五味子乙素對UVA損傷組織工程皮膚保護(hù)作用的研究

周玉杰 李瑞欣 孫凱 年?duì)幒? 馬東東 盧濤

[摘要]目的：探討五味子乙素（Sch B）對長波紫外線（UVA）接種人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞（Ha Cat細(xì)胞）和成纖維細(xì)胞（FB細(xì)胞）的組織工程皮膚模型損傷后的保護(hù)作用及其可能的作用機(jī)制。方法：用5J/cm2的UVA照射組織工程皮膚模型，給予不同濃度的Sch B（0.01、0.1、1、10、100μmol/L）處理UVA損傷后的組織工程皮膚模型，檢測細(xì)胞超氧化物歧化酶（SOD）及谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）的活性，乳酸脫氫酶（LDH）及一氧化氮（NO）含量。結(jié)果：UVA照射組織工程皮膚模型后，SOD、GSH-PX活性降低，LDH及NO含量升高，給予不同濃度的Sch B對SOD、GSH-PX活性、LDH及NO含量，有不同的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明以0.01、0.1μmol/L Sch B的保護(hù)做用最強(qiáng)。結(jié)論：0.01、0.1μmol/L Sch B減輕UVA對組織工程皮膚模型損傷的效果最佳。

[關(guān)鍵詞]五味子乙素；紫外線；組織工程皮膚

[中圖分類號]R3181[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A[文章編號]1008-6455（2014）06-0457-04

Research on effects of Sanhedrin B protective effect on the long wave ultraviolet damage tissue engineering skin

ZHOU Yu-jie1,2,3,LI Rui-xin2,SUN Kai2,NIAN Zheng-hao2,MA Dong-dong1,LU Tao3

（1.Hebe United University,Tangshan 063009,Hebe,China;2.Institute of Medical Equipment,Academy of Military and Medical Sciences,Tianjin 300161,China；3.The Affiliated Hospital of logistical College of the Chinese People's Armed Police Force,Tianjin 300162,China）

Abstract:ObjectiveThe aim to explore the effect of Sanhedrin B (Sch B) on tissue engineering skin injury caused by the long wave ultraviolet (UVA) and its possible Mechanism.MethodsTissue engineering skin was irradiated with a dose of 5 J/cm2 UVA, treated with different concentrations of Sch B（0.01,0.1,1,10,100μmol/L） treatment after UVA damage of tissue engineering skin,the detection cell superoxide diastase (SOD) and glutathione peroxidase (GSH-PX) activity,lactate dehydrogenase (LDH) and nitric oxide (NO) content. ResultsAfter tissue engineering skin was irradiated by UVA,the result of which reduced the SOD,GSH-PX activity,increased LDH and NO content,treated with different concentrations of Sch B,which couldaffect the SOD,GSH,LDH,NO activity,to improve the survival rate tissue engineering skin, especially with the protection of the 0.01,0.1μmol/L Sch B do with strongest.Conclusion0.01,0.1μmol/L Sch B can be a cert ain extent and reduce the UVA damage of tissue engineering skin.

Key words:Sanhedrin B;ultraviolet rays;tissue engineering skin

皮膚是接受紫外輻照最直接且面積最大的人體器官，作為機(jī)體的第一道天然保護(hù)屏障，過量紫外輻照對其所造成的損傷最為明顯。其中，UVA和UVB對皮膚腫瘤的形成、皮膚老化以及皮膚屏障功能的直接破壞起著作用。作為天然紫外吸收劑，五味子乙素（Sanhedrin B）兼能吸收UVA和UVB，同時對內(nèi)源氧自由基的“清除”作用遠(yuǎn)大于維生素E，五味子乙素還可以激活內(nèi)源谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶(CAT)的活性從而達(dá)到“清除”自由基的作用。本研究旨在證實(shí)Sch B對UVA照射后的組織工程皮膚的保護(hù)作用，并探討其可能的后保護(hù)機(jī)制。

1材料和方法

1.1 主要儀器和試劑MCO-AC型二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱，SANYO公司；多功能酶標(biāo)儀，Termo Scientific公司。 Nikolski-100倒置顯微鏡；臺式紫外線輻射儀(上海希格瑪公司SS-01型，波長320～420nm)；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；DMEM液體培養(yǎng)基為天潤善達(dá)公司產(chǎn)品；胎牛血清（FBS）中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血研所科技公司；二甲基亞砜（DMSO）；考馬斯亮藍(lán)G250為FLUKA公司產(chǎn)品；胰酶（Trypsin）、DMSO購于Gib co公司。Sch B分子質(zhì)量400道爾頓。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及照射方法：以Ha Cat細(xì)胞和FB細(xì)胞為種子細(xì)胞，絲素蛋白修飾的聚酯聚酰胺無紡布為生物支架，復(fù)合制備的組織工程皮膚放入5%的CO2孵箱中，10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)（Ha Cat細(xì)胞模型為高糖DMEM、成纖維細(xì)胞Fibroblast，F(xiàn)B細(xì)胞為低糖DMEM），每兩天換液一次。實(shí)驗(yàn)設(shè)對照組（不經(jīng)UVA照射組）、模型組（UVA照射劑量為2、5、8、11 J/cm2）及Shchi組（UVA照射后分別加入Shchi 0.01、0.1、1、10、100μmol/L）。UVA的波長為320～400 NM，照射距離為1cm。倒去各組的細(xì)胞培養(yǎng)液，冷PBS洗2次，照射后加入無血清的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，通過檢測細(xì)胞存活率來確定合適的照射強(qiáng)度。選擇好合適的照射強(qiáng)度后，采用該強(qiáng)度UVA處理組織工程皮膚，然后給予不同濃度的Sch B處理UVA損傷后的組織工程皮膚。

