錐栗總RNA提取方法比較及LFY基因克隆

郜祥雄等

摘 要 錐栗總RNA的提取質(zhì)量是后期錐栗空棚分子機(jī)理研究的關(guān)鍵。以錐栗花序為材料，采用2種植物RNA快速提取試劑盒、改良Trizol法和改良CTAB法提取錐栗總RNA，并采用多種方法檢測提取出的總RNA的質(zhì)量。結(jié)果表明：采用改良CTAB法獲得的總RNA可明顯看到28S和18S條帶，且亮度比約為2 ∶ 1，DNA基本無殘留，點(diǎn)樣孔無雜質(zhì)，OD260/OD280均接近2，而OD260/OD230均超過2，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄可作為模板，獲得LFY基因。改良后CTAB法最合適，所得的總RNA產(chǎn)量高、比較純凈、完整，可用于后續(xù)的逆轉(zhuǎn)錄并進(jìn)行基因片段的擴(kuò)增。

關(guān)鍵詞 錐栗；RNA；花序；LFY

中圖分類號 S664.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Abstract The quality of extracted total RNA is the key to study the molecular mechanism of chinquapin later. In this study， chinquapin inflorescences were taken as the material. The study used two types of plant RNA Rapid Extraction kit， a modified trizol method and a improved CTAB method to extract the chinquapin total RNA， and used some methods to test the quality of the RNA. The total RNA obtained by improved CTAB method could significantly observe 28S and 18S bands and the brightness ratio was about 2 ∶ 1， DNA hardly leave， spotting holes without impurities， OD260/OD280 were close to 2， while OD260/OD230>2. The RNA can be used as a template after reverse transcription to obtain LFY gene. The improved CTAB method was most appropriate， the total RNA had high yield and relatively pure， complete and could be used for subsequent reverse transcription reaction to clone.

Key words Chinquapin（Castanea henryi）；RNA；Inflorescence；LFY

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.09.015

錐栗（Castanea henryi Rehd.&Wils.），在福建俗稱“榛子”，屬山毛櫸科栗屬植物[1]。錐栗果實含有大量淀粉，屬于淀粉植物，其營養(yǎng)價值高于面粉、大米和薯類[2]，是福建北部較為特色產(chǎn)品和天然綠色食品。閩北各縣市大量栽培錐栗，還有大量的天然錐栗林的分布[3-6]?？傊S富的錐栗資源，如能得到充分利用，一定可以為閩北農(nóng)村地區(qū)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展起到重要的作用。

空棚，即栗果成熟后苞殼中不能形成栗子造成空苞的現(xiàn)象，在生產(chǎn)上普遍存在，且對產(chǎn)量影響極大。錐栗空棚的原因主要有3種觀點(diǎn)[7-10]：開花期授粉受精不良而引起；品種遺傳問題；胚胎發(fā)育的營養(yǎng)問題。由于營養(yǎng)不良，尤其是缺硼，樹體營養(yǎng)滿足不了堅果生長發(fā)育所需的養(yǎng)分，因此發(fā)生部分胚發(fā)育不全或停止發(fā)育而形成空苞。同時，在生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)錐栗雄花的開花數(shù)量極大，而雌花的開花量則很小，雌雄花序比為1：（12～15），雌雄花比為1：（2 000～4 000）[11]，這在板栗上也有類似的狀況[12]，大量的雄花，需要消耗大量的樹體營養(yǎng)，對錐栗胚胎發(fā)育和果實膨大的營養(yǎng)供給造成很大的障礙。開展錐栗空棚分子機(jī)理的研究，對找出并解決錐栗空棚問題尤為重要。

目前，錐栗的研究主要集中于栽培[13-15]，病蟲害防治[16-18]及采后錐栗果實的保存加工[19-21]等方面，而分子生物學(xué)方面主要是錐栗的RAPD[22]和ISSR[23-24]分析以及蛋白質(zhì)[25-27]等研究，未對錐栗空棚的分子機(jī)理展開研究。因此，本研究以錐栗花序為材料，提取得到高質(zhì)量的總RNA，為開展錐栗空棚分子機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

