豬圓環(huán)病毒2型LAMP檢測方法的建立

陳星瑤 張子群 王曉龍

摘 要：豬圓環(huán)病毒2型屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，是引起仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）的主要病原。該病在世界范圍內(nèi)廣泛流行，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成一定的經(jīng)濟(jì)損失。目前針對(duì)PCV-2的檢測技術(shù)還有提升的空間，因此本研究針對(duì)PCV-2 的Cap 基因高度保守的區(qū)域作為靶序列設(shè)計(jì)引物，建立了一種可快速、靈敏、特異地檢測PCV-2 的LAMP 檢測方法。

關(guān)鍵字：豬圓環(huán)病毒2型；環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）

豬圓環(huán)病毒2型（PCV-2）屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，是20世紀(jì)末期被發(fā)現(xiàn)的單鏈負(fù)股DNA病毒，病毒粒子呈二十面體對(duì)稱，無囊膜，直徑大約17 nm。PCV-2是引起仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征（Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）的主要病原[1]。目前，該病在世界范圍內(nèi)的廣泛流行已經(jīng)給各國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。國內(nèi)經(jīng)過血清學(xué)和流行病學(xué)調(diào)查也證實(shí)了PCV-2感染非常嚴(yán)重[3-6]。2002年，由PCV-2感染引起的PMWS在全國各地爆發(fā)式流行，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3]。PMWS已成為我國規(guī)?；i場危害養(yǎng)豬生產(chǎn)的重要免疫抑制性疫病之一[7]。當(dāng)下建立一種便捷、快速、特異的PCV-2檢測方法，以確保及時(shí)發(fā)現(xiàn)并采取有效措施控制PMSW的發(fā)生就顯得非常重要。

環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（1oop-mediated isothermal amplification， LAMP）是2000 年由日本的Notomi 等人發(fā)明的一種新穎的恒溫核酸擴(kuò)增方法[8]。由于LAMP具有反應(yīng)條件非常簡單、結(jié)果讀判方便，加之其敏感、特異、快速的優(yōu)點(diǎn)，已被用于多種病原的檢測診斷[9， 10]。本研究針對(duì)PCV-2 的Cap 基因高度保守的區(qū)域作為靶序列設(shè)計(jì)引物，旨在建立一種可快速、靈敏、特異地檢測PCV-2 的LAMP 檢測方法.。

1材料和方法

1.1病毒來源

豬圓環(huán)病毒2型、豬細(xì)小病毒、豬繁殖與呼吸綜合征、偽狂犬病毒基因組以及豬瘟病毒cDNA、豬流感cDNA、口蹄疫cDNA、豬藍(lán)耳病cDNA由本實(shí)驗(yàn)室分離并保存。

1.2主要試劑及儀器

Marker（DL2000，DL100）購自大連TaKaRa公司，dATP，dTTP，dCTP，dGTP均購買自大連寶生物公司。Bst DNA聚合酶，瓊脂糖，甜菜堿，鎂離子購自NEB公司；其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3引物設(shè)計(jì)及制備

應(yīng)用網(wǎng)上Lamp引物設(shè)計(jì)軟件（PrimerExplorerV3）對(duì)Cap基因設(shè)計(jì)引物（圖1），從獲得的數(shù)百對(duì)引物中選擇評(píng)分較高的引物，送南京金斯瑞生物工程有限公司進(jìn)行5'端修飾合成。

1.4 豬圓環(huán)病毒2型LAMP檢測方法的建立

豬圓環(huán)病毒2型陽性樣本測序后測定濃度，分裝備用。

配制LAMP（2×）的反應(yīng)緩沖液： 1M Tris-HCl （pH8.8） 貯存液 40 mL，KCl 1.49 g ，MgSO4 1.93 g，（NH4）2SO4 2.64 g，Tween-20 2 mL，Betaine 187.4g，將上述藥品混合后加入ddH2O定容至900 mL，混勻后取900 μL，再加入100 μL的 25 mM dNTP混合液（dATP 25 μL、dCTP 25μL、dGTP 25μL、dTTP 25μL）。

配制LAMP引物混合物（100uM Primer stock）包括：FIP 20 μL，BIP 20 μL，F(xiàn)3 2.5 μL和B3 2.5 μL。

25 μLLAMP的反應(yīng)體系：Bst DNA 聚合酶1 μL，豬圓環(huán)病毒2型DNA 2 μL，ddH2O 8.6 μL，2倍的反應(yīng)緩沖液12.5 μL，引物混合物0.9 μL。