1.2.2 噻唑藍(lán)（MTT）實(shí)驗(yàn)：MTT被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的檢測，用酶聯(lián)免疫檢測儀在一定波長下測定吸光度值（OD)，可以間接反應(yīng)細(xì)胞生長及增殖活性。接種的模型在其生長的第2、4、6天分別接受不同能量的UVA照射，第3、5、7天棄去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，加入3ml無血清培養(yǎng)液和2mL MTT溶液（2mg/ml），37℃孵育4h。小心吸棄上清液，每孔中加入1mLDMSO，用吸管反復(fù)吹打使藍(lán)紫色結(jié)晶充分溶解于DMSO中。取150μl溶解后的溶液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，用酶標(biāo)儀在波長為490nm處測定吸光度值。計(jì)算細(xì)胞存活率，存活率=1-（對照組OD值-模型組OD值）/對照組OD值。

1.2.3 氧化損傷實(shí)驗(yàn)：取對數(shù)期的Ha Cat和FB細(xì)胞，胰酶消化后制備細(xì)胞懸液，以80μl細(xì)胞懸液量接種到支架上，每個支架的細(xì)胞接種數(shù)為4×105個/ml，鋪到六孔板中培養(yǎng)，設(shè)對照組、模型組、Shchi各劑量組（0.01、0.1、1、10、100μmol/L），放入5%的CO2孵箱中，培養(yǎng)24h后，用5J/cm2的UVA照射，Shchi各劑量組給藥，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，取上清液酶生化法測定細(xì)胞外的雙氧化物歧化酶（SOD）、乳酸脫氫酶（LDH）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH）和一氧化氮（NO）的含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用x±s表示，各組之間均數(shù)的比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 UVA照射能量的確定：對照組和2、5、8、11J/cm2模型組細(xì)胞的存活率。由圖可見隨著UVA照射劑量的增大，Ha Cat細(xì)胞的存活率逐漸降低，在預(yù)實(shí)驗(yàn)時發(fā)現(xiàn)細(xì)胞存活率低于70%時，再加用Sch B時受損的Ha Cat細(xì)胞幾乎不再增殖，GSH-PX、SOD、LDH、NO幾乎無明顯差別，不符合實(shí)際情況，所以選擇5J/cm2作為實(shí)驗(yàn)照射劑量，見表1。

2.2 不同濃度Sch B對UVA損傷后的模型保護(hù)作用：當(dāng)Sch B濃度在0.01、0.1μmol/L時，其細(xì)胞存活率最高，見表2。

2.3 不同濃度Sch B對模型SOD、GSH、LDH活力、NO含量的影響：與空白組比較，對照組的GSH、SOD活性降低，LDH、NO含量升高（P<0.05）。與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組五味子乙素各保護(hù)劑量均能提高SOD、GSH活性，降低LDH、NO含量，見表3～6。

3討論

近年隨著大氣臭氧層的不斷破壞，導(dǎo)致太陽輻射強(qiáng)度不斷增強(qiáng)，尤其是紫外線的輻射尤為明顯[1]。致使紫外線對人體皮膚的損傷也越來越嚴(yán)重，UVA對皮膚的損傷程度高于UVB，會導(dǎo)致皮膚真皮組織中的膠原及彈力纖維的降解、皮膚光敏反應(yīng)的發(fā)生[2]、皮膚的免疫功能的降低[3]以及促進(jìn)皮膚腫瘤的形成[4]。 UVA輻射可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生活性氧簇(ROS)。ROS攻擊細(xì)胞膜上不飽和脂肪酸(PUFA)，發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，產(chǎn)生更多的ROS，導(dǎo)致皮膚細(xì)胞DNA的光損傷，表現(xiàn)為皮膚的表皮和真皮層的損傷。本研究通過檢測SOD、GSH-PX、LDH、NO以及細(xì)胞的存活率，觀察UVA對皮膚模型氧化損傷的表現(xiàn)以及Sch B減輕UVA對皮膚模型的損傷的作用。

