巴西橡膠樹FERONIA類受體激酶基因HbFER的克隆及表達分析

王涼潔等

摘 要 植物受體類激酶在植物的生長發(fā)育和抗逆等生理過程中起著重要作用。在橡膠樹轉錄組測序的基礎上，通過RACE技術和RT-PCR方法，擴增得到橡膠樹的一個類受體激酶基因的全長，命名為HbFER。該片段包含1個2 679 bp的開放閱讀框，可編碼892個氨基酸。生物信息學分析結果表明：該氨基酸序列與擬南芥、番茄、甘藍和楊樹的FER蛋白高度同源，其同源性分別為74.5%、74.7%、73.4%、82.9%。HbFER蛋白除了含有Malectin_like和PTKc結構域外，還含有1個信號肽（含22個氨基酸）和2個跨膜結構域。半定量分析結果表明，HbFER基因在不同組織中的表達水平存在差異，葉片和花中的表達豐度最高，膠乳中的表達豐度最低，且該基因在葉片中的表達受植物激素水楊酸的誘導。

關鍵詞 巴西橡膠樹；FERONIA類受體激酶；表達分析

中圖分類號 S794.1 文獻標識碼 A

Abstract The receptor-like kinases play important roles in the physiological processes of plant growth and stress resistances. Based on the result from the transcriptome sequencing and the data of RNA-Seq analysis in Hevea brasiliensis，the homolog of rubber FERONIA was cloned by RT-PCR and RACE named as HbFER. The sequencing result showed that the ORF of HbFER is 2 679 bp， encoding an 892 amino acids peptide with a 24 aa signal peptide， two transmembrane domains and two conserved domains， Malectin_like and PTKc， similar with FER from other plants. Bioinformatics analysis showed that the amino acid sequence of the HbFER is 74.5%， 74.7%， 73.4%and 82.9% similar with that of FER from Arabidopsis thaliana， Solanum lycopersicum， Brassica oleracea and Populus tomentosa， respectively. Semi-quantitative RT-PCR analysis showed that the expression level of HbFER is significantly higher in leaves and flowers than in other tissues. Additionally phytohormone salicylic acid can induce the expression of HbFER in the leaf.

Key words Hevea brasiliensis；FERONIA-like RLK；Expression assay

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.07.017

作為細胞表面受體，類受體激酶（Receptor-like kinases，RLKs）在植物生長發(fā)育、器官生成及在抵抗環(huán)境脅迫和抗病免疫反應中起著重要作用[1-5]。一個典型的RLK蛋白在結構上除了含有一個信號序列外，還包含有胞外結構域、跨膜域和一個胞內蛋白激酶域[6]，可通過其胞外域接受信號，然后通過胞內激酶域把該信號傳遞給細胞[7]。根據(jù)胞外結構域的特點，RLKs可分為21個亞家族[8]，其中Catharanthus roseus RLKl（CrRLKl）-like RLKs（CrRLK）是一個較小的亞家族，為植物所特有[9]。該亞家族成員廣泛分布于被子植物中，如在水稻、擬南芥、葡萄、辣椒、金魚草、小立碗蘚等物種中都有發(fā)現(xiàn)，其中單子葉模式植物水稻中有20個，雙子葉模式植物擬南芥中有17個[10-14]。該亞家族成員在結構上具有獨特的特點，其胞外域均含有6個保守基序motif，分別為motif1-6，其中motif5含有非洲爪蟾蛋白Malectin的糖結合序列。此外還有一個C端保守的motif7，但該序列的功能未知[9]。

