22份余甘子核心種質(zhì)資源遺傳多樣性的SRAP分析

郭林榕等

摘 要 利用SRAP標(biāo)記檢測(cè)資源圃中保存的代表南方濕潤(rùn)分布區(qū)（福建、廣東、廣西）的22份余甘子種質(zhì)材料遺傳多樣性。結(jié)果表明：8對(duì)SRAP引物組合共產(chǎn)生167條擴(kuò)增帶， 其中135條為多態(tài)性條帶。多態(tài)性條帶比率為68.8%～90.0%， 平均為80.8%。分析計(jì)算余甘子種質(zhì)間的遺傳相似度（GS），22份材料GS的范圍為0.641～0.964。UPGMA法聚類分析結(jié)果表明，22份種質(zhì)可分為兩大類，其中福建地區(qū)15份余甘子間的遺傳相似系數(shù)為0.641～0.964， 廣東地區(qū)5份余甘子的遺傳相似系數(shù)為0.707～0.952。此研究結(jié)果表明，余甘子基因型具有豐富的遺傳多樣性，SRAP技術(shù)可有效運(yùn)用于余甘子資源的遺傳多樣性分析。

關(guān)鍵詞 余甘子；SRAP；種質(zhì)；遺傳多樣性

中圖分類號(hào) S667.9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract Twenty-two Phyllanthus emblica germlasms collected from humid regions of Southern China（Fujian， Guangdong and Guangxi） were used to analyze their genetic diversity. 167 bands were amplified by 8 selected primer combinations， in which 135 bands were polymorphic. The percentage of polymorphic fragments was 68.8%-90.0%， and 80.8% in average. The genetic similarity coefficients were ranged from 0.641 to 0.964 among these germlasms. Using unweighted pair-group method with arithmetic means（UPGMA） cluster analysis on the SRAP markers， the germlasms could be divided into two groups. The genetic similarity coefficients were ranged from 0.641 to 0.964 from 15 Fujian germlasms， and 0.707-0.952 from 5 Guangdong germlasms. All results suggested that SRAP markers were suitable for the research of the genetic diversity on ryegrass.

Key words Phyllanthus emblica；SRAP；Germplasm；Genetic diversity

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.07.022

余甘子（Phyllanthus emblica L.）為大戟科葉下珠屬植物，漢楊孚《異物志》中即有記載，為原產(chǎn)中國(guó)的珍稀果樹(shù)，是藥食同源的優(yōu)良樹(shù)種[1-9]。因其抗性強(qiáng)、耐旱耐貧脊，對(duì)紅壤、黃壤、砂壤等多種土壤適應(yīng)性較強(qiáng)，現(xiàn)主要分布于福建、云南、廣西、廣東、貴州、臺(tái)灣、海南、四川等熱區(qū)省份。中國(guó)擁有大面積的野生資源群落，野生種、農(nóng)家種、栽培品種（系）栽培歷史約有2 000 a，時(shí)間長(zhǎng)、分布廣，造成余甘子種質(zhì)之間同名異物、同物異名現(xiàn)象的廣普性。只有闡明余甘子種質(zhì)間基因的親緣關(guān)系，才能為種質(zhì)的分類，遺傳育種和種質(zhì)資源保存提供有力證據(jù)。福建省農(nóng)科院果樹(shù)所依托省科技廳重點(diǎn)項(xiàng)目、國(guó)家科技基礎(chǔ)條件平臺(tái)項(xiàng)目，在2008年建立了國(guó)內(nèi)首個(gè)余甘子種質(zhì)資源圃，開(kāi)展余甘子種質(zhì)資源的鑒定、評(píng)價(jià)及資源的標(biāo)準(zhǔn)化整理、整合工作。研究中引入SRAP分子標(biāo)記技術(shù)，分析收集、保存的余甘子種質(zhì)資源，擬建立品種特異性的標(biāo)準(zhǔn)DNA指紋圖譜，進(jìn)行遺傳多態(tài)性、系統(tǒng)發(fā)育與演化等方面的研究，為余甘子種質(zhì)資源的準(zhǔn)確鑒別及相互間親緣關(guān)系分析提供科了科學(xué)依據(jù)。

