一株抗根結線蟲芽孢桿菌的分離篩選及鑒定

張立強等

摘 要 從海南省尖峰嶺熱帶雨林土壤中分離獲得143株芽孢桿菌。經(jīng)松材線蟲初篩，獲得8株拮抗活性在80%以上的菌株；經(jīng)南方根結線蟲二齡幼蟲（J2）復篩，獲得4株拮抗活性在50%以上的菌株，其中菌株DB13184的發(fā)酵上清液稀釋10倍后，校正死亡率仍有56.7%?；?6S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析，顯示菌株DB13184屬于芽孢桿菌屬，與菌株Bacillus toyonensis BCT-7112T的序列相似度達100%，二者在系統(tǒng)發(fā)育樹上亦處于同一分支；結合該菌的培養(yǎng)特征、形態(tài)特征及生理生化特征，將其鑒定為Bacillus toyonensis。

關鍵詞 根結線蟲；熱帶雨林；芽孢桿菌；活性篩選；鑒定

中圖分類號 Q939.9 文獻標識碼 A

Abstract A total of 143 strains were isolated from Jianfengling tropical rain forest soil in Hainan Province. After first screening， eight isolates with antagonism activities more than 80% against pine wood nematode were obtained. Four isolates with antagonism activities more than 50% against second-stage juveniles（J2） of Meloidogyne incognita were obtained after second screening. The corrected mortality of the fermentation supernatant of strain DB13184 diluted 10 times was 56.7%. Phylogenetic analysis based on 16S rRNA gene sequence showed that the strain DB13184 belonged to genus Bacillus， and closely related to B. toyonensis BCT-7112T with the highest 16S rRNA gene similarity of 100%. In the phylogenetic tree， the two strains located on the same branch. Based on the culture characteristics， morphological characteristics， physiological and biochemical characteristics， strain DB13184 was identified as Bacillus toyonensis.

Key words Root-knot nematodes；Tropical rain forest；Bacillus；Active screening；Identification

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.09.027

根結線蟲是一類嚴重危害農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的植物病原線蟲，廣泛分布于世界各地，可侵染3 000多種分屬于114個科的植物[1]。據(jù)估計，在世界范圍內(nèi)每年由于根結線蟲等植物寄生性線蟲而造成的損失超過1 200億美元[2]。目前，化學殺線蟲劑仍然是防治根結線蟲的主要手段，但這種方法破壞環(huán)境、危害人體健康，正逐漸被限制使用；而傳統(tǒng)的一些防治方法如輪作、休耕等有時不易被實施。生物防治以其安全、高效、無污染的特點正越來越受到重視，是根結線蟲未來防控策略中的主要方向之一。

芽孢桿菌在自然界各種生境中廣泛存在，種類繁多，遺傳類型多樣。研究結果表明，其對多種病原性真菌、線蟲、細菌有拮抗活性，有些已經(jīng)廣泛用于病蟲害的防治，如枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）等[3]。此外，芽孢桿菌營養(yǎng)要求簡單，在環(huán)境中很容易存活、定殖，其最突出的優(yōu)勢是能產(chǎn)生抗逆性強的內(nèi)生孢子，將其開發(fā)成生防制劑具有制作簡單、施用方便、儲存期長等優(yōu)點，是最理想的生防菌[4-5]。目前，國內(nèi)外已經(jīng)報道的對根結線蟲具有拮抗活性的芽孢桿菌種類達14種，研究較多的有蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）[6]、堅強芽孢桿菌（Bacillus firmus）[7]和巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）[8]等，并在線蟲的防治方面顯示出了很大的潛力。但在實際應用過程中，由于大田環(huán)境的復雜性，這些生防菌劑的效果通常不夠理想[9]，因此，進一步尋找抗根結線蟲的芽孢桿菌新菌株仍然是必要的。