1.5 LAMP反應(yīng)條件優(yōu)化

反應(yīng)溫度優(yōu)化：根據(jù)反應(yīng)體系優(yōu)化策略，設(shè)置4組實(shí)驗(yàn)，分別為60℃，62℃，64℃及66℃，按1.4反應(yīng)體系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)時(shí)間為1 h，結(jié)束后各取2 μL樣品在2%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行分析。

反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化：分別設(shè)置3個(gè)實(shí)驗(yàn)組，時(shí)間分別為30 min，45 min和60 min，按1.4反應(yīng)體系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)在62℃下進(jìn)行，結(jié)束后各取2 μL樣品在2%瓊脂糖凝膠中分析。

1.6 LAMP靈敏度檢測實(shí)驗(yàn)

將前述提取的豬圓環(huán)病毒2型DNA進(jìn)行濃度測定，依次倍比稀釋成107～10-2個(gè)拷貝，按照上述1.4反應(yīng)條件檢測豬圓環(huán)病毒2型LAMP引物的靈敏性。

1.7 LAMP特異性檢測實(shí)驗(yàn)

以豬細(xì)小病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、偽狂犬病毒、豬瘟病毒、豬流感病毒、口蹄疫病毒、豬藍(lán)耳病病毒和水，制備DNA或cDNA作為模板，按照建立的方法進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，檢測豬圓環(huán)病毒2型LAMP的特異性。

1.8染料可視化試驗(yàn)

為進(jìn)一步優(yōu)化LAMP的反應(yīng)條件，在LAMP反應(yīng)結(jié)束后，加入2 μLSYBR Green Ⅰ熒光染料觀察陰性和陽性反應(yīng)顏色的變化情況。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 LAMP反應(yīng)條件優(yōu)化

2.1.1溫度優(yōu)化

豬圓環(huán)病毒2型LAMP引物溫度優(yōu)化中，擴(kuò)增60 min后電泳檢測結(jié)果如圖2所示，其中60℃，62℃和64℃有擴(kuò)增條帶產(chǎn)生，66℃無條帶產(chǎn)生，陰性對(duì)照無條帶產(chǎn)生，因此LAMP引物擴(kuò)增溫度可選擇60℃，62℃，64℃中任一溫度。

2.1.2時(shí)間優(yōu)化

豬圓環(huán)病毒2型LAMP引物擴(kuò)增在60℃下擴(kuò)增不同時(shí)間的后核酸電泳檢測結(jié)果（見圖3）。其中擴(kuò)增45 min、60 min后均有擴(kuò)增條帶產(chǎn)生，30 min無條帶產(chǎn)生，因此可選擇LAMP反應(yīng) 60℃下的擴(kuò)增時(shí)間為45 min。

2.2 LAMP靈敏度檢測實(shí)驗(yàn)

豬圓環(huán)病毒2型LAMP引物擴(kuò)增不同濃度梯度基因后核酸電泳檢測結(jié)果，擴(kuò)增條件為60℃，擴(kuò)增時(shí)間為45 min。如圖所示：107～101個(gè)拷貝的模板均有特異性產(chǎn)物產(chǎn)生，其余無條帶產(chǎn)生，圖4可看出本研究所設(shè)計(jì)的LAMP引物在60℃下，擴(kuò)增45 min之后最少可檢出10個(gè)拷貝的模板。

2.3LAMP特異性檢測實(shí)驗(yàn)

以豬圓環(huán)病毒2型基因組為模板，使用LAMP引物在60℃下擴(kuò)增45 min后核酸電泳檢測結(jié)果。由圖5可見，豬圓環(huán)病毒2型LAMP引物特異性擴(kuò)增出了豬圓環(huán)病毒2型基因片段，而與其他病原并無交叉反應(yīng)。

2.4染料可視化試驗(yàn)

向LAMP引物擴(kuò)增不同濃度梯度基因的反應(yīng)產(chǎn)物管內(nèi)加2 μl SYBR GreenⅠ熒光染料，肉眼觀察，陽性反應(yīng)管顏色立刻變?yōu)辄S綠色，且模板濃度不同顏色有深淺變化（圖6）。由此可見，LAMP 反應(yīng)結(jié)果容易判定，臨床推廣。