材料為錐栗的花序，品種為烏殼長芒，4月份在建甌采集已抽生花序的結(jié)果枝，放入冰盒中帶回福州，進(jìn)行液氮處理，放入-40 ℃冰箱中保存。

CTAB提取液：1.4 mol/L NaCl，0.1 mol/L Tris-HCl（pH=8.0），20 mmol/L EDTA（pH=8.0），2% CTAB，2%PVP-40，β-巰基乙醇（用前每1 mL提取液加入20 μL）；SuperscriptTMⅢ First-Strand cDNA Synthesis System for RT-PCR試劑盒（Invitrogen）。

1.2 方法

1.2.1 錐栗花序總RNA的提取 采用改良CTAB法[28-31]，具體方法：

取2個1.5 mL的離心管，加入1 mL的CTAB提取液，放入65 ℃水浴鍋中預(yù)熱30 min。稱取0.2 g錐栗樣品，灼燒，并用液氮冷卻，迅速研磨，并分裝至預(yù)熱好的離心管中，每管加20 μL β-巰基乙醇，渦旋4 min，放入65 ℃水浴20 min，顛倒混勻3次。

在離心管加入300 μL氯仿，振蕩，12 000 r/min 4 ℃離心10 min；取上清液（700 μL）到新離心管中，并加入等體積的氯仿，振蕩，12 000 r/min 4 ℃離心10 min，取上清液（450 μL）到新離心管中，加入等體積的8 mol/L LiCl，輕輕搖勻，放入4 ℃冰箱沉淀3～4 h。

沉淀后，12 000 r/min 4 ℃離心10 min，移除上清，加入800 μL 75%乙醇洗滌，振蕩，12 000 r/min 4 ℃離心3 min，用200 μL以下的移液槍移除乙醇，微離心之后，再用10 μL移液槍移除多余的乙醇，放在超凈工作臺內(nèi)慢風(fēng)10 min。

加入30 μL ddH2O溶解，若總RNA得率低，可稍加水溶解。

Trizol法，EASYspin植物RNA快速提取試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司）和柱式植物RNAout Column Plant RNAout（北京天恩澤基因科技有限公司天凈沙系列）提取RNA具體方法詳見陳桂信等[32]研究方法和試劑盒使用說明書。

1.2.2 LFY基因片段的克隆 驗證所獲得的RNA質(zhì)量，采用Invitrogen公司的SuperscriptTMⅢ First-Strand cDNA Synthesis System for RT-PCR試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，并以此產(chǎn)物進(jìn)行RT-PCR。

利用板栗LFY基因（DQ270548.1）設(shè)計RT-PCR上下游引物，分別如下：

LFY61上 5′-AAGCTAGCTTCATTGATGGATC-3′

Tm值：53.9 ℃

LFY908下5′-GCCTTCTTCGCAAACCTAA-3′ Tm值：53.0 ℃

LFY1171下 5′-CATGACAAAGTTGCCGAAGTT-3′

Tm值：53.7 ℃

上述引物由上海博尚生物技術(shù)有限公司合成。

RT-PCR具體反應(yīng)體系：0.5 μL逆轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物、上下游引物各1 μL、10 mmol/L dNTPmix 0.5 μL、10×Ex-Taq buffer 2.5 μL、Ex-Taq（5 U/μL） 0.2 μL，用ddH2O補(bǔ)足至25 μL。梯度PCR程序為：94 ℃，5 min→94 ℃，40 s→49.5 ℃，50 ℃，51.5 ℃和52 ℃共4個梯度，40 s→72 ℃，40 s（回到第2步，再進(jìn)行34個循環(huán)）→復(fù)性72 ℃，10 min→4 ℃，0 s。

取PCR產(chǎn)物10 μL進(jìn)行1.5%瓊脂糖膠檢測，根據(jù)引物設(shè)計的上下游大小，估計目的條帶大小，在紫外光下將目的條帶切下。將回收純化、載體連接轉(zhuǎn)化后獲得的菌液進(jìn)行測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 錐栗花序總RNA瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光檢測

