橡膠樹紅根病病原菌rDNA—ITS序列鑒定

彭軍等

摘 要 為了更好地對(duì)橡膠樹紅根病病原菌進(jìn)行鑒定，從海南省和云南省發(fā)病嚴(yán)重的膠園采集病害樣本、分離得到12個(gè)靈芝屬菌株，并對(duì)其rDNA-ITS序列繪制Ganoderma屬系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明，采集得到的12個(gè)菌株中有11個(gè)鑒定為Ganoderma philippii、1個(gè)鑒定為G. gibbosum。

關(guān)鍵詞 橡膠樹紅根??；Ganoderma philippii；Ganoderma gibbosum

中圖分類號(hào) S432.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract With the aim to systemically phylogenetic analysis of pathogenic fungus causing Rubber Tree Red Root Rot Disease， twelve Ganoderma strains were isolated from Hainan and Yunnan. The rDNA-ITS sequences of the strains were amplified and used to construct phylogenetic tree together with other rDNA-ITS sequences of Ganoderma species in databases. The results showed that among these 12 strains， eleven of them belong to Ganoderma philippii and one of them belongs to G. gibbosum.

Key words Rubber tree red root rot disease； Ganoderma philippii； Ganoderma gibbosum

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.07.024

橡膠樹紅根病是巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）危害面積最廣、損失最為嚴(yán)重的世界性橡膠樹根部病害，在我國(guó)熱區(qū)各個(gè)植膠區(qū)內(nèi)普遍發(fā)生和為害。該病害的病原菌具有寄主多[1]、潛伏期長(zhǎng)[2]、菌絲在土壤中蔓延迅速[3]和難防治的特點(diǎn)，危害橡膠樹后嚴(yán)重影響干膠產(chǎn)量[4]，常常造成樹體死亡，是威脅橡膠樹產(chǎn)膠安全的重要因素之一。

目前，橡膠樹紅根病病原菌的鑒定主要以子實(shí)體外部形態(tài)、內(nèi)部微觀結(jié)構(gòu)和孢子等形態(tài)學(xué)鑒定為主，Corner[5]于1931年將馬來西亞橡膠樹紅根病病原菌鑒定為橡膠樹靈芝[Ganoderma pseudoferreum（Wakef）Over.et Steinm]；張運(yùn)強(qiáng)等[4，6]認(rèn)為海南島的橡膠樹紅根病與馬來西亞橡膠樹紅根病的病原菌相同，但兩者之間存在一定差異，可能存在2個(gè)變種；Steyaert[7]認(rèn)為G. pseudoferreum是G. philippii（Bres.et.Henn）Bres.的同物異名；而國(guó)內(nèi)趙繼鼎[8]編著的《中國(guó)靈芝新編》中，把橡膠樹紅根病病原菌定為橡膠樹舌（G. philippii）。

經(jīng)典的形態(tài)分類學(xué)和現(xiàn)代分子系統(tǒng)學(xué)相結(jié)合的方法是目前用于靈芝鑒定的主要方法，如姚一建課題組[9]對(duì)我國(guó)野生和栽培靈芝進(jìn)行鑒定，認(rèn)為其正確名稱應(yīng)是四川靈芝（G. sichuanense J.D.Zhao&X.Q. Zhang），而非原產(chǎn)地在英國(guó)的靈芝（G. lucidum）。Cao等[10]通過結(jié)合形態(tài)學(xué)研究和rDNA-ITS序列分析的方法鑒定了我國(guó)栽培的靈芝（G. lucidum），并提出了一個(gè)新種G. lingzhi?？梢?，rDNA-ITS序列分析的方法可以用于靈芝屬的種類鑒定，具有廣泛的適用性。傳統(tǒng)上對(duì)橡膠樹紅根病病原菌的鑒定主要依據(jù)子實(shí)體的形態(tài)與橡膠樹受害狀，而橡膠樹感染病原菌前期并無子實(shí)體、受害狀也不明顯，給病原菌的快捷、有效鑒定帶來一定的不便，有必要通過rDNA-ITS序列分析的方法，開展橡膠樹紅根病的鑒定。