SRAP（Sequence Related Amplified Polymor phism）是2001年首先由美國(guó)加州大學(xué)蔬菜作物系Li等[10]報(bào)道的新的分子標(biāo)記技術(shù)，分別由獨(dú)特設(shè)計(jì)的17、l8個(gè)堿基組成的上、下游引物優(yōu)先對(duì)基因組DNA開(kāi)放閱讀框、內(nèi)含子和啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行特異擴(kuò)增，因不同基因型啟動(dòng)子、內(nèi)含子和間隔序列長(zhǎng)度不同而產(chǎn)生多態(tài)性。其擴(kuò)增多態(tài)性高，所能提供的生物學(xué)信息更多，檢測(cè)的結(jié)果更能反映物種遺傳多樣性和親緣關(guān)系。目前此技術(shù)已成功應(yīng)用于柿、枇杷、桃[11-15]等果樹(shù)遺傳多樣性的研究。瞿文林等[16]從數(shù)量性狀上分析余甘子天然居群果實(shí)形態(tài)變異；趙瓊玲等[17]采用聚類、主成分分析等方法，分析了14份云南不同種源余甘子植物形態(tài)變異的特征規(guī)律。目前對(duì)余甘子的研究，尚缺乏較系統(tǒng)、有針對(duì)性地對(duì)不同產(chǎn)地的余甘子資源進(jìn)行分子水平上的遺傳評(píng)價(jià)與鑒定分類。因此通過(guò)形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)，選擇具代表性的22份余甘子種質(zhì)資源為材料，在前期體系優(yōu)化的基礎(chǔ)上[18]，利用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)研究余甘子資源的遺傳多樣性，可為余甘子種質(zhì)資源的分類和育種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 余甘子試材取自福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所余甘子種質(zhì)資源圃。于2012年春季采集各品種（系）幼嫩葉片，保存于-80 ℃冰箱中備用。共選取22份余甘子種質(zhì)，其生物學(xué)性狀詳見(jiàn)表1。

1.1.2 試劑和儀器 SRAP-PCR所用Mg2+、 dNTPs、Taq DNA聚合酶、標(biāo)準(zhǔn)分子量DNA（DL2000）購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，SRAP引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，電泳所用主要試劑甲酰胺、溴酚藍(lán)、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、過(guò)硫酸銨、四甲基乙二胺、尿素、TBE電泳液均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

采用改良CTAB法提取基因組DNA，以瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量，以紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度和純度，并將濃度稀釋至50 ng/mL。選取已公布的SRAP上下游引物各8條，組成64對(duì)引物組合，篩選出擴(kuò)增多態(tài)性好、條帶清晰的引物，對(duì)22份材料進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件參照Pinmai等[6]的方法。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

選取引物在相同基因位點(diǎn)擴(kuò)增清晰的條帶，根據(jù)條帶的有無(wú)分別記做“0”和“1”。不同引物擴(kuò)增的結(jié)果構(gòu)成原始的“0，1”二元數(shù)據(jù)矩陣，利用NTsys 2.10e分析軟件計(jì)算余甘子種質(zhì)間的遺傳相似度（GS），采用UPGMA法構(gòu)建聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳多樣性分析

從64對(duì)引物組合中篩選出8對(duì)擴(kuò)增帶清晰、重復(fù)性好的引物組合，分別對(duì)22份材料的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 結(jié)果每對(duì)引物均能擴(kuò)增出10條以上清晰的條帶， 最多能擴(kuò)增出26條條帶。8對(duì)引物共產(chǎn)生167條擴(kuò)增帶（表2），其中135條為多態(tài)性帶， 平均每對(duì)引物產(chǎn)生20.8條擴(kuò)增帶、16.9條多態(tài)性帶。多態(tài)性帶比率為68.8%～90.0%， 平均為80.8%。

2.2 聚類分析

2.2.1 遺傳相似性分析 應(yīng)用NTsys軟件，根據(jù)上述167個(gè)位點(diǎn)譜帶0，1數(shù)據(jù)為原始矩陣，計(jì)算22個(gè)供試材料兩兩種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)。結(jié)果表明， 22份材料GS的范圍為0.641～0.964（表3）。其中福建地區(qū)15份余甘子間的遺傳相似系數(shù)為0.641～0.964，廣東地區(qū)5份余甘子的遺傳相似系數(shù)為0.707～0.952。其中收集自福建的“玻璃甘”和廣東的“玻璃甘”同名，但二者遺傳相似系數(shù)為0.737，遺傳差異較大，且果形等生物學(xué)性狀表現(xiàn)明顯不同，應(yīng)為同名異物。

2.2.2 聚類結(jié)果分析 采用非加權(quán)類平均法（UPGMA）進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見(jiàn)圖1。本研究的22份余甘子材料可劃分為兩大類群，A類群包含了本次實(shí)驗(yàn)所選取的6份廣東地區(qū)的余甘種質(zhì)和10份福建地區(qū)的余甘種質(zhì)，B類群包含了2份廣西地區(qū)的余甘子和4份福建地區(qū)余甘子。其中在相似系數(shù)為0.74處，A類群中的16份余甘子可進(jìn)一步細(xì)分成3個(gè)小群：A1小群均為福建省地方種質(zhì)，包含藍(lán)豐、六月白、粉甘、棗甘、扁甘、玻璃甘（閩）、南安2號(hào)及收集到的野生資源共10份；A2小群均為廣東省地方種質(zhì)，包含甜種、餅甘、獅頭等4份；A3小群較小，只包含廣東地區(qū)的2個(gè)種質(zhì)。

