巴西橡膠樹棒孢霉落葉病菌毒素基因cc004—cas克隆及致病作用

劉曉妹等

摘 要 為了探明多主棒孢菌（Corynespora cassiicola）毒素基因cc004-cas序列特征及其功能，以巴西橡膠樹棒孢霉落葉病菌為材料，采用SEFA-PCR和RT-PCR技術(shù)對(duì)毒素基因cc004-cas進(jìn)行擴(kuò)增，并通過插入潮霉素B基因獲得其突變體。序列特征分析結(jié)果表明，cc004-cas基因DNA和cDNA全長(zhǎng)分別為2 800 bp和180 bp，編碼區(qū)含2個(gè)內(nèi)含子（67 bp和49 bp），推測(cè)編碼59個(gè)氨基酸，其分子量約為5.92 ku，等電點(diǎn)pⅠ為5.70，與NCBI中報(bào)道的C. cassiicola毒素基因cas編碼的毒素前體pro-cassiicolin的氨基酸序列（0HABV25895.1）相似性達(dá)85%。cc004-cas突變體表型測(cè)定結(jié)果表明：在菌落和菌絲形態(tài)、生長(zhǎng)，產(chǎn)孢量、孢子萌發(fā)，菌絲生長(zhǎng)對(duì)溫度、pH要求，產(chǎn)生漆酶和纖維素酶的能力方面與野生型無顯著差異；但用菌餅接種橡膠樹嫩葉，致病力略有下降，用粗毒素接種時(shí)，致病力明顯減輕，可見毒素是多主棒孢菌的一個(gè)重要的毒力因子，但不是唯一的因子。

關(guān)鍵詞 多主棒孢菌；毒素基因；克??；致病力

中圖分類號(hào) S794.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract To reveal the sequence features and the function of a toxin encoding gene cc004-cas，cc004-cas gene was cloned from Corynespora cassiicola on Hevea brasiliensis by the method of SEFA-PCR and RT-PCR，and its knockout mutant was gained by inserting hygB gene into cc004-cas gene. Analysis of sequence characterization showed that the complete DNA and cDNA sequence of cc004-cas gene was 2 800 bp and 180 bp in size， respectively， with two introns of 67 bp and 49 bp， respectively， encoding a putative protein of 59-amino acid with a molecular weight of 5.92 ku and isoelectric point of 5.70. Analysis indicated that the putative protein of cc004-cas gene was homologous to C. cassiicola cas toxin gene coding product-pro-cassiicolin（0HABV25895.1）with a similarity of 85% in NCBI. Phenotype changes of a cc004-cas gene mutant were tested and there were no obvious difference in the colony color， mycelia morphology and growth， sporulation quantity， conidial germination， requirement of temperature and pH， and laccase and cellulase production between the mutant and the wild type. However the young leaves of the rubber tree inoculated with mycelia plugs produced typical symptoms but demonstrated weak virulence. While crude toxin was tested for pathogenicity， it displayed weaker virulence. That indicated cc004-cas toxin was a impotant virulence factor but not a unique factor in the pathogenicity of C. cassiicola in Hevea brasiliensis.