為了對(duì)我國(guó)紅根病病原菌進(jìn)行進(jìn)一步鑒定，筆者從海南省和云南省兩大橡膠主產(chǎn)區(qū)內(nèi)危害嚴(yán)重的膠園采集紅根病病害樣本并分離病原菌，形態(tài)分類學(xué)鑒定，擴(kuò)增分離菌株的rDNA-ITS序列，通過基因組數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，構(gòu)建了包含Ganoderma屬內(nèi)已知種的系統(tǒng)進(jìn)化樹，從分子系統(tǒng)學(xué)的角度對(duì)橡膠樹紅根病病原菌進(jìn)行了鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 使用Ganoderma屬內(nèi)9個(gè)種50個(gè)不同來源的菌株繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，菌株編號(hào)包含“CATAS”的為筆者從橡膠樹紅根病病組織分離獲得，供試菌株信息見表1。

1.1.2 藥品或試劑 OMEGA真菌DNA小量提取試劑盒（純化方式：硅膠柱）；真菌rDNA-ITS通用引物ITS1/ITS4由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，純化方式為PAGE（Polyacrylamide gel electrophoresis，聚丙烯酰胺凝膠電泳）；Taq DNA Polymerase試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、pMD18-T Vector試劑盒均由寶生物工程（大連）有限公司生產(chǎn)；核酸染料Goldview：北京賽百盛基因技術(shù)有限公司。

1.1.3 試驗(yàn)儀器設(shè)備 PCR儀：德國(guó)Biometra公司，型號(hào)為T1 Thermocycler的用于普通PCR反應(yīng)；電泳儀：北京六一電泳儀器廠，型號(hào)為DYCP-31E；其他儀器均為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)儀器。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離 在橡膠樹紅根病發(fā)病的膠園內(nèi)挖取染病、木質(zhì)部尚未腐爛的病根，帶回室內(nèi)進(jìn)行組織分離。清水洗凈病根表面的土壤，晾干后至于無菌操作臺(tái)中，手術(shù)刀挖取緊鄰木質(zhì)部的韌皮部部分，放置在1 mg/mL鏈霉素溶液中、浸洗1 min后，無菌水潤(rùn)洗3次后將組織塊移至玉米粉橡膠根汁培養(yǎng)基中[11]，28 ℃恒溫培養(yǎng)、純化。

1.2.2 病原菌基因組總DNA的提取和rDNA-ITS區(qū)段PCR擴(kuò)增 病原菌基因組總DNA的提取采用OMEGA真菌DNA小量提取試劑盒（純化方式：硅膠柱），參照說明書進(jìn)行提取。根據(jù)White等[12]報(bào)道的真菌rDNA-ITS通用引物對(duì)序列設(shè)計(jì)PCR引物：ITS1： 5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′和ITS4： 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，以病原菌基因組總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，預(yù)期產(chǎn)物約640 bp。25 μL擴(kuò)增體系：10×PCR buffer 2.5 μL，1.5 mmol/L MgCl2 2.5 μL，10 μmol/L dNTPs 2.0 μL，每條引物（20 μmol/L）0.5 μL，Taq DNA聚合酶5 U/μL（TaKaRa Biotech）0.2 μL，模板DNA 20.0 ng，滅菌雙蒸水補(bǔ)足至25 μL。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)產(chǎn)物，Gold View（北京賽百盛生物工程公司）染色分析，紫外燈下觀察。

1.2.3 病原菌rDNA-ITS區(qū)段的克隆與測(cè)序 PCR產(chǎn)物回收采用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（TaKaRa），按試劑盒說明書進(jìn)行操作。使用TaKaRa pMD18-T Vector試劑盒，將回收產(chǎn)物與pMD18-T Vector 經(jīng)T4 DNA 連接酶連接后轉(zhuǎn)化Escherichia coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞。用含氨芐青霉素的X-gal/IPTG/LB平板進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，并將成功克隆的質(zhì)粒送上海英駿生物科技有限公司測(cè)序，所得序列提交至GenBank，獲得登錄號(hào)。