海南省獨特的地理位置造就了海南省獨特的、復雜多樣的生態(tài)系統(tǒng)，是生防資源篩選的寶貴資源庫。尖峰嶺熱帶雨林（108°44′～109°02′ E，18°23′～18°52′ N）位于中國海南省樂東縣，是中國現(xiàn)存面積最大、保存最好的原始熱帶雨林，被譽為“熱帶北緣生物物種基因庫”。目前，關于尖峰嶺熱帶雨林抗根結線蟲芽孢桿菌的研究尚未見報道，本研究擬對該區(qū)域中的芽孢桿菌進行分離、篩選，旨在為進一步的生防研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 2012年7月8日在海南省尖峰嶺熱帶雨林采用5點取樣法，去除表面雜物后，取深度25 cm內(nèi)的表層土，將5個采樣點的土樣等量混合并翻拌均勻，裝入無菌樣品袋，帶回實驗室及時處理。

1.1.2 培養(yǎng)基 分離培養(yǎng)基：營養(yǎng)瓊脂：蛋白胨10 g，牛肉浸粉3 g，氯化鈉5 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1 000 mL，pH7.5；麥芽汁營養(yǎng)瓊脂：麥芽汁（波美度7°）瓊脂與營養(yǎng)瓊脂分別滅菌，等量混合倒平板；SYD培養(yǎng)基：可溶性淀粉3 g，蛋白胨10 g，酵母粉3 g，葡萄糖3.5 g，KH2PO4 1.5 g，K2HPO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，NaCl 5 g，蒸餾水1 000 mL，pH7.5。

純化培養(yǎng)基：營養(yǎng)瓊脂。

發(fā)酵培養(yǎng)基：營養(yǎng)肉湯（配方同營養(yǎng)瓊脂，不加瓊脂粉）。

1.1.3 主要試劑 細菌基因組DNA提取試劑盒購自成都福際生物技術有限公司，2×Es Taq MasterMix（PCR用）購自北京康為世紀生物科技有限公司，細菌通用引物（27F、1492R）由上海生物工程有限公司合成，其他常用試劑為國產(chǎn)或進口分析純。

1.2 方法

1.2.1 芽孢桿菌的分離 取土壤樣品10 g，放入盛有90 mL無菌蒸餾水的錐形瓶中，200 r/min振蕩30 min后，配制成10-2～10-6系列梯度的土壤懸液，80 ℃水浴處理20 min。分別吸取不同稀釋梯度的土壤懸液100 μL，在不同的分離培養(yǎng)基上涂布，每種培養(yǎng)基3個重復。30 ℃恒溫培養(yǎng)2～4 d后，根據(jù)菌落的大小、顏色、形狀、邊緣、凸凹度、透明度、光澤度等表面特征，選取單菌落，在純化培養(yǎng)基上劃線2～3次，以獲得純培養(yǎng)。經(jīng)芽孢染色驗證后，編號，于-70 ℃甘油保存。

1.2.2 菌株的液體發(fā)酵 挑取經(jīng)活化的單菌落接種發(fā)酵培養(yǎng)基，30 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，發(fā)酵液10 000 r/min離心10 min，取上清液，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 抗根結線蟲活性菌株的篩選 初篩：以松材線蟲為靶標，松材線蟲的獲取參照雷敬超[10]的方法進行。在1.5 mL離心管中加入發(fā)酵上清液450 μL，線蟲懸液50 μL（約100條），每個處理3次重復，以發(fā)酵培養(yǎng)基為對照，28 ℃放置24 h后，2 000 r/min離心2 min，去上清，剩余約20 μL，重懸線蟲。以NaOH法判定線蟲死亡與否[11]，將線蟲液吸取到載玻片上，并按1/5的體積加入0.5 mol/L的氫氧化鈉溶液，迅速于顯微鏡下觀察，2 min內(nèi)依然呈線狀的線蟲記為死亡，彎曲狀的記為存活，計算校正死亡率，計數(shù)3次取平均值。