應(yīng)用Trizol法和EASYspin植物RNA快速提取試劑盒提取，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠檢測，泳道上均不能看到任何條帶，說明未能獲得RNA，而采用柱式植物RNAout試劑盒和改良CTAB法提取可獲得錐栗總RNA。由圖1可知，A泳道28S和18S條帶均較亮，且28S的亮度差不多為18S亮度的2倍，但此方法DNA去除效果較差，DNA殘留較多，點(diǎn)樣孔雜質(zhì)殘留較多；B泳道可明顯看到28S和18S條帶，且亮度比約為2 ∶ 1，而DNA殘留基本沒有，點(diǎn)樣孔無雜質(zhì)。

純RNA溶液的OD260/OD280比值應(yīng)介于1.8～2.0之間，如果小于這個值，則說明有蛋白質(zhì)的污染或是RNA發(fā)生降解，OD260/OD230比值應(yīng)大于2.0，如果遠(yuǎn)小于這個值，則表明其中有大量的小分子或鹽存在。RNA濃度（μg/μL）=OD260×200×40/1 000。由表1可知，改良CTAB法OD260/OD280為1.97，OD260/OD230為2.10，改良后的CTAB法提取的總RNA基本全部滿足要求。

2.2 LFY基因片段的克隆

由圖2可知，使用“LFY61上”作為上游引物，下游引物選擇“LFY908下”時，目的片段847 bp，第2，3泳道均為該下游引物擴(kuò)增出來的條帶，第2泳道退火溫度為49.5 ℃，第3泳道為51.5 ℃，在接近850 bp的位置，以上泳道均出現(xiàn)目的條帶，但第3泳道亮度明顯比第2泳道高，以第3泳道的條帶回收；下游引物選擇“LFY1171下”時，目的片段1 110 bp，4，5泳道均為該下游引物擴(kuò)增出來的條帶，第4泳道退火溫度為50 ℃，第5泳道為52 ℃，在接近1 110 bp的位置，以上泳道均出現(xiàn)目的條帶，但第5泳道亮度明顯比第4泳道高，以第5泳道的條帶回收。

經(jīng)測序得848 bp和1 111 bp的片段，在NCBI進(jìn)行核苷酸比對，與板栗等LFY基因同源性高，說明所提取的RNA能夠應(yīng)用于基因克隆。1 111 bp序列在NCBI進(jìn)行序列的blastn（圖3），與其他植物同源性71%～99%，與板栗LFY基因的同源性最高，達(dá)99%，可以確定此序列為錐栗花序LFY同源基因片段，證明改良CTAB法提取的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到模板cDNA的純度高，滿足后續(xù)PCR的要求。

3 討論與結(jié)論

Northern雜交分析、基因體外翻譯、cDNA文庫構(gòu)建、cDNA末端快速擴(kuò)增（RACE）、差異顯示反轉(zhuǎn)錄PCR（DDRT-PCR）、cDNA-AFLP和同源克隆等[33-34]研究時均需要提取RNA，成功提取高質(zhì)量總RNA是進(jìn)行分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)。無降解的mRNA才能真實地反映出細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)情況，因此需要提取高純度和無基因組DNA的錐栗花序總RNA，為后續(xù)的錐栗空棚分子機(jī)理研究做準(zhǔn)備。

在植物RNA的提取過程中，植物細(xì)胞破碎后細(xì)胞內(nèi)源RNase會降解mRNA，多酚類物質(zhì)和多糖也從細(xì)胞中釋放，影響RNA的提取。植物內(nèi)源RNase污染首先要通過選用適當(dāng)?shù)腞NA提取方法，盡量縮短提取時間來解決，還可加入適量的RNase抑制劑來有效抑制RNase的活性，且盡量在低溫下完成所有操作[34-35]。多酚類物質(zhì)的氧化產(chǎn)物與RNA的結(jié)合是不可逆的，產(chǎn)生褐化效應(yīng)，導(dǎo)致RNA降解和喪失活性[36]，去除酚類化合物在提取的初始階段防止其被氧化，可通過還原劑法、螯合劑法、Tris-硼酸法、牛血清白蛋白（BSA）法，丙酮法等[37-38]將其與RNA分開。RNA樣品中殘留的多糖會抑制逆轉(zhuǎn)錄酶的活性，且多糖能與RNA共沉淀形成難溶膠狀物，多糖的許多理化性質(zhì)與RNA很相似，在多糖去除的同時，RNA得率也會降低[39]。王玉成等[38]總結(jié)去除多糖的方法有：材料為幼嫩部位或?qū)⒅参镞M(jìn)行水培等；采用直接鉤出多糖法、CTAB沉淀法、LiCl法、2-甲氧基乙醇抽提法、溴化乙錠抽提法和KAc法等方法去除多糖。

