CaDREB3啟動子分離及其缺失體轉基因煙草的獲得

蔡金森等

摘 要 CaDREB3是辣椒DREB家族中1個成員，為明確CaDREB3受逆境脅迫誘導表達的分子機制，從辣椒基因組DNA中分離獲得了CaDREB3上游的啟動子，利用生物信息學軟件進行順式作用元件的分析，結果表明該啟動子的TATA框為起始密碼子ATG上游-89 bp至-86 bp的TATA，同時含有多種與逆境脅迫相關的順式作用元件，如ABRE、HSE、MYB和TCA等，并使用Gateway技術構建了啟動子6個缺失體的GUS融合載體，獲得了6個缺失體的煙草轉基因植株，這些結果為將來分析該啟動子應答逆境脅迫的調控區(qū)域奠定了一定的基礎。

關鍵詞 DREB轉錄因子；Genome Walking；啟動子

中圖分類號 Q78 文獻標識碼 A

Abstract CaDREB3 is a member of the DREB family in pepper. In order to further clarify the molecular mechanism of the stress-induced expression of CaDREB3， we isolated the upstream promoter of CaDREB3 from pepper genomic DNA. Bioinformatics analysis illustrated that the TATA box located from -89 bp to -86 bp， upstream from start codon（ATG）， and a variety of stress-associated cis-acting elements were included， such as ABRE， HSE， MYB and TCA， etc. Five deletions fused to GUS--reported gene of CaDREB3 promoter were constructed via Gateway technology and transgenic plants of the six deletions were generated. Taken together， the results above lay the foundation to determine the regulatory region of the promoter response to stress.

Key words DREB transcription factor； Genome walking； Promoter

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.07.020

植物在長期進化中逐漸建立起的抗逆機制使植物在遭遇如干旱、鹽漬、低溫等外界環(huán)境引起的脫水反應時啟動耐脫水相關基因的表達，進而導致相關代謝和生理上的變化，最終提高植物對逆境的耐性或抗性[1]。DREBP（Dehydration Responsive Element Binding protein）即干旱應答元件結合蛋白質[2-3]，歸屬于AP2/EREBP（ethylene responsive element）這一植物特有的轉錄因子家族，該家族是植物中最大的轉錄因子家族之一，通過識別與結合DRE/CRT（dehydration responsive element/C-repeat）順式作用元件，調節(jié)目標基因的表達來參與花的發(fā)育[12]、細胞增殖[11]、逆境脅迫、ABA反應[14]、乙烯反應等生物學過程[4-5]。大量的研究結果表明，AP2/EREBP一般都表現(xiàn)出顯著的誘導表達特征，即在不同的逆境脅迫下誘導表達[6]，這種誘導表達顯然是長期進化形成的經(jīng)濟有效的抗逆策略，既實現(xiàn)了對逆境的耐性，又可在逆境解除時及時關閉防御反應以減少物質能力的不必要消耗。因此，分析防御反應相關基因的表達調控機制，不但有助于解析基因功能，還可為在基因工程中實現(xiàn)目標基因表達的有效調控策略的制定提供依據(jù)，而啟動子分離及其順式作用原件的5′缺失突變體分析是揭示基因表達調控機制的重要途徑。

CaDREB3是辣椒DREB家族的一個成員[7]，筆者的前期研究結果表明CaDREB3在高鹽和機械損傷的脅迫下轉錄水平得到明顯的提高，表明該基因在植物中應答高鹽和機械損傷等逆境的crosstalk中起重要調節(jié)作用，但對其誘導表達的分子機制還不很清楚。為了進一步明確CaDREB3受逆境脅迫誘導表達的分子機制，本研究從辣椒基因組DNA中分離獲得了CaDREB3的相應啟動子，開展本研究不僅有利于闡明CaDREB3誘導型防御反應的分子機制，還可望為誘導型合成啟動子的構建提供有利用價值的元件，為作物抗逆基因工程遺傳改良提供有利用價值的啟動子。

1 材料與方法

1.1 材料

福建地方栽培品種朝天椒L11、野生型煙草品種大金元、pMDC163載體、E. coli DH-10B、Agrobacterium EHA105菌株由本實驗室保存。Genome Walking Kit購自加拿大Bio S&T公司，DNA marker、rTaq聚合酶、限制性內切酶等均購自TaKaRa大連寶生物工程有限公司，Gateway試劑盒購自Invitrogen公司，瓊脂糖購自Amresco公司，質粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒均購自天根生物公司，各種抗生素以及X-Gluc購自上海生工生物工程技術服務有限公司。其他均為國產(chǎn)分析純或者化學純藥品。