FERONIA類受體激酶屬于CrRLK家族的成員，在植物的生長發(fā)育和抗脅迫過程中具有重要的生物學功能[10， 15-18]。擬南芥中的FER基因是第一個被確定功能的CrRLK家族成員，在擬南芥的有性生殖、細胞伸長和植物抗病免疫反應過程中起著關鍵作用。在擬南芥中，該基因功能的缺失將導致雌雄配子體信息交流出現(xiàn)障礙，不能正常受精[10，16]。水稻中的研究也得到相似的結果[9]。FER基因還參與調控植物營養(yǎng)生長期的細胞伸長，如人工小RNA干涉的FER突變體表現(xiàn)為植株矮小，葉片和葉柄變短，進一步研究發(fā)現(xiàn)其作用機制不依賴于已知的激素調節(jié)細胞伸長的信號途徑[11，19]。FER作為 RAC/ROP-信號途徑的上游調節(jié)蛋白調控植物的根毛發(fā)育[20]。最近的研究結果還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ER類受體激酶可激發(fā)植物細胞活性氧的產生[21]，并且在真菌侵染過程中發(fā)揮作用。擬南芥FER基因的T-DNA插入突變體對白粉病的抗性提高[17]。

在植物抗病性中，除了R基因介導的轉化抗病性外，還有一套可誘導的抗病機制，即植物誘導抗病性。其中的系統(tǒng)獲得性抗性（System acquired resistance， SAR）是植物受病原物的局部侵染后誘導非侵染部位產生的抗病性，因為具有非?；?、系統(tǒng)性和長效性的特點受到人們的重視[22]。已有的研究結果表明，SA是介導SAR的重要信號分子[23]，與SA結構類似的化合物（如苯并噻二唑和二氯異煙酸）都能夠誘導產生SAR反應，并常常伴隨著病程相關蛋白（Pathogenesis-related protein， PRs）基因的協(xié)同表達[24]。橡膠樹中也能產生SAR反應。用化學誘導劑苯并噻二唑處理橡膠葉片后，橡膠對炭疽病的抗性增強，這表明BTH 可誘導橡膠樹對炭疽病產生系統(tǒng)獲得性抗性[25]。用SA處理橡膠樹葉片后，病程相關蛋白基因PR1和PR5的表達增強[26-27]，但對其相關機制的研究不多。

在橡膠樹中關于HbFER基因的研究尚未見報道。本研究克隆了橡膠樹中與FERONIA類受體激酶同源的基因，將其命名為HbFER，并對其基因結構和表達模式進行了初步分析，為進一步研究該基因的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用植物材料為巴西橡膠樹品種熱研7-33-97（Hevea brasiliensis Reyan 7-33-97）。SA購自Sigma公司，大腸桿菌菌株為DH5α，反轉錄試劑盒購自Thermo公司，用于PCR反應的試劑、凝膠回收試劑盒等均購自博麥德科技有限公司，限制性內切酶和T4 DNA連接酶購自Fermentas公司，5′RACE試劑盒購于TAKARA公司，引物合成及序列測定均由北京六合華大基因科技股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 橡膠樹不同組織總RNA的提取 橡膠樹葉片總RNA的提取采用改良的LiCl沉淀法，具體步驟見Verwoerd等[28]的方法。橡膠樹膠乳總RNA的提取采用Tang等[29]的提取方法；其他組織RNA的提取參照Kiefer等[30]的提取方法。

1.2.2 第一鏈cDNA的合成及同源片段的擴增 以橡膠樹總RNA樣品為模板，按照thermo反轉錄試劑盒操作說明進行反轉錄反應合成第一鏈cDNA。根據(jù)橡膠樹轉錄組數(shù)據(jù)庫中獲得的EST片段設計PCR特異性引物，以第一鏈合成cDNA為模板擴增得到橡膠樹FER基因的片段，經(jīng)連接、轉化、鑒定后進行測序。

1.2.3 5′RACE擴增獲取基因全長 按照TaKaRa公司的5′Full RACE試劑盒說明對橡膠樹總RNA進行去磷酸化處理，然后去掉mRNA的5′帽子結構，連接上5′RACE Adaptor，得到Ligated RNA，最后以Ligated RNA為模板反轉錄得到cDNA。

根據(jù)同源片端的測序結果設計特異性引物，分別命名為GSP1（ACTGGATGGTGGGAAGATGG）和GSP2（CAGTGGATAGACCGATGGGGG）。以上述得到的cDNA為模板，試劑盒提供的接頭引物outer primer和inner primer為上游引物，GSP1、GSP2為下游引物，進行巢式PCR擴增。擴增得到的PCR產物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將目的片段割膠回收并連接到T載體進行序列測定。