校正死亡率/%=100×（處理組死亡率-對照組死亡率）/（1-對照組死亡率）

復篩：以南方根結線蟲（由本實驗室鑒定并傳代保存）二齡幼蟲（J2）為靶標，J2的獲取參照魏華[12]的方法進行。將發(fā)酵上清液稀釋10倍，處理方法同初篩。以清水復活法判定線蟲的死亡與否，將線蟲重新放入1 mL的清水中，28 ℃放置24 h，2 000 r/min離心2 min，去上清，剩余約20 μL，重懸線蟲，鏡檢，若線蟲依然呈線狀的判定為死亡，彎曲狀的則判定存活，計算校正死亡率，計數(shù)3次取平均值。

活性菌株的遺傳穩(wěn)定性：將活性菌株在營養(yǎng)瓊脂平板上連續(xù)5次劃線繼代培養(yǎng)，并測定每一代菌株的抗根結線蟲的活性，方法同上，計算校正死亡率。

1.2.4 活性菌株的鑒定 （1）培養(yǎng)及形態(tài)特征：取待測菌株，在營養(yǎng)瓊脂平板上劃線，30 ℃培養(yǎng)24 h后，對長出的菌落進行觀察，包括大小、形狀、顏色、邊緣、凸凹度、透明度及菌落表面是否光滑、濕潤、有光澤等，連續(xù)觀察7 d。按照東秀珠[13]的方法進行革蘭氏染色、芽孢染色、鞭毛染色及伴孢晶體染色，最后對菌體特征進行觀察。

（2）生理生化特征：菌株的M.R試驗、V-P試驗、吲哚試驗，檸檬酸鹽利用、耐鹽性、淀粉水解、明膠液化、酪素水解、接觸酶、苯丙氨酸脫氨酶、卵磷脂酶、酪氨酸水解、硝酸鹽還原、糖醇發(fā)酵（D-葡萄糖、D-果糖、L-阿拉伯糖、D-甘露醇、纖維二糖、D-松二糖）等特征參照東秀珠[13]和Paul等[14]的方法進行。

（3）16S rDNA序列測定及其系統(tǒng)發(fā)育分析：采用細菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株的基因組DNA。以此DNA為模板，采用細菌通用引物（27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R：5′-TACCTTGTTACGACTT-3′）進行16S rDNA序列PCR擴增。PCR反應總體系為50 μL，其中基因組DNA 3 μL，27F 2 μL，1492R 2 μL，2×Es Taq MasterMix 25 μL，ddH2O 18 μL。PCR反應條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，共30個循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。所得產(chǎn)物檢測合格后，送上海生工生物工程有限公司測序，測序結果在EzBioCloud數(shù)據(jù)庫（網(wǎng)址：http：//www.ezbiocloud.net/）中進行比對，采用ClustalX 2.1軟件進行多序列分析，采用MEGA 5.0軟件（N-J法）構建16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹[15]。

2 結果與分析

2.1 芽孢桿菌的分離及篩選結果

由圖1可知，本實驗共分離到143株芽孢桿菌，經(jīng)初篩獲得8株校正死亡率在80%以上的菌株，將發(fā)酵上清液稀釋10倍后進行復篩，結果共獲得根結線蟲校正死亡率在50%以上的菌株4株，其中菌株DB13184對線蟲的校正死亡率為56.7%，并且連續(xù)5次繼代培養(yǎng)后，其對線蟲的活性為57.8%，說明該菌株具有穩(wěn)定的線蟲拮抗活性。

2.2 菌株DB13184的鑒定

2.2.1 培養(yǎng)及形態(tài)特征 菌株DB13184在營養(yǎng)瓊脂平板上生長迅速，菌落近圓形、白色、邊緣不整齊、表面濕潤粗糙、稍突起、不透明，菌落直徑為0.5～3.0 mm（圖2）；培養(yǎng)7 d后，形成扁平狀菌苔，形狀不規(guī)則，表面粗糙，顏色灰白，無光澤。