Key words Corynespora cassiicolas；Toxin gene；Cloning；Pathogenicity

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.09.025

巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）屬大戟科三葉橡膠樹屬，是熱帶經(jīng)濟(jì)作物之一，其產(chǎn)品天然橡膠與鋼鐵、石油、煤炭并列為四大工業(yè)原料。由多主棒孢菌[Corynespora cassiicola（B.&C.）Wei]引起的巴西橡膠樹棒孢霉落葉病是國(guó)際上公認(rèn)的繼南美葉疫病之后的又一個(gè)為害巴西橡膠樹的重要病害，2006年開始在中國(guó)膠苗上發(fā)生[1]，現(xiàn)已開始為害成齡的開割橡膠樹[2]。早在1975年Onesirosan等[3]就發(fā)現(xiàn)多主棒孢菌能產(chǎn)生毒性物質(zhì)。2000年Breton等[4]確定該毒性物質(zhì)是一種蛋白物質(zhì)，并定命為“Cassiicolin”。2007年De Lamotte等[5]確認(rèn)Cassiicolin是一種寄主?；远舅?，凝膠電泳顯示大小約15 ku，經(jīng)色譜測(cè)定，Cassiicolin是一種由27個(gè)氨基酸組成的富含半胱氨酸的糖蛋白，分子量為2 885 ku，與現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫(kù)中的蛋白沒有明顯的同源序列。隨后Cassiicolin的空間結(jié)構(gòu)得到了確定[6]。2009年該毒素的抗體被獲得[7]。中國(guó)也純化出了該毒素，凝膠電泳顯示大小為14.4 ku[8]。2011年Déon等[9]從分離自橡膠樹C. cassiicola的致病力強(qiáng)和中等的菌株中克隆到了完全相同的Cassiicolin基因cas，大小292 bp，推測(cè)由58個(gè)氨基酸組成，并提純到等量的毒素，但在弱致病力菌株中卻未克隆到該基因，也未提純到該毒素，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)該菌株致病力的差異與該毒素性質(zhì)無關(guān)，而與其轉(zhuǎn)錄水平有關(guān)，一般在接種后1～2 d轉(zhuǎn)錄水平達(dá)到高峰，Déon等[9]據(jù)此推測(cè)Cassiicolin毒素是C.cassiicola侵染寄主早期的重要致病因子。不同來源的多主棒孢菌在形態(tài)、生理特性及致病力等方面存在明顯的差異[10]。或許來自國(guó)內(nèi)橡膠樹C. cassiicola的毒素基因與來自國(guó)外的也存在差異，且國(guó)內(nèi)外尚缺乏從分子水平上敲除該毒素基因、對(duì)其功能進(jìn)行確切鑒定的數(shù)據(jù)。因此，本研究對(duì)分離自國(guó)內(nèi)巴西橡膠樹C. cassiicola的毒素基因cc004-cas進(jìn)行克隆和敲除鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試病菌和品種 巴西橡膠樹棒孢霉落葉病病菌多主棒孢菌[C.cassiicola（B.&C.）Wei]單孢菌株CC004[10]、巴西橡膠樹感病品種RIM600，均由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所提供。

1.1.2 試劑 Fungal gDNA Kit為BioMiga產(chǎn)品；pMD18-T simple Vector、1.5 U La-Taq DNA聚合酶、2×GC BufferⅠ（Mg2+ Plus）、2.5 mmol/L dNTPs為TaKaRa產(chǎn)品；2×Taq-Mixture Kit、Escherichia coli DH5α、TIANgel Midi Purification Kit和TIANScript cDNA First-Stand Kit為TIANGEN產(chǎn)品，RNA Extraction Kit為BioTeke產(chǎn)品；pCT74質(zhì)粒由美國(guó)Oregon大學(xué)Ciuffetti博士提供；CloneEZTM PCR Cloning Kit為Script產(chǎn)品；DIG High Primer DNA Labeling and Detection Starter Kit Ⅰ為Roche產(chǎn)品；潮霉素B為Roche進(jìn)口分裝，Ampicillin為Amresco進(jìn)口分裝；溶壁酶購(gòu)自廣東省微生物研究所；其它試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 巴西橡膠樹棒孢霉落葉病菌菌絲收集與核酸提取 收集用PD液培養(yǎng)4～5 d的菌絲。按照BioMiga Fungal gDNA Kit提取總DNA。按照BioTeke RNA Extraction Kit提取總RNA。

1.2.2 從基因組DNA擴(kuò)增cc004-cas基因片段 采用同源克隆法。參照GenBank：EF667973.1設(shè)計(jì)引物TL5 5′-CACAATGAAATATCTCCC-3′和TL6 5′-AAAGTTAACATCCCGAAC-3′。擴(kuò)增體系（50 μL）：2×Taq-Mixture 25 μL，引物（10 μmol/L）各2 μL，總DNA 1 μL，加ddH2O補(bǔ)至50 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。將獲得片段命名為cc004-cas。PCR產(chǎn)物的凝膠回收、連接、轉(zhuǎn)化按照TIANGEN和TaKaRa相應(yīng)試劑盒操作。