1.2.4 病原菌rDNA-ITS區(qū)段的序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 將測(cè)序得到的rDNA-ITS序列與GenBank中的序列經(jīng)BLASTn比對(duì)、同源序列分析并下載Ganoderma屬的G. philippii、G.sichuanense、G. multipileum、G. lucidum、G. tropicum、G. resinaceum、G. mastoporum、G. weberanum和G. gibbosum等9個(gè)種的38個(gè)rDNA-ITS序列，采用MEGA5.2對(duì)序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，采用最大簡(jiǎn)約法（Maximum Parsimony，MP）繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，重復(fù)次數(shù)為1 000次。所選Ganoderma屬rDNA-ITS序列GenBank登錄號(hào)見表1。依據(jù)Moncalvo等[13]靈芝屬rDNA-ITS序列種內(nèi)差異小于2%的觀點(diǎn)，判別橡膠樹紅根病病原菌菌株是否為同一種。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌分離結(jié)果

通過對(duì)云南省和海南省兩大主產(chǎn)區(qū)內(nèi)紅根病發(fā)病嚴(yán)重的膠園進(jìn)行病原菌的分離純化，共得到12個(gè)菌株，結(jié)合橡膠樹病根形態(tài)與菌落特征，初步鑒定為Ganoderma屬，菌株編號(hào)分別為CATAS-Gp-002、CATAS-Gp-003、CATAS-Gp-005、CATAS-Gp-008、CATAS-Gp-009、CATAS-Gp-011、CATAS-Gp-012、CATAS-Gp-013、CATAS-Gp-014、CATAS-Gp-018、CATAS-Gp-020和CATAS-Gg-010，菌株采集地見表1。

2.2 rDNA-ITS區(qū)段的PCR擴(kuò)增、克隆與測(cè)序結(jié)果

PCR產(chǎn)物和切膠回收產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，菌株編號(hào)為CATAS-Gp-002、CATAS-Gp-003、CATAS-Gp-005、CATAS-Gp-008、CATAS-Gp-009、CATAS-Gp-011、CATAS-Gp-012、CATAS-Gp-013、CATAS-Gp-014、CATAS-Gp-018和CATAS-Gp-020等11個(gè)菌株獲得1條大小為640 bp的擴(kuò)增條帶，與期望值基本相符，而菌株編號(hào)為CATAS-Gg-010獲得1條大小為655 bp的擴(kuò)增條帶。所有序列與GenBank中的序列經(jīng)BLASTn比對(duì)、同源性分析顯示，均與Ganoderma屬的其他種有非常高的同源性，達(dá)99%以上。

2.3 rDNA-ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

通過對(duì)GenBank上的Ganoderma屬的38個(gè)rDNA-ITS序列，采用MEGA5.2對(duì)序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，采用最大簡(jiǎn)約法（Maximum Parsimony，MP）繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明（圖1），所繪制的系統(tǒng)發(fā)育樹包含了Ganoderma屬內(nèi)的9個(gè)種，同一個(gè)種內(nèi)的不同菌株的rDNA-ITS序列雖有差異，但仍會(huì)聚集在同一個(gè)分支，如G. sichuanense（四川靈芝）的11個(gè)菌株。供試的CATAS-Gp-002、CATAS-Gp-003、CATAS-Gp-005、CATAS-Gp-008、CATAS-Gp-009、CATAS-Gp-011、CATAS-Gp-012、CATAS-Gp-013、CATAS-Gp-014、CATAS-Gp-018和CATAS-Gp-020等11個(gè)菌株與來自馬來西亞和印度尼西亞的G. pilippii（橡膠樹舌）的3個(gè)菌株聚為同一個(gè)分支、菌株之間的rDNA-ITS差異十分小。供試的CATAS-Gg-010菌株與來自中國(guó)和印度的13個(gè)G. gibbosum（有柄靈芝）菌株，聚為1個(gè)較大的分支，其中菌株AS5.624-T4和CATAS-Gg-010各自單獨(dú)形成一個(gè)分支，而其余的12個(gè)菌株聚為一個(gè)分支。