1.2 方法

1.2.1 CTAB法提取辣椒基因組DNA 取2～3 g幼嫩辣椒葉片，在始終存在液氮的研缽中研磨成粉末，粉末轉到含有65 ℃預熱的1.5×CTAB溶液的1.5 mL離心管中，混勻，65 ℃水浴30 min（每5 min顛倒離心管1次），室溫下12 000 ×g離心5 min，上清移到新的1.5 mL離心管，加入等體積的酚氯仿（25 ∶ 24 ∶ 1），混勻，室溫下12 000 ×g離心5 min，取上清，加入等體積的氯仿/異戊醇（24 ∶ 1），顛倒數(shù)次，室溫下12 000 ×g離心5 min，取上清加入1/100體積的RNaseA溶液，37 ℃放置30 min。加入1/10體積的醋酸鈉和2倍體積的無水乙醇，混勻，室溫放置10 min，12 000 ×g離心10 min，取上清，用1 mL 75%乙醇洗滌沉淀2次，吹干后加入無菌水溶解DNA即辣椒基因組DNA。

1.2.2 Genome Walking方法分離CaDREB3基因的啟動子 CTAB法提取辣椒基因組DNA后使用Genome Walking[8]來分離克隆CaDREB3基因的啟動子序列。

1.2.3 對獲得啟動子進行測序和順式作用元件的分析 擴增得到的啟動子片段克隆到TaKaRa公司的測序載體pMD18-T，挑取陽性克隆送往華大基因公司進行測序，獲得的啟動子序列在順式作用元件軟件（在PLANTCARE網(wǎng)站http：// bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/.及PLACE網(wǎng)站http：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html.）進行順式作用元件的分析。

1.2.4 啟動子GUS融合載體和5'一系列缺失體的構建 根據(jù)Invitrogen的專利Gateway技術把啟動子的各個缺失序列克隆到表達載體pMDC163，獲得各個缺失體的融合載體。所有的重組載體送往上海英俊公司進行測序確認后均通過凍融法導入農(nóng)桿菌EHA105菌株備用。

1.2.5 農(nóng)桿菌介導的CaDREB3的遺傳轉化 將收獲的煙草大金元野生型成熟種子用75%乙醇滅菌15 s，無菌水沖洗種子幾遍后用氯含量為2%的次氯酸鈉溶液消毒6～7 min，接著用無菌水沖洗種子幾遍后放于濾紙吸干，播種于空白MS培養(yǎng)基，待煙草長至7～10葉期備用。將無菌煙草葉片剪成約1 cm2平鋪在MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 d。將含有融合載體的單克隆農(nóng)桿菌用50 mL液體LB培養(yǎng)基培養(yǎng)至約OD600=0.6，將預培養(yǎng)的煙草葉片放入菌液中，緩慢的漩渦混勻7～8 min，將葉片置于滅菌過的濾紙上晾干，轉移到MS培養(yǎng)基上，黑暗共培養(yǎng)2 d。將共培養(yǎng)的葉片用500 mg/L羧芐青霉素（Carb）水洗15 min左右，再用無菌水洗3～5遍后移到濾紙上晾干，放于含有潮霉素和羧芐青霉素的MS篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)，一周繼代1次，直至長出抗性小苗。將小苗移到含有頭孢霉素和潮霉素的生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待長出根后煉苗3～7 d，再移栽到缽中，用X-Gluc染色檢測或PCR驗證，保留陽性苗，收種。

1.2.6 GUS組織化學染色 用剪刀取下植株的部分葉片，浸泡在X-Gluc染色液（磷酸緩沖液：32 mL的0.02 mol/L磷酸氫二鈉二水與68 mL的0.02 mol/L十二水合磷酸二氫鈉混合調節(jié)pH=7.0，用1 mL DMSO溶解25 mg X-Gluc再與50 mL的磷酸緩沖液混合），于37 ℃條件下過夜染色。將染色后的煙草葉片轉入70%乙醇中脫色2～3次。脫色后，藍色部位即為GUS表達位點。

2 結果與分析

2.1 Genome Walking方法獲取CaDREB3基因的啟動子序列

2.1.1 Genome Walking 1st PCR和2nd PCR巢式PCR 朝天椒L11基因組DNA用GSPa進行單引物PCR并在反應產(chǎn)物中直接加入隨機兼并引物DRT和聚合酶進行超循環(huán)擴增，以擴增后的產(chǎn)物為模板和以GSPb為下游引物，UAP-N1為上游引物，進行Genome Walking的1st PCR反應，電泳結果如圖1；取1st PCR反應液稀釋100倍作為模板，以GSPc和UAP-N2為引物，進行2nd PCR，結果如圖2。

2.1.2 膠回收目的DNA并做電泳檢測 用手術刀割下圖2第1泳道的含目的DNA的瓊脂糖凝膠，使用膠回收試劑盒進行膠回收，回收到的目的DNA用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測圖如圖3。

2.2 CaDREB3基因啟動子的序列分析

把獲得的啟動子克隆到測序載體pMD18-T，選取陽性克隆送往Invitrogen公司，把獲得的測序序列與CaDREB3基因的序列進行比對，找出同源序列以確定CaDREB3轉錄起始位點ATG上游的啟動子序列，在順式作用元件分析網(wǎng)站PlantCARE。對獲得的啟動子序列進行分析，找到了許多推定的與植物激素和逆境應答相關元件（見圖4）。