1.2.3 SEFA-PCR 獲得cc004-cas基因DNA全長(zhǎng) 參照SEFA-PCR（Self-Formed Adaptor PCR）引物設(shè)計(jì)原理[11]，根據(jù)已獲的cc004-cas基因序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增5′端和3′端的引物。5′端引物：5TL1 5′-GCCACAGAACCCGTTGCCGAAATC-3′，5TL2 5′-AAGTCAAGACGTACGCAAGACTGTCTAGG-3′，5 Hemin-TL3 5′-CAGAGATGAAGATAGG，NNN，NNN，NNN，AGATA-3′；3′端引物：3TL1 5′-GTGCGGCAG

CAGCTATTCTTCCTAGACAG-3′，3TL2 5′-CGATTT

CGGCAACGGGTTCTGTG -3′，3Hemin-TL3 5′-AAG

CTAATTTGCAT，NNN，NNN，NNN，ACAGTG-3′。

SEFA-PCR第一步擴(kuò)增。擴(kuò)增體系（30 μL）：2×GC BufferⅠ（Mg2+ Plus）15.0 μL， dNTPs Mix（各2.5 mmol/L）5.0 μL， Hemi-SA3（20 μmol/L）0.5μL，gDNA 1.5 μL， La-Taq酶（1.5 U）0.5 μL，補(bǔ)ddH2O至30 μL。擴(kuò)增條件： 94 ℃ 1 min； 94 ℃ 30 s， 40 ℃ 3 min， 以每秒增加0.2 ℃的速度升至70 ℃， 70 ℃ 5 min。取出PCR管加入0.5 μL引物SA1（20 μmol/L）后繼續(xù)擴(kuò)增， 擴(kuò)增條件： 94 ℃ 30 s， 70 ℃ 5.5 min， 25個(gè)循環(huán)； 再進(jìn)行8輪不對(duì)稱擴(kuò)增（94 ℃ 30 s， 70 ℃ 5.5 min，2個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，1個(gè)循環(huán)）；70 ℃ 5 min。

SEFA-PCR第二步擴(kuò)增。擴(kuò)增體系（30 μL）：引物SA2（20 μmol/L）0.5 μL，模板為第一步擴(kuò)增產(chǎn)物1.5 μL，其余同第一步。擴(kuò)增條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，66 ℃ 30 s（5′端）/65 ℃ 30 s（3′端），72 ℃ 5 min，33個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

5′端和3′端第二輪擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序。由于所獲得片段太長(zhǎng)，難于克隆測(cè)序，所以本試驗(yàn)借助5′端或3′端引物TL2和Hemi-TL3之間的序列，設(shè)計(jì)了引物5TL4 5′-CTGCCGCAGCAGACGGACCCT-3′和3TL4 5′-CGACAACTGTGGTAATTCCTG-3′，分別做為5′端和3′端第二輪擴(kuò)增產(chǎn)物的單向測(cè)序引物。

1.2.4 序列拼接與驗(yàn)證 利用DNAssist1.0軟件將所得5′端和3′端序列與cc004-cas基因片段序列拼接獲得其初步的全長(zhǎng)序列。再?gòu)膬啥嗽O(shè)計(jì)引物用高保真酶擴(kuò)增、測(cè)序，驗(yàn)證已獲得序列的正確性。

1.2.5 RT-PCR法擴(kuò)增獲得cc004-cas基因的cDNA 用DNAssist1.0軟件對(duì)所得cc004-cas基因全長(zhǎng)DNA與GenBank中cas基因的cDNA序列 （EF667973.1AB180104.1）比對(duì)分析后，用推定的cDNA序列設(shè)計(jì)引物對(duì)TR3 5′-TCTCCCTATCTTCA

TCTC-3′和TR4 5′-CCAGGAATTACCACAGTT-3′，按照TIANScript cDNA First-Stand Kit操作，擴(kuò)增cc004-cas基因的cDNA并克隆、測(cè)序。

1.2.6 cc004-cas序列分析 利用DNAssist1.0軟件比對(duì)分析所獲得的cc004-cas基因DNA和cDNA序列，找出開放讀碼框、起始密碼子、終止密碼子、外顯子、內(nèi)含子。利用BioEdit軟件分析cc004-cas基因編碼序列的化學(xué)特征。用Primer5.0軟件推測(cè)cc004-cas基因編碼的氨基酸序列。用ExPaSy軟件包中Computer PI/MW軟件分析該蛋白序列組分。

