合大量、即時(shí)、現(xiàn)場(chǎng)的病原微生物的檢測(cè)，是真正的普及型的核酸檢測(cè)方法，易于在基層推廣。2003年開始逐步被用于醫(yī)學(xué)的臨床檢測(cè)，2005年在動(dòng)物疫病檢測(cè)方面有所應(yīng)用，吳紹強(qiáng)等[16]建立亞洲I型口蹄疫病毒的RT-LAMP檢測(cè)方法，采用瓊脂糖凝膠電泳、顏色變化、生成沉淀等現(xiàn)象判定結(jié)果，為口蹄疫的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)提供了一種更加簡(jiǎn)便快速的方法，滿足現(xiàn)場(chǎng)檢疫的需要。楊秋林等[17]應(yīng)用LAMP技術(shù)檢測(cè)弓形蟲，顯示出較好的特異性和敏感性。江彥增等[18]利用LAMP方法檢測(cè)非洲豬瘟病毒，其靈敏度是OIE標(biāo)準(zhǔn)PCR方法的100倍，并且與其他常見豬DNA病毒無交叉反應(yīng)。隨著人們對(duì)該技術(shù)的不斷改良，相信LAMP技術(shù)會(huì)在各領(lǐng)域充分發(fā)揮其作用。■（編輯：狄慧）

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