菌體桿狀，呈鏈狀排列，革蘭氏染色陽性（圖3）；產(chǎn)橢圓形芽孢，胞囊不膨大，近中生，具有鞭毛，無伴孢晶體。

2.2.2 生理生化特征 由表1可知，菌株DB13184的M.R試驗、V-P試驗、吲哚試驗、檸檬酸鹽利用為陽性，能水解淀粉、明膠、酪素；接觸酶、卵磷脂酶、酪氨酸水解試驗為陽性，苯丙氨酸脫氨酶為陰性，能還原硝酸鹽，能利用葡萄糖、松二糖產(chǎn)酸，不能利用果糖、阿拉伯糖、甘露醇、纖維二糖產(chǎn)酸，能耐受5%（w/V）的NaCl溶液，不耐受7%（w/V）的NaCl溶液。

2.2.3 16S rDNA序列測定及系統(tǒng)發(fā)育分析 測序獲得菌株DB13184的16S rDNA序列為1 403 bp，NCBI登錄號為KJ721162。經(jīng)在EzBioCloud網(wǎng)站比對，結果發(fā)現(xiàn)與其相似度較高的菌株均為芽孢桿菌屬（Bacillus），與Bacillus toyonensis BCT-7112T相似度最高（100%），其次是Bacillus thuringiensis ATCC 10792T（99.9%）。按相似度高低選取相關菌株構建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4），菌株DB13184與B.toyonensis BCT-7112T、B.thuringiensis ATCC 10792T聚為一個分支，親緣關系最近。

2.2.4 菌株DB13184的鑒定結果 基于16S rDNA的序列發(fā)育結果表明，菌株DB13184與Bacillus toyonensis BCT-7112T和Bacillus thuringiensis ATCC 10792T在系統(tǒng)發(fā)育樹上聚為一支，但菌株DB13184與菌株Bacillus toyonensis BCT-7112T具有更高的序列相似性，在1 403 bp長度上二者相似度為100%；在培養(yǎng)與形態(tài)特征方面，菌株DB13184不產(chǎn)生伴孢晶體，而蘇云金芽孢桿菌（B. thuringiensis）產(chǎn)生伴孢晶體；在生理生化特征方面，菌株DB13184能利用D-松二糖產(chǎn)酸，不能利用纖維二糖產(chǎn)酸，耐受5%的NaCl，與Bacillus toyonensis BCT-7112T[16]相一致。綜合各方面的信息，將菌株DB13184鑒定為Bacillus toyonensis。

3 討論與結論

據(jù)報道，土壤中可被培養(yǎng)的微生物僅占0.3%左右[17]。在本研究中，從海南尖峰嶺熱帶雨林土壤中共分離到芽孢桿菌143株，但由于采樣時間與地點影響、培養(yǎng)方法限制等原因，不可避免的有些種類無法被有效分離，真實的數(shù)量應該遠不止于此。因此需要進一步優(yōu)化分離培養(yǎng)技術，才能更為全面的獲取其中的芽孢桿菌資源。

根結線蟲是植物內(nèi)寄生線蟲，直接測定所分離菌株的拮抗活性存在很多困難，室內(nèi)離體測定可以快速處理大量樣品，篩選到目標菌株。研究結果表明，松材線蟲具有多種毒素結合位點，能較為靈敏的檢測到發(fā)酵液中抗線蟲活性的物質(zhì)[10]，并且培養(yǎng)簡單、繁殖快，將其用于活性菌株的室內(nèi)初篩，有助于提高實驗效率，再結合根結線蟲J2復篩，可有效獲得抗根結線蟲活性菌株。

將16S rDNA序列分析與培養(yǎng)特征、生理生化特征結合起來進行微生物的分類鑒定是一種快速有效的方法[18-19]，并且得到了廣泛應用。在本實驗中，經(jīng)16S rDNA序列發(fā)育分析顯示，菌株DB13184與菌株Bacillus toyonensis BCT-7112T的序列相似度達100%，且在發(fā)育樹上處于同一分支，再結合該菌的培養(yǎng)特征、形態(tài)特征及生理生化特征，并與菌株Bacillus toyonensis BCT-7112T的描述作比較，顯示出相似的特征，最終將其鑒定為Bacillus toyonensis。

參考文獻

[1] 劉維志. 植物病原線蟲學[M]. 北京： 中國農(nóng)業(yè)出版社， 1998.