1.2.7 cc004-cas基因敲除突變體獲得及表型測(cè)定 線性化敲除載體的制備。將克隆有cc004-cas基因的pMD18-T simple Vector（命名p4CAS載體）用SalⅠ酶切，回收線性化載體p4CAS。

潮霉素B抗性基因。（hygB）的擴(kuò)增與回收以pCT74質(zhì)粒為模板，用引物HY3：5′-TAAAGGTA

TCATGTGAACTGGTTCCCGGTCGGC-3′和HY4：5′-AACCCGTTGCCGAAGAACTGATATTGAAGGAGCA

TTTTTT-3′（劃線部分為p4CAS載體上SalⅠ酶切位點(diǎn)左右序列）擴(kuò)增潮酶素hygB基因片段并回收。擴(kuò)增體系同1.2.2。擴(kuò)增條件：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

敲除載體p4CASH的生成。按照GenScript Corporation CloneEZTM PCR Cloning Kit操作，線性化p4CAS載體和hygB基因片段連接，構(gòu)建敲除載體p4CASH。

cc004-cas基因敲除突變體驗(yàn)證和RT-PCR分析。用敲除載體p4CASH轉(zhuǎn)化多主棒孢菌原生質(zhì)體，再生培養(yǎng)后共獲得5個(gè)轉(zhuǎn)化子，經(jīng)多次單孢純化后，先用擴(kuò)增潮霉素hygB基因引物檢測(cè)。選擇編號(hào)為CTH5的突變體進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。用XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切CTH5基因組DNA和野生菌株CC004基因組DNA進(jìn)行Southern雜交驗(yàn)證，酶切圖譜如圖1；雜交探針擴(kuò)增引物TProbe1：5′-CATTAGCGGATGAGTTAG-3′和TProbe2：5′-GGAT

ACAGAAAGCAAGAT-3′，預(yù)期大小約878 bp，用Roche產(chǎn)品DIG High Primer DNA Labeling and Detection Starter Kit Ⅰ標(biāo)記并雜交。為了進(jìn)一步驗(yàn)證cc004-cas基因是否在突變體CTH5中正常轉(zhuǎn)錄，提取CTH5和CC004總RNA，以真菌18s rRNA通用引物的擴(kuò)增產(chǎn)物作內(nèi)參，以RT 1：5′-ATCTCCCTATCTTCATCT-3′ 和RT2：5′-GGAATTA

CCACAGTTGTC-3′為特異性擴(kuò)增引物，參照1.2.5進(jìn)行RT-PC分析。

cc004-cas基因敲除突變體表型測(cè)定。參照張賀等[12]研究方法，測(cè)定cc004-cas基因突變體CTH5在菌落和菌絲形態(tài)、生長(zhǎng)，產(chǎn)孢量、孢子萌發(fā)，菌絲生長(zhǎng)對(duì)溫度、pH要求，產(chǎn)漆酶和纖維素酶能力及致病力方面變化。其中致病性測(cè)定選取巴西橡膠樹感病品種RRIM600葉齡一致且完好無病斑的嫩綠色葉片，采用3種方法測(cè)定。（1）菌餅接種測(cè)定[12]：在每張嫩葉主脈每側(cè)選3個(gè)側(cè)脈輕輕刺傷，一側(cè)接種野生菌株菌餅，另一側(cè)接種突變體菌株菌餅，滴加40 μL滅菌水，28 ℃保濕培養(yǎng)，以接PDA瓊脂餅做空白對(duì)照。 （2）粗毒素葉片穿刺接種測(cè)定：制備野生型或突變體粗毒素[12]；每個(gè)刺傷處僅接種40 μL粗毒素，用等量Czapek培養(yǎng)液做空白對(duì)照，逐日觀察發(fā)病情況。 （3）粗毒素葉片萎蔫生物法測(cè)定[13]：將剪去葉柄的嫩葉稱重（鮮重），插入盛有10 mL粗毒素原液的離心管中，用等量Czapek培養(yǎng)液作對(duì)照，室溫培養(yǎng)至用野生型CC004毒素處理的葉片出現(xiàn)明顯萎蔫時(shí)，取出葉片擦干稱重（干重）。計(jì)算萎蔫指數(shù)[13]，確定毒素的致病力。每處理10片嫩葉。