1.2.4 生物信息學分析 基因的cDNA全長核苷酸序列和推測的氨基酸序列用DNASTAR軟件進行分析。利用HbFER的氨基酸序列與GenBank中已經(jīng)發(fā)表的一些其它植物FER的氨基酸序列進行BLAST比對，然后利用DNAMAN軟件對其進行同源性比較分析。應用ExPasy在線工具ProParam和ProtScale（http：//www.expasy.org/tools）分析HbFER的理論分子量和等電點等理化參數(shù)，利用NCBI CDD數(shù)據(jù)庫預測蛋白的功能結構域，利用TMHMM Server v. 2.0程序進行蛋白序列跨膜區(qū)分析，使用NetPhos2.0 Server程序對其磷酸化位點進行預測，使用軟件SignalP-V4.1進行蛋白質序列的信號肽預測。

1.2.5 SA處理橡膠樹葉片 配制濃度為5 mmol/L、pH5.7的SA溶液，然后噴霧處理長勢良好且處于嫩綠期的橡膠樹植株葉片，分別于處理0、6、12、24 h等不同時間點收集橡膠樹葉片樣品，置于液氮中速凍后，保存在-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 RT-PCR半定量分析 按1.2.1方法提取不同組織和SA處理的橡膠樹葉片總RNA，用DNA酶消化后進行反轉錄反應。以橡膠樹Actin基因為內參，通過RT-PCR技術檢測HbFER基因在不同處理條件下的表達情況。橡膠樹內參基因Actin的引物為Actin-F（5′CAGTGGTCGTACAACTGGTAT3′）和Actin-R（5′ATCCTCCAATCCAGACACTGT3′）。反應總體系為25 μL，其中2.5 μL 10×PCR Buffer（含 Mg2+），1 μL 10 mmol/L dNTPs，引物（10 μmol/L）各加1 μL，cDNA模板稀釋10倍后加1 μL，0.5 μL Taq DNA Polymerase，加ddH2O補足25 μL。HbFER擴增的PCR反應條件為：94 ℃ 5 min：94 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)后，72 ℃ 10 min。Actin擴增的PCR反應條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，51 ℃ 30 s，72 ℃ l min，25個循環(huán)；72 ℃ 10 min。

2 結果與分析

2.1 橡膠樹HbFER基因5′RACE的擴增及cDNA全長的克隆

根據(jù)對橡膠樹轉錄組數(shù)據(jù)庫中Unigene進行生物信息學分析，結果發(fā)現(xiàn)該片段已含有HbFER基因的部分3′UTR序列。為了獲得該基因的全長編碼區(qū)，作者相繼進行了2次5′RACE擴增（圖1-A、B），經(jīng)測序得知其長度分別為1 208 bp（含接頭引物序列）和1 200 bp（含接頭引物序列）。

根據(jù)2次5′RACE獲得的序列結果設計引物，擴增HbFER的編碼區(qū)全長序列（圖1-C）。結果表明，該片段長度2 679 bp，是一個完整的開放閱讀框，可編碼一個含892個氨基酸的多肽。利用ExPasy在線工具ProParam（http：//web.expasy.org/protparam/）進行分析，結果表明，該基因編碼的蛋白分子量為96.5 ku，等電點為6.05，為弱酸性蛋白；利用TMHMM Server v. 2.0程序進行蛋白序列跨膜區(qū)分析，發(fā)現(xiàn)該基因編碼的蛋白含有2個跨膜結構域；利用軟件SignalPV4.1預測，結果發(fā)現(xiàn)該蛋白的N端含有1個信號肽（含22個氨基酸）；在NCBI的CCD數(shù)據(jù)庫中進行搜索，發(fā)現(xiàn)HbFER中含有2個保守結構域Malectin_like和PTKc，其中Malectin_like結構域位于35～405號氨基酸殘基之間，PTKc位于540～802號氨基酸殘基之間（圖2）。