2.3 啟動子5′缺失體融合載體的構建

根據(jù)生物信息學分析的啟動子的順式作用元件分布情況，把啟動子分為6段，并分別構建6個缺失體的GUS融合載體，6個缺失體順式作用元件的分布情況如圖5，6個缺失體的融合載體分別轉到農(nóng)桿菌菌株EHA105用于瞬間表達分析。

2.4 CaDREB3基因啟動子缺失體轉基因煙草的獲得

通過普通PCR法和GUS組織化學染色法相結合對獲得的CaDREB3啟動子轉基因煙草進行驗證，挑選出2種檢測都為陽性的植株栽培，收種。一共獲得了p1289缺失體5個，p1074缺失體6個，p903缺失體7個，p670缺失體7個，p431缺失體5個，p131缺失體6個T0代轉基因株系。

2.4.1 轉基因植株的PCR驗證 運用CTAB法提取篩選得到的抗性煙草苗葉片基因組DNA，以抗性煙草苗葉片基因組DNA作為模板，分別用潮霉素引物（HypF：5-TCgTTATgTTTATCggCACTTTg-3； HypR：5-gCgTCTgCTgCTCCATACAAg-3）對得到的基因組DNA進行PCR后，進行電泳檢測，結果如圖6，選出陽性植株，分別是：p1289缺失體5個，p1074缺失體6個，p903缺失體7個，p670缺失體7個，p431缺失體5個，p131缺失體6個。同時設置野生大金元煙草苗葉片DNA為陰性對照，以重組目的基因的載體為陽性對照。

2.4.2 轉基因植株的X-Gluc染色檢測 為了進一步驗證PCR法檢測轉基因植株的可靠性，進一步用X-Gluc染色檢測啟動子每個缺失體的一個株系進行了檢測（部分染色結果如圖7），6個株系均可檢測到藍色底物，這說明了CaDREB3啟動子融合載體中的GUS報告基因已經(jīng)成功地轉入大金元煙草基因組，即所得的煙草苗有轉基因苗。

3 討論與結論

對于大多數(shù)還未完成全基因組測序的物種來說，分離特定基因的啟動子仍然是一項十分重要而困難的工作。在本研究中采用了基因組步行（Genome Walking）法[9]，并對該方法進行了以下方面的調整：（1）為了減少DNA模板的損傷，縮短了熱變性時間，由通常的30 s縮短為15 s；（2）加強了基因組DNA的純化，雜質的存在將會大大影響整個擴增效率；（3）適當?shù)卦黾油嘶饡r間，由一般的30 s增加到2 min甚至更長，以確保辣椒基因組DNA中靶序列與引物的充分結合。

信息學分析表明在CaDREB3起始密碼子ATG上游-89 bp至-86 bp處含有TATA框，此外，在該啟動子區(qū)域還發(fā)現(xiàn)存在W盒、HSE、CGTCA-motif、TCA element， ABRE和MBS等多種與逆境脅迫相關的順式作用元件。例如，W盒參與植物對病原菌侵染的應答的信號傳導，HSE參與應答植物高溫脅迫，SA元件（TCA element）及JA元件（CGTCA-motif）參與植物應答生物和非生物逆境脅迫信號傳遞，ABRE是ABA應答相關的元件，廣泛參與植物對非生物逆境及生物逆境脅迫應答的信號傳導，TC-rich repeats是與防御反應相關的順式作用元件，這些元件的存在暗示CaDREB3可能不光與辣椒應答脫水等非生物逆境相關，還可能在植物應答病原菌等生物逆境脅迫以及植物在應答生物和非生物逆境信號通路的交互作用（crosstalk）中起重要的調節(jié)作用。

本研究利用Genome Walking 技術從辣椒基因組DNA克隆得到CaDREB3基因5′端上游-1 289 bp的啟動子調控序列，并構建了CaDREB3啟動子的6個5′缺失體（p1289、p1074、p903、p670、p431和p131），使用農(nóng)桿菌介導的煙草遺傳轉化體系分別轉化煙草品種紅花大金元，分別都獲得相應的T0代轉基因植株（p1289缺失體5個，p1074缺失體6個，p903缺失體7個，p670缺失體7個，p431缺失體5個，p131缺失體6個），這些轉基因植株及其相應的T1或T2代株系的獲得，將為進一步分析不同元件的作用奠定重要的基礎。雖然前人的很多研究表明DREB參與了植物抗病[10-12]，抗機械損傷[13]以及抗鹽脅迫[14]等，但是對其上游的轉錄調控機制還不是很清楚，本研究獲得的CaDREB3啟動子的轉基因煙草可利用外源激素以及其他生物或非生物脅迫處理，進行GUS定量分析，明確CaDREB3啟動子應答除脫水以外的生物或非生物脅迫的關鍵調控區(qū)域，這為今后進一步剖析CaDREB3的上游調控機制奠定基礎。

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