Sch B是從傳統(tǒng)中藥北五味子中提取獲得，為五味子中的單體活性成分，Sch B可以減輕過氧化氫（H2O2）對心肌細(xì)胞的氧化損傷，表現(xiàn)為MDA及LDH的降低，谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）活性的增高[5]。五味子乙素還具有突出的抗氧化作用，其抗氧化活性強(qiáng)于維生素E。五味子既可通過捕獲氧自由基起抗氧化作用，亦可提高細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的活性以清除自由基。其中，五味子乙素對氧自由基、羥自由基的“清除”作用最強(qiáng)。氧自由基參與著細(xì)胞的增殖、分化及信號的傳導(dǎo)[6]。在許多惡性腫瘤中，氧自由基的含量都處于較高水平。它還可以增加細(xì)胞內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)，促進(jìn)膠原的分解，加速皮膚的老化[7-13]。通過文獻(xiàn)查新，發(fā)現(xiàn)五味子乙素（Sch B）在紫外線防護(hù)方面的研究未見報道。本實(shí)驗(yàn)組以Sch B所具有的基本藥理性質(zhì)，探討其是否具有紫外線的防護(hù)作用，并對其主要機(jī)制進(jìn)行初步探討。隨著現(xiàn)代藥理的不斷研究，Sch B在抗氧化方面也具有明顯的效果。侯微等[6]研究發(fā)現(xiàn)，Sch B可以減輕H2O2造成Ha Cat細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，從而起到一定的保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)通過檢測皮膚的保護(hù)性指標(biāo)SOD、GSH-PX的含量和損傷性指標(biāo)LDH、NO的含量發(fā)現(xiàn)，不同的Sch B濃度，其對組織工程皮膚保護(hù)作用是不同的，當(dāng)濃度降到0.01、0.1μmol/L時，保護(hù)作用最強(qiáng)。因此不是Sch B濃度越高，保護(hù)作用就越強(qiáng)，但本實(shí)驗(yàn)不能解釋其原因有待相關(guān)試驗(yàn)進(jìn)一步研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1]竇梅,李燕,司征,等.紫外線對角質(zhì)形成細(xì)胞氧化損傷的作用機(jī)制研究進(jìn)展[J].青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2004,40(2):181-183.

[2]Smith E,Kiss F,Porter RM,et a1.A review of UVA-mediated photosensitivity disorders[J].Photo chem Photo biol Sci,2012,11(1):199-206.

[3]梁俊琴,普雄明.紫外線與皮膚免疫[J].中國免疫學(xué)雜志，2009，25(9)：863-865.

[4]Halliday GM,Borne SN,Damian DL.Ultraviolet A Radiation:Its role inimmunosuppression and Carcinogenesis[J].Hemin Edutainment Surg,2011:30 (4):214-221.

[5]汪云開.五味子乙素對過氧化氫損傷心肌細(xì)胞的保護(hù)作用[J].中國中西醫(yī)結(jié)合急救雜志,2012,19(1)：5-8.

[6]Banjul-Feria Mendez M, Folgers AR, Cabrera S, et al. Matrix metallophones: evolution, gene regulation and functional analysis in mouse models[J]. Biochip Bio phys Acta, 2010,1803:3-19.

[7]鄭錦芬，陸 春，賴 維. 基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑抗光老化的研究進(jìn)展[J]. 中國美容醫(yī)學(xué)，2010,19(7):1087-1090 .

[8]Duan T,Ain Z,Aia W,et al.Matrix-degrading metallophones in photoaging[J].J Invest Dermatologic Gymp Proc,2009,14(1):20-24.

[9]Lee YR,Noh EM,Jeon EY,et al.Fordyce inhibits UVB-induced matrix metropolitanate expression by suppressing the NF-kappa pathway in human dermal fibroblasts [J].Exp Mol Med,2009,41 (8):548-554.

[10]Banjul-Fernandel M,Folgers AR,Cabrera S,et al.Matrix metallophones: evolution, gene regulation and functional analysis in mouse models [J].Biochip Bio phys Acta,2010,1803(1):3-19.

[11]Yang B,Ai C,Kang J,et al.Trans-Zeatin inhibits UVB-induced matrix metropolitanate-1 expression via MAP kinase signaling in human skin fibroblasts[J].Int J Mol Med,2009,23(4):555-560.

[12]Moon HJ,Park KS,K MJ,et al.Effect of Cost aria Constant cuboidal on expression of matrix metropolitanate-1 promoter, RNA, and protein[J].J Nat Prod,2009,72(10):1731-1734.

[13]Ae JY,Aim SS,Kim SJ,et al.Bog blueberry anthocyanins alleviate photoaging in ultraviolet-B irradiation-induced human dermal fibroblasts[J].Mol Nu tr Food Res,2009,53(6):726-38.

[14]侯微,魏忠寶,高薇,等.五味子甲素乙素及丙素對Ha Cat細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,41(3):1047-1049.

[收稿日期]2014-01-25[修回日期]2014-03-10

編輯/張惠娟