3討論

豬圓環(huán)病毒根據(jù)基因型和致病性可分為PCV-1和PCV-2兩種類型，PCV1沒有致病性。系統(tǒng)發(fā)生分析結(jié)果表明，PCV-1和PCV-2屬于不同基因群，但其基因組仍存在較高的同源性[11]，與病毒復(fù)制相關(guān)的DNA復(fù)制起始區(qū)（Ori）和復(fù)制酶編碼基因（Rep）序列同源性分別為79.5%和82%，衣殼蛋白編碼基因（Cap）存在較大差異，同源性僅為62%[12]。

建立PCV-2的LAMP檢測方法，引物的設(shè)計(jì)是關(guān)鍵。PCV-2含有11個(gè)閱讀框，其中第一個(gè)和第二個(gè)為主要的閱讀框，各實(shí)驗(yàn)室目前基因疫苗的研制主要圍繞這兩段基因序列。第一個(gè)閱讀框編碼與復(fù)制相關(guān)的酶，第二個(gè)閱讀框PCV-2 Cap基因編碼該病毒衣殼蛋白，基因N端123個(gè)堿基為信號(hào)肽編碼序列，編碼的衣殼蛋白上有病毒的主要保護(hù)性抗原位點(diǎn)，具有免疫原性，能引起機(jī)體產(chǎn)生抗體，故選取該基因進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。

LAMP技術(shù)可以保證擴(kuò)增的高特異性和高效率，其依賴于能夠識(shí)別靶DNA 上6個(gè)特定區(qū)域的4條引物和一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在恒溫條件下擴(kuò)增核酸，能從僅相差一個(gè)核苷酸的基因標(biāo)本中找出相應(yīng)靶序列進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增與否即可判斷目的基因是否存在。

綜合文中的試驗(yàn)結(jié)果，LAMP 檢測技術(shù)為豬圓環(huán)病毒2型基因的診斷提供了一種快速、便捷且特異性強(qiáng)、敏感性高的檢測方法，可用于豬圓環(huán)病毒2型臨床檢測，并具有非常良好的應(yīng)用前景?！觯ň庉嫞汉畏迹?/p>

參考文獻(xiàn)：

[1] Clark EG. Post-weaning multisystemic wasting syndrome[J]. Proceeding of the American Association of Swine Practitioners， 1997；28.

[2] Neumann E， Dobbinson S， Welch E， et al. Descriptive summary of an outbreak of porcine post-weaning multisystemic wasting syndrome （PMWS） in New Zealand[J]. New Zealand veterinary journal， 2007；55：346-52.

[3] 王忠田， 楊漢春， 郭鑫. 規(guī)?；i場豬圓環(huán)病毒2型感染的流行病學(xué)調(diào)查[J]. 中國獸醫(yī)雜志， 2002：3-6.

[4] 楊漢春. 豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征的控制策略[J]. 中國獸醫(yī)雜志， 2002：46-7.

[5] 周繼勇， 陳慶新， 葉菊秀， 等. 豬圓環(huán)病毒2型感染的血清學(xué)分析[J]. 中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)， 2004：1-3.

[6] 郎洪武，張廣川， 吳發(fā)權(quán)，等. 斷奶豬多系統(tǒng)衰弱綜合征血清抗體檢測[J].中國獸醫(yī)科技， 2000；30.

[7] 楊漢春. 豬免疫抑制性疾病的流行特點(diǎn)與控制對(duì)策[J]. 中國畜牧獸醫(yī)， 2004：41-3.

[8] Notomi T， Okayama H， Masubuchi H， et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J]. Nucleic acids research， 2000；28：e63-e.

[9] Yang Z， Wei X， Wang Y， et al. Primary Study on Rapid Detection of European brown hare syndrome virus by RT-LAMP. Biomedical Engineering and Biotechnology （iCBEB）， 2012 International Conference on： IEEE； 2012. p. 441-5.

[10] FANG X LJ， CHEN Q. One New Method of Nucleic Acid Amplification-Loop-mediated Isothermal Amplification of DNA[J]. Virol Sin， 2008；23：167-72.

[11] MahéD， Blanchard P， Truong C， et al. Differential recognition of ORF2 protein from type 1 and type 2 porcine circoviruses and identification of immunorelevant epitopes[J]. Journal of General Virology， 2000；81：1815-24.

[12] 張應(yīng)國， 張文東， 宋建領(lǐng)， 等. 豬圓環(huán)病毒基因組結(jié)構(gòu)及其分子特征研究進(jìn)展[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展， 2006：6-10.

[13] Mori Y， Nagamine K， Tomita N， et al. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation[J]. Biochemical and biophysical research communications， 2001；289：150-4.