近幾年，RNA提取試劑盒的使用，提高了植物RNA提取速度，且操作簡便，耗時較少，是實驗室人員的常選方案，但其價格偏貴。隨著中國一些生物技術(shù)公司的興起，國產(chǎn)的一些RNA提取試劑盒較便宜，但其對材料的要求較高，適用性和提取質(zhì)量上還有很大的不足。Trizol法在很多的實驗室中普遍應(yīng)用，具有用量少，操作簡易，提取效果好等優(yōu)點(diǎn)。因此，本試驗首先用EASYspin植物RNA快速提取試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司），但一直都沒提出RNA，后改用Trizol法，為提高Trizol法去除多酚的能力，加入PVPP（研磨材料時加入）和β-巰基乙醇，均未能提出RNA，而柱式植物RNAout Column Plant RNAout（北京天恩澤基因科技有限公司天凈沙系列）試劑盒提取時，獲得較好的RNA條帶，但是DNA殘余量較大，采用改良后的CTAB法，得到較理想的RNA條帶。該CTAB法經(jīng)多次重復(fù)試驗，包括減少錐栗花序的用量至每管0.05 g，減少LiCl沉淀時間至3 h均能穩(wěn)定提出高質(zhì)量的RNA。該方法使用較高濃度的CTAB不僅能對植物細(xì)胞有較好的裂解作用，而且還能有效地分離核蛋白與核酸的復(fù)合物，同時和β-巰基乙醇、PVP共同作用，可以更為有效地變性蛋白和抑制RNase的活性，本試驗的CTAB提取液加入1.4 mol/L NaCl，而較高濃度的NaCl，是去除多糖污染的有效手段，因此更有效地將樣品中的多糖去除。

本試驗吸收前人研究經(jīng)驗，通過綜合及改良，形成錐栗RNA提取的適合方法，提高錐栗總RNA的提取質(zhì)量，是后期錐栗空棚分子機(jī)理研究的關(guān)鍵，為后續(xù)試驗打下良好基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] 張玉星. 果樹栽培學(xué)各論（北方本）[M]. 北京： 中國農(nóng)業(yè)出版社， 2003： 262.

[2] 馮金玲， 楊志堅， 陳 輝. 錐栗的研究進(jìn)展[J]. 亞熱帶農(nóng)業(yè)研究， 2009， 5（4）： 237-241.

[3] 鄭誠樂， 江 由. 閩北錐栗品種資源及其利用前景[J]. 福建農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報， 1998， 27（3）： 291-295.

[4] 夏瑞滿， 吳東平， 吳云峰， 等.我國錐栗主產(chǎn)區(qū)發(fā)展現(xiàn)狀與對策[J]. 中南林業(yè)調(diào)查規(guī)劃， 2008， 27（3）： 59-61.

[5] 孫鄭英， 范渠森. 政和縣錐栗產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀及可持續(xù)發(fā)展對策[J].柑桔與亞熱帶果樹信息， 2005， 21（4）： 16.

[6] 陳秀琴. 閩北主要錐栗品種及其栽培管理技術(shù)[J]. 福建農(nóng)業(yè)科技， 2007（6）： 22-24.

[7] 范淑珠， 潘香玉. 錐栗空棚癥的發(fā)生與防治[J]. 上海農(nóng)業(yè)科技， 2005（2）： 103.

[8] 鄭誠樂， 黃雪羚， 江 由. 板栗空棚問題的研究進(jìn)展[J]. 福建果樹， 1995（2）： 22-24.