2 結(jié)果與分析

2.1 cc004-cas基因克隆與序列分析

2.1.1 cc004-cas基因片段擴(kuò)增結(jié)果 用引物TL5和TL6，以C. cassiicola總DNA為模板擴(kuò)增獲得了約300 bp片段（圖2），測(cè)序后用Blastn分析，發(fā)現(xiàn)與cas基因（EF667973.1）的覆蓋率和相似性分別達(dá)到100%和85%，說明獲得的基因片段符合預(yù)期，定名為cc004-cas。

2.1.2 SEFA-PCR 獲得cc004-cas基因DNA全長(zhǎng)

通過SEFA-PCR 2步成功擴(kuò)增獲得cc004-cas片段上下游側(cè)翼區(qū)域（圖3）。測(cè)序表明：5′端和3′端側(cè)翼序列長(zhǎng)分別為837 bp和1 753 bp，與已獲得cc004-cas序列拼接后，獲得大小2 800 bp序列。

2.1.3 RT-PCR法擴(kuò)增獲得cc004-cas基因cDNA 經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增獲得約150 bp的cDNA片段（圖4），測(cè)序表明大小為154 bp，與cas基因（EF667973.1）cDNA和cc004-cas基因的DNA序列比對(duì)拼接后獲得cDNA全長(zhǎng)180 bp。

2.1.4 cc004-cas序列分析 cc004-cas基因全長(zhǎng)DNA與cDNA序列分析：比對(duì)分析cc004-cas基因DNA和cDNA序列，發(fā)現(xiàn)起始密碼子ATG位于第802～804 bp處，終止密碼子TAA位于第1 095～1 097 bp處，自ATG到TAA的DNA序列全長(zhǎng)296 bp，存在3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，外顯子大小分別為105、60、15 bp（位于第802～906，974～1 033和1 083～1 097堿基處），內(nèi)含子大小分別為67和49 bp（位于第907～973和1 034～1 082堿基處），所有內(nèi)含子均符合GT-AG法則。

cc004-cas基因推測(cè)蛋白的化學(xué)特征分析：用Primer5.0軟件推測(cè)cc004-cas基因編碼59個(gè)氨基酸。用ExPaSy軟件包中Computer PI/MW分析發(fā)現(xiàn)推測(cè)的cc004-cas毒素蛋白分子量為5.92 ku，包括2個(gè)強(qiáng)堿性氨基酸（KR），2個(gè)強(qiáng)酸性氨基酸（D），31個(gè)非極性氨基酸（AILMPWVF），24個(gè)極性氨基酸（NCQSTYHG），等電點(diǎn)（PI）為5.70，可見是一種酸性蛋白質(zhì)，相對(duì)富含非極性氨基酸，其中丙氨酸（Ala，A）的含量最高，達(dá)18.64%；而極性氨基酸中半胱氨酸（Cys，C）、甘氨酸（Gly，G）和絲氨酸（Ser，S）的含量均為10.17%，居其次。

cc004-cas基因預(yù)測(cè)蛋白的同源性分析：利用NCBI網(wǎng)站中的BLASTP軟件，對(duì)該推定的氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與C. cassiicola pro-cassiicolin（0HABV25895.1）的氨基酸序列相似性達(dá)85%（圖5）。因此初步確定本試驗(yàn)獲得的cc004-cas基因是預(yù)期的C. cassiicola毒素基因，序列已提交GenBank（GU373809.1）。

2.2 cc004-cas基因敲除突變體的驗(yàn)證與表型測(cè)定

2.2.1 cc004-cas基因敲除突變體的驗(yàn)證 PCR驗(yàn)證表明（圖6）：用檢測(cè)潮霉素基因的引物從6個(gè)突變體基因中均擴(kuò)增出了預(yù)期大小的條帶（1 412 bp），從野生型基因組中未擴(kuò)增到任何條帶，說明hygB基因已插入轉(zhuǎn)化子；Southern雜交驗(yàn)證表明（圖7-A），突變體產(chǎn)生了1條與預(yù)期（2 118 bp）相符的雜交帶，而野生型產(chǎn)生了1條710 bp雜交帶，二者大小相差約1 400 bp，進(jìn)一步確定hygB基因插入了毒素cc004-cas基因中，成功獲得了cc004-cas基因敲除突變體。RT-PCR分析顯示：在野生型中能擴(kuò)增到了152 bp大小的特異性條帶，而在CTH5突變體中無該條帶，表明cc004-cas基因在突變體中無法正常轉(zhuǎn)錄表達(dá)（圖7-B）。