2.2 橡膠樹HbFER編碼的蛋白與其他植物FER蛋白的同源性比較及保守結構域分析

利用HbFER的氨基酸序列在GenBank蛋白數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對，結果發(fā)現(xiàn)HbFER編碼的蛋白與擬南芥（Arabidopsis thaliana）、番茄（Solanum lycopersicum）和楊樹（Populus tomentosa）的FER蛋白高度相似，其相似性分別為74.5%、74.7%和82.9%，其中Malectin_like和PTKc保守結構域與擬南芥、番茄和楊樹中的這2個結構域高度同源。此外，分析結果還發(fā)現(xiàn)HbFER含有CrRLK1-L家族成員中的6個保守胞外基序（motif）（圖3），其中motif5中含有類似于Malectin的糖結合序列，如LHFCE、IYLN等（圖3方框標注）。胞內域除激酶域以外，C端也有一個相對保守的基序（FSQGR）。以上結果暗示，克隆的HbFER基因屬于CrRLK1-L家族成員，可能具有其他植物CrRLK1類激酶相似的功能。

2.3 HbFER基因的組織表達特異性分析

通過RT-PCR半定量分析技術對HbFER基因的組織特異性表達情況進行檢測，結果表明，HbFER基因在花、葉、芽、樹皮和膠乳中均有表達，但其表達量有明顯差異，其中在葉中的表達豐度最高，花中次之，在膠乳中的表達豐度最低，結果見圖4。

2.4 SA對橡膠樹葉片中HbFER基因表達的影響

SA對HbFER在葉片中表達的影響結果見圖5。結果表明，葉片中的HbFER基因在6 h內被SA快速激活表達，在24 h后表達量有所降低，表明該基因能夠對SA產生應答，暗示該基因可能與SA抗病信號途徑相關。

3 討論與結論

本研究克隆了巴西橡膠樹HbFER基因并進行了初步的表達分析，結果表明該基因在氨基酸水平上與其他植物的FER蛋白具有高度同源性，除了包含Malectin_like和PTKc兩個保守功能結構域外，還含有植物類受體激酶CrRLK1-L亞家族成員所具有的7個特有基序（包括6個保守的胞外域基序和1個C端保守基序）的特點。生物信息學研究結果發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)CrRLK1-L亞家族成員的胞外域中都含有2個與Malectin蛋白的糖結合域相似[31]的區(qū)域。在HbFER蛋白的第5個胞外基序中也存在2個Malectin-like糖結合序列。這些數(shù)據(jù)說明HbFER是類受體激酶的同源基因，屬于CrRLK1-L亞家族成員。

已有的研究結果表明，擬南芥FER類受體激酶除了參與花粉管和助細胞的識別、調控花粉管伸長外[10， 15-16]，還在促進營養(yǎng)組織細胞伸長[11]、調節(jié)氣孔開度[17]等方面發(fā)揮作用。HbEFR在橡膠樹不同組織中的表達分析結果顯示，該基因雖然在花、葉、芽、樹皮和膠乳中均能檢測到表達，但在花和葉中的表達豐度明顯高于其它組織，推測可能與該基因在調控花粉管伸長和氣孔開度方面的生物學功能相關，而HbEFR對橡膠樹花粉發(fā)育和氣孔開度是否具體調控作用還需進一步的實驗證實。

SA是SAR反應的重要信號分子，能夠促使活性氧（Reactive oxygen species，ROS）在細胞中積累[32]，而ROS作為第二信使在SAR信號轉導途徑的建立中發(fā)揮重要作用[33]。據(jù)Kessler等[17]的研究結果表明，當用白粉病菌接種擬南芥fer突變體時表現(xiàn)抗性增強，說明FER基因參與植物的抗病反應。此外FER能夠在細胞表面調節(jié)RAC/ROP GTP酶的活性并激發(fā)ROS的產生。以上研究結果暗示FER可能通過SA介導的依賴于ROS的抗病信號途徑參與植物抗病反應，但在橡膠樹中所依賴的信號途徑還不清楚。本研究結果表明，當橡膠樹用SA處理后HbFER基因上調表達，暗示HbFER基因可能通過SA信號途徑參與植物的抗病反應，具體的調控機理還需進一步的研究。

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