[2] Chitwood D J. Research on plant-parasitic nematode biology conducted by the United States Department of Agriculture-Agricultural Research Service[J]. Pest Management Science，2003， 59（6-7）： 748-753.

[3] 楊佐忠. 枯草芽孢桿菌拮抗體在植物病害生物防治中的應用[J]. 四川林業(yè)， 2001， 22（3）： 41-44.

[4] 嚴占勇. 生防芽孢菌對辣椒疫病的控病及機理研究[D]. 重慶：西南農(nóng)業(yè)大學， 2005.

[5] 劉國紅， 林乃銓，林營志， 等. 芽孢桿菌分類與應用研究進展[J]. 福建農(nóng)業(yè)學報， 2008， 23（1）： 92-99.

[6] Wei J Z， Hale K， Carta L， et al. Bacillus thuringiensis crystal proteins that target nematodes[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 2003， 100（5）： 2 760-2 765.

[7] 余子全， 羅 輝， 熊 靜，等. 對根結線蟲搞毒力芽胞桿菌的鑒定及其活性測定[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術學報， 2012， 20（6）： 669-675.

[8] Padgham J， Sikora R. Biological control potential and modes of action of Bacillus megaterium against Meloidogyne graminicola on rice[J]. Crop Protection， 2006， 26（5）： 971-977.

[9] 霍建飛， 劉春艷， 郝永娟，等. 植物寄生線蟲生物防治研究進展[J]. 蔬菜， 2010， 29（6）： 30-34.

[10] 雷敬超. 殺線蟲海洋放線菌的篩選及菌株HA07011的分類鑒定[D]. ?？冢?海南大學， 2007.

[11] Chen S Y， Dickson D. A technique for determining live second-stage juveniles of Heterodera glycines[J]. Journal of Nematology， 2000， 32（1）： 117-121.

[12] 魏 華， 劉 敏， 鮑時翔， 等. 1株抗根結線蟲紅樹林放線菌的篩選與鑒定[J]. 微生物學雜志， 2012， 32（4）： 13-16.

[13] 東秀珠. 常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[M]. 北京： 科學出版社， 2001： 353-398.

[14] Paul D V， Gerge M G， Dorothy J， et al. Bergeys manual of systematic bacteriology[M]. New York： Springer Verlag， 2009：21-128.

[15] Xiao C， Ye J J， Wu X P， et al. Ornithinibacter aureus gen. nov.， sp. nov.， a novel member of the family Intrasporangiaceae[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology， 2011， 61（3）： 659-664

[16] Guillermo J， Mercedes U， Ana C， et al. Description of Bacillus toyonensis sp.nov.， a novel species of the Bacillus cereus group，and pairwise genome comparisons of the species of the group by means of ANI calculations[J]. Systematic and Applied Microbiology， 2013， 36（2）： 383-391.

[17] Amann R I， Ludwing W， Schleifer K H. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation[J]. Microbiological Reviews， 1995， 59（1）：143-169.

[18] Vandamme P， Pot B， Gillis M. Polyghasic taxonomy， a consen-sus approach to bacterial systematics[J]. Microbiological Reviews， 1996， 60（2）： 407-438.

[19] Weissburg W G， Bams S M， Pelletier D A， et al. 16S ribosomal DNA amplification for phylogebtic study[J]. Journal of Bacteriology， 1991， 173（2）： 697-703.