2.2.2 cc004-cas基因敲除突變體表型測(cè)定結(jié)果 與野生型相比，cc004-cas基因突變體在菌落和菌絲形態(tài)、生長(zhǎng)，產(chǎn)孢量、孢子萌發(fā)，菌絲生長(zhǎng)對(duì)溫度、pH要求，產(chǎn)生漆酶和纖維素酶能力沒有明顯變化。致病力測(cè)定如下：

（1）刺傷接種菌餅表明：野生型CC004與突變體CTH5的發(fā)病過程基本一致，即2 d后在接種點(diǎn)可觀察到明顯的壞死線，3 d后壞死線繼續(xù)擴(kuò)展，且在接種點(diǎn)葉背出現(xiàn)少量灰白色菌絲體（圖8-A），4 d后壞死斑繼續(xù)擴(kuò)大并出現(xiàn)黃色暈圈，突變體病害平均嚴(yán)重度為2.38，略低于野生型2.76。用PDA瓊脂餅接種的空白對(duì)照未表現(xiàn)任何癥狀。表明毒素基因突變體菌餅的致病力雖有減弱，但仍很強(qiáng)。

（2）粗毒素葉片穿刺接種表明（圖8-B）：取40 μL粗毒素滴于感病品種RRIM600嫩綠色葉片的刺傷處，保濕培養(yǎng)4 d后，用野生菌株CC004粗毒素接種的部位出現(xiàn)壞死斑點(diǎn)，壞死斑周圍的葉脈組織也呈現(xiàn)黑色壞死，形成了“魚骨”狀壞死線；用毒素突變體CTH5粗毒素接種的部位也有壞死斑點(diǎn)，但“魚骨”狀壞死線無或不清晰；用Czapek培養(yǎng)液接種的空白對(duì)照未表現(xiàn)任何癥狀；說明毒素突變體CTH5所產(chǎn)生的毒素對(duì)葉片的毒力作用顯著下降。

（3）粗毒素葉片萎蔫生物測(cè)定法（圖8-C）：將淡綠色葉片插入Czapek培養(yǎng)液，室溫下放置4 d后，少部分葉片出現(xiàn)輕微萎蔫和變色，大部分仍正常；但插入野生型CC004和毒素基因突變體CTH5粗毒素液中的淡綠色葉片，2 d后大多數(shù)葉片的主脈基部開始變黑，4 d后葉片明顯萎蔫，而突變體CTH5粗毒素處理的葉色失綠和萎蔫程度明顯較輕，萎蔫指數(shù)為7.60%，約為野生型CC004（32.40%）的1/4，可見毒素基因突變體CTH5產(chǎn)生的粗毒素毒力顯著下降。

3 討論與結(jié)論

Déon等[9]從分離自橡膠樹的C. cassiicola強(qiáng)致病力菌株和中等致病力菌株中克隆到了完全相同的Cassiicolin基因cas，在弱致病力菌株中卻未克隆到該基因。本試驗(yàn)參考Cassiicolin基因設(shè)計(jì)引物，從分離自中國(guó)橡膠樹C. cassiicola的強(qiáng)致病力菌株cc004中克隆到了毒素基因cc004-cas，但與cas基因存在一些差異，cc004-cas基因自ATG至TAA的DNA編碼序列大小296 bp，比cas基因多了4個(gè)堿基，有43個(gè)位點(diǎn)存在差異，二者DNA相似性為85%；所得cDNA全長(zhǎng)180 bp，比cas基因cDNA序列多了3個(gè)堿基，有22個(gè)位點(diǎn)有差異，二者cDNA相似性為88%；所推測(cè)編碼的氨基酸59個(gè)，比cas基因編碼的氨基酸在第26位多了1個(gè)丙氨酸，且有9個(gè)位點(diǎn)（第7、18、21、25、26、28、29、34和40氨基酸處）有差異，二者氨基酸相似性為85%。顯示出毒素基因cas在不同菌株中存在一定的差異性，可能與不同菌株進(jìn)化過程中在這些位點(diǎn)發(fā)生了變異有關(guān)。