3 討論與結(jié)論

通過對(duì)云南省景洪市、勐臘縣、河口縣、紅河州，海南省瓊中縣、樂東縣的橡膠樹紅根病發(fā)病膠園分離得到Ganoderma屬的12個(gè)菌株，使用真菌rDNA-ITS通用引物ITS1/ITS4擴(kuò)增其序列，經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn)，12個(gè)菌株中11個(gè)菌株的rDNA-ITS序列大小為640 bp，而菌株CATAS-Gg-010的rDNA-ITS序列大小為655 bp，表明12個(gè)菌株可能由2個(gè)類群組成。

在GenBank下載Ganoderma屬的9個(gè)種38個(gè)菌株的rDNA-ITS序列，采用MEGA5.2軟件繪制MP法系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)，rDNA-ITS序列大小為640 bp的11個(gè)菌株與3個(gè)G. philippii菌株聚為同一個(gè)分支，二者之間的親緣關(guān)系十分近似，同源性達(dá)99%以上，可能是同一個(gè)種，這與Steyaert所認(rèn)為的G. pseudoferreum是G. philippii的同物異名的結(jié)論一致[7]，而趙繼鼎[8]也把橡膠樹紅根病的病原菌定為G. philippii。該分支可細(xì)分為兩個(gè)小分支，一個(gè)是包含CATAS-Gp-002、CATAS-Gp-003、CATAS-Gp-005、CATAS-Gp-008、CATAS-Gp-009、CATAS-Gp-011、CATAS-Gp-013、CATAS-Gp-014、CATAS-Gp-018和3個(gè)G. philippii菌株，一個(gè)僅包含CATAS-Gp-020和CATAS-Gp-012兩個(gè)菌株，涂敏等[14]通過RAPD的方法研究紅根病病原菌的遺傳多樣性時(shí)，認(rèn)為紅根病病原菌可分為兩個(gè)類群，說明該病原菌已經(jīng)存在遺傳分化。兩個(gè)小分支所包含的菌株之間親緣關(guān)系雖近，但并非是采集于同一個(gè)地區(qū)，而是跨越云南和海南兩省的6個(gè)市縣，至于2個(gè)小分支是否達(dá)到變種的水平，仍需進(jìn)一步的研究。

菌株CATAS-Gg-010與13個(gè)來自印度與中國(guó)的G. gibbosum菌株聚為1個(gè)大的分支，親緣關(guān)系較近，同源性達(dá)98%以上，而菌株CATAS-Gg-010與G. philippii的同源性低于90%，說明CATAS-Gg-010屬于G. gibbosum種群，而不屬于G. philippii這個(gè)種群。G. gibbosum，中文名稱為有柄靈芝（別名：有柄樹舌），在黑龍江、河北、陜西、江蘇、浙江、湖北、貴州、云南、廣東、廣西和海南等省區(qū)分布[15]。吳興亮等[16]通過對(duì)海南島靈芝資源的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，G. gibbosum在海南島廣泛分布于常綠季雨林、低山雨林和人工林中。菌株CATAS-Gg-010與CATAS-Gp-009均采集于云南省河口縣螞蝗堡農(nóng)場(chǎng)的橡膠園內(nèi)，但二者并不是同一種靈芝屬真菌。筆者首次從橡膠樹紅根病典型癥狀的根部分離獲得有柄靈芝（G. gibbosum）菌株，但其是否對(duì)健康的橡膠樹具有致病性，仍有待進(jìn)一步的柯赫氏法則驗(yàn)證。

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