3 討論與結(jié)論

余甘子的分類傳統(tǒng)上是依據(jù)生物學(xué)特性和主要農(nóng)藝性狀進(jìn)行歸類。根據(jù)不同的成熟期，劃分為極早熟、早熟、中熟、晚熟、一年多熟品種。此外還有以果形、果重、果實(shí)風(fēng)味等劃分方法。但形態(tài)學(xué)分類容易受環(huán)境因素的影響，特別是余甘子作為新興的栽培果樹(shù)，由于不同分布區(qū)環(huán)境條件的差異，各地馴化栽培的農(nóng)家品種的各種性狀包括樹(shù)體性狀、花果性狀、物候期等在不同地域表現(xiàn)變異大，需要更為客觀的鑒定手段?，F(xiàn)階段一般采用分子標(biāo)記方法鑒定種質(zhì)差別、分析遺傳多樣性，從DNA水平上反映各個(gè)基因型之間的內(nèi)在差異，對(duì)余甘子資源的整理分析亦可使用分子生物學(xué)方法。

已有學(xué)者嘗試使用RAPD對(duì)余甘子進(jìn)行遺傳多樣性分析，蔡英卿等[19]采用20個(gè)具特異擴(kuò)增的多態(tài)性引物對(duì)福建省34份余甘子基因型進(jìn)行擴(kuò)增，20條引物在34份供試材料中總共擴(kuò)增出259個(gè)位點(diǎn)，多態(tài)性程度100%，采用ED（歐氏距離）法進(jìn)行RAPD標(biāo)記的聚類分析則可將福建34份余甘子遺傳資源明顯劃分為惠安余甘和莆田余甘兩大類，兩類群余甘子資源遺傳背景復(fù)雜，遺傳分化程度大。劉曉生等[20]對(duì)廣東潮汕地區(qū)所收集的17份余甘子資源進(jìn)行分析，指出17份種質(zhì)的遺傳相似系數(shù)為0.5714～0.9，表現(xiàn)出了較高的遺傳多樣性。而本研究取材范圍進(jìn)一步擴(kuò)大，選取了代表余甘子南方濕潤(rùn)分布區(qū)的福建、廣東、廣西部分種質(zhì)開(kāi)展了遺傳多樣性的分析。所采用的8個(gè)引物組合在22份供試材料中總共擴(kuò)增出167條譜帶（個(gè)位點(diǎn)），多態(tài)性比率達(dá)80.8%；各供試材料之問(wèn)的遺傳相似度為0.641～0.964。從前人已發(fā)表文獻(xiàn)及本研究結(jié)果可以看出：福建、廣東余甘子栽培種質(zhì)遺傳多樣性均處于較高水平。這體現(xiàn)出余甘子農(nóng)家栽培品種栽培馴化時(shí)間短、馴化起源多的特征。本研究嘗試分析的閩粵黔3省的22份余甘子種質(zhì)可分為兩大類群，其中A類群包括了多數(shù)的福建和所有的廣東余甘子品種，B類群包括了少數(shù)福建和廣西的余甘子品種，聚類的結(jié)果與資源地理劃分并不一致，這可能是因?yàn)榈乩砦恢孟嘟?，這3個(gè)地區(qū)的種質(zhì)歷史曾發(fā)生交流。此外分析所得的聚類結(jié)果也與果型表現(xiàn)沒(méi)有明顯的對(duì)應(yīng)關(guān)系。由于余甘子分布地域較廣、適應(yīng)性強(qiáng)，在不同的生態(tài)環(huán)境下必然表現(xiàn)出適應(yīng)當(dāng)?shù)丨h(huán)境的形態(tài)特征，果實(shí)性狀是農(nóng)戶參考辨識(shí)品種的依據(jù)之一，但由于余甘子種質(zhì)收集工作起步較晚，所收集品種多數(shù)來(lái)源于民間，農(nóng)家品種的命名相對(duì)雜亂，存在誤判的可能，這也有可能干擾到聚類結(jié)果的準(zhǔn)確性。綜上所述，SRAP聚類結(jié)果既顯示出一定的地理來(lái)源相關(guān)性，又存在差別。而農(nóng)藝性狀的表現(xiàn)受外界環(huán)境影響大，筆者認(rèn)為在特定區(qū)域內(nèi)可使用農(nóng)藝性狀辨識(shí)相近的余甘子種質(zhì)資源，但類似的性狀并不代表相近的遺傳背景。

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