從遺傳研究來看，目前研究較深入的HC-毒素[14]、HMT毒素[15]和AK-毒素[16]等的合成涉及到多個(gè)成簇基因，因此推測(cè)除了cas基因外，cassiicolin毒素的合成或許也是由基因簇控制的，其它相關(guān)基因還有哪些？這些基因在cassiicolin素毒合成過程中如何起作用？這些問題需進(jìn)一步研究。

另外，本研究還獲得了該菌株的蛋白激酶CCK1突變體，測(cè)定致病力對(duì)比發(fā)現(xiàn)與毒素突變體引發(fā)的癥狀差異較大。（1）用菌餅接種刺傷的嫩葉時(shí)，CCK1突變體完全失去了致病力，毒素突變體卻表現(xiàn)出略弱于野生型的致病力。（2）用粗毒素測(cè)定致病力時(shí)，毒素突變體引發(fā)的癥狀最輕、蛋白激酶CCK1突變體次之、野生型最重，萎蔫指數(shù)分別為7.60%、19.47%和32.40%，說明毒素是C. cassiicola重要的致病因子；在野生菌株中蛋白激酶CCK1調(diào)控毒素的產(chǎn)生，這與其它病菌中蛋白激酶如玉米小斑病菌CHK1[17]、玉米大斑病菌STK1[18]和柑橘褐斑病菌（A. alternata）AaSLT2[19]調(diào)控毒素產(chǎn)生的報(bào)道一致。不同接種方法產(chǎn)生如此大差異的原因可能有2方面：一是毒素并非是C. cassiicola唯一的致病因子，可能在菌絲生長(zhǎng)過程中還分泌了其它致病因子；二是蛋白激酶CCK1在C. cassiicola與寄主早期識(shí)別過程中可能起著重要作用。這樣，（1）用菌餅接種時(shí)，CCK1突變體因?yàn)槿笔У鞍准っ付荒茏R(shí)別寄主，胞外信號(hào)傳導(dǎo)中斷，毒素及其它致病因子不能表達(dá)，因此失去了致病力；而在毒素突變體中毒素基因雖然被破壞，但蛋白激酶CCK1正常，病原菌能識(shí)別寄主，其它致病因子能正常合成和分泌，只是致病力因毒素被破壞而減弱。 （2）用粗毒素液接種時(shí)，不存在病原菌與寄主的識(shí)別，只有累積的毒素和其它致病因子對(duì)寄主的損傷作用；對(duì)于CCK1突變體，因缺失CCK1的調(diào)控而減弱了毒素合成或分泌能力，但能正常分泌其它致病因子（甚至分泌更多的漆酶和纖維素酶，尚未發(fā)表），所以致病性雖有下降，但仍能致?。粚?duì)于毒素突變體，毒素合成受阻，但其它致病因子表達(dá)正常，所以其毒素粗提液仍能致病，但致病力因缺少毒素而更低?？傊?，C. cassiicola感染寄主使其發(fā)病的程度，可能由蛋白激酶CCK1調(diào)控下的病原菌與寄主的識(shí)別、侵入、產(chǎn)生的毒素及其它致病因子共同來決定。

SEFA-PCR技術(shù)是王世明博士發(fā)明的一種快速擴(kuò)增某已知DNA序列側(cè)翼序列的有效方法[11]。但缺點(diǎn)是有時(shí)因獲得片段過長(zhǎng)，不易克隆測(cè)序，又因第二輪擴(kuò)增獲得的序列兩端反向互補(bǔ)，也無法用第二輪擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR產(chǎn)物測(cè)序。本次試驗(yàn)巧妙地通過在用于SEFA-PCR的第二個(gè)和第三個(gè)引物序列之間、設(shè)計(jì)了1個(gè)單向測(cè)序引物克服了這一難題，使得通過SEFA-PCR技術(shù)順利獲得已知DNA序列的側(cè)翼序列變得更加容易。

參考文獻(xiàn)

[1] Pu J J， Zhang X， Qi Y X， et al. First record of Corynespora leaf fall disease of Hevea rubber tree in China[J]. Australasian Plant Disease Notes， 2007， 2（1）： 35-36.

[2] Cai J M， Chen Y， Pan X M， et al. Disease severity investigation and pathogeny identification of Corynespora fall leaf disease of Hevea brasiliensis in Hainan province（in Chinese）[J]. Chinese Journal of Tropical agriculture， 2008， 28（5）： 1-7， 10.

[3] Onesirosan P， Mabuni C T， Durbin R D， et al. Toxin production by Corynespora csssiicola[J]. Physiological Plant Pathology， 1975， 5（11）： 289-295.

[4] Breton F， Sanier C D， Auzac J. Role of cassiicolin，a host selective toxin in pathogenicity of Corynespora cassiicola， causal agent of a leaf fall disease of Hevea[J]. Journal of Rubber Research， 2000， 3（2）： 115-128.

[5] De Lamotte F， Duviau M P， Sanier C， et al. Purification and characterization of cassiicolin，the toxin produced by Corynespora cassiicola， causal agent of the leaf fall disease of rubber tree[J]. Journal of chromatography B， Analytical technologies in the biomedical and life sciences， 2007，849（1-2）：357-362.

[6] Barthe P， Pujade-Renaud V， Breton F， et al. Structural analysis of cassiicolin，a host-selective protein toxin from Corynespora cassiicola[J]. Journal of Molecular Biology， 2007， 367（1）： 89-101.

[7] Sunderasan E， Kadir R.A， Pujade-Renaud V， et al. Single-chain variable fragments antibody specific to Corynespora cassiicola toxin， cassiicolin，reduces necrotic lesion formation in Hevea brasiliensis[J]. Journal General Plant Pathology， 2009， 75（1）： 19-26， 37.

[8] 林春花， 彭建華， 時(shí) 濤，等. 橡膠樹多主棒孢病菌毒素的純化[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2010， 31（6）： 984-988.

[9] Déon M， Bourré Y， Gimenez S， et al. Characterization of a cassiicolin-encoding gene from Corynespora cassiicola， pathogen of rubber tree（Hevea brasiliensis）[J]. Plant Science， 2012， 185-186： 227-237.

[10] Qi Y X， Zhang X， Pu J J， et al. Morphological and molecular analysis of genetic variability within isolates of Corynespora cassiicola from different hosts[J]. Eur J Plant Pathol， 2011， 130（1）： 83-95.

[11] Wang S M， He J， Cui Z L， et al. Self-formed adaptor PCR： a simple and efficient method for chromosome walking[J]. Applied and Environmental Microbiology， 2007， 73（15）： 5 048-5 051.

[12] 張 賀， 張 欣， 蒲金基，等. 巴西橡膠樹品系對(duì)棒孢霉落葉病的抗病性鑒定[J]. 植物保護(hù)， 2008， 34（4）： 54-56.

[13] 盧 昕， 彭建華， 張科立，等. 巴西橡膠樹主要種質(zhì)對(duì)棒孢霉落葉病抗性評(píng)價(jià)[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2007， 28（4）： 73-77.

[14] Cheng Y Q， Walton J D. A eukaryotic alanine racemase gene involved in cyclic peptide biosynthesis[J]. Journal of biological chemistry， 2000， 275（7）： 4 906-4 911.

[15] Baker S E， Kroken S， Inderbitzin P， et al. Two polyketide synthases are required for biosynthesis of the polyketide virulence factor， T-toxin， by Cochliobolus heterostrophus[J]. Molecular Plant-Microbe Interaction， 2006， 19（2）： 39-149.

[16] Tanaka A， Tsuge T. Structural and functional complexity of the genomic region controlling AK-toxin biosynthesis and pathogenicity in the Japanese pear pathotype of Alternaria alternata[J]. Molecular Plant-Microbe Interaction， 2000， 13（9）： 975-986.

[17] Igbaria A， Lev S， Rose M S， et al. Distinct and combined roles of the MAP kinases of Cochliobolus heterostrophus in virulence and stress responses[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions， 2008， 21（6）： 769-780.

[18] 谷守芹. 調(diào)控玉米大斑病菌生長(zhǎng)發(fā)育和致病性的STK1基因的克隆與功能分析[D]. 保定： 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2007.

[19] Yago J I， Lin C H， Chung K R. The SLT2 mitogen-activated protein kinase-mediated signalling pathway governs conidiation， morphogenesis， fungal virulence and production of toxin and melanin in the tangerine pathotype of Alternaria alternata[J]. Molecular Plant Pathology， 2011， 12（7）： 653-655.