[9] 張宇和. 栗樹研究綜述[J]. 園藝學(xué)報， 1963， 2（2）： 133-148.

[10] 鄭誠樂.錐栗若干生物學(xué)問題研究[D].福州：福建農(nóng)林大學(xué)，2008.

[11] 鄭誠樂. 錐栗板栗無公害栽培[M]. 福建科學(xué)技術(shù)出版社， 2008： 121.

[12] 郭成圓， 魏安智， 呂平會， 等.板栗雛梢分化期內(nèi)源激素的動態(tài)變化特征[J]. 西北植物學(xué)報， 2010， 30（10）： 2 06l-2 066.

[13] 吳盛清. 促進(jìn)錐栗優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)高效修剪技術(shù)的探討[J]. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)科技， 2006（7）： 132-133.

[14] 蔣福勇. 大果錐栗簡要栽培技術(shù)[J]. 廣西園藝， 2008， 19（3）：57-58.

[15] 張世珍. 低產(chǎn)錐栗高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)栽培技巧[J]. 福建農(nóng)業(yè)， 2010（1）：16-17.

[16] 黃宗安. 錐栗疫病的抗病機(jī)制與抗病品種選育研究進(jìn)展[J]. 林業(yè)勘察設(shè)計， 2008（2）： 73-76.

[17] 劉章華， 吳連海， 賴俊聲， 等.錐栗毀滅性蛀干害蟲小蠹蟲的防治[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技， 2009（13）： 158-159.

[18] 黃紅青. 錐栗對栗癭蜂抗性與營養(yǎng)元素關(guān)系研究[J]. 福建林業(yè)科技， 2005， 32（4）： 60-63.

[19] 鮑世利， 陳錦權(quán)， 吳仲弈. 錐栗貯藏保鮮研究[J]. 廣州食品工業(yè)科技， 2003， 19（2）： 18-21.

[20] 謝芬華， 周 峰. 錐栗科學(xué)貯運(yùn)方法[J]. 福建農(nóng)業(yè)， 2005（10）： 24-25.

[21] 陳 欽， 鄒雙全. 錐栗干制研究Ⅱ-錐栗烘干工藝的研究[J]. 經(jīng)濟(jì)林研究， 2002， 20（3）： 39-41.

[22] 俞曉曲. 錐栗胚胎發(fā)育與遺傳多樣性研究[D]. 福州： 福建農(nóng)林大學(xué)， 2006.

[23] 鄭誠樂， 鐘鳳林， 潘東明，等. 錐栗果實雙向電泳體系的建立[J]. 福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）， 2010， 39（5）： 475-479.

[24] 鄭誠樂， 劉小芝， 鐘鳳林， 等.錐栗葉片兩種提取蛋白方法的比較[J]. 中國園藝文摘， 2010（3）： 5-7.

[25] 劉小芝. 硼處理對錐栗葉片及胚中差異蛋白的影響[D]. 福州：福建農(nóng)林大學(xué)， 2010.

[26] 劉國彬. 錐栗自然居群及農(nóng)家品種遺傳多樣性的ISSR分析[D]. 武漢： 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2009.

[27] 劉國彬，羅正榮，龔榜初. 錐栗不同組織基因組DNA的提取及ISSR-PCR驗證[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報， 2010， 22（4）： 420-423.

[28] 趙巍巍， 宗成文， 曹后男， 等. 葡萄花序總RNA提取方法研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2007， 37（32）： 16 161-16 162， 16 176.

[29] 何慶元， 吳 萍， 李正鵬， 等. 苜?？俁NA提取方法比較研究[J]. 中國草地學(xué)報， 2009， 31（1）： 116-120.

[30] 李曉毓， 趙德剛， 李豐伯. 一種適用于木本植物RNA提取的方法[J]. 安徽農(nóng)學(xué)通報， 2007， 13（23）： 42， 56.

[31] 許 鋒， 蔡 榮， 陳柳吉， 等.核桃不同組織高質(zhì)量總RNA的提取方法[J]. 果樹學(xué)報， 2008， 25（3）： 435-439.

[32] 陳桂信， 呂柳新， 賴鐘雄， 等. 嫩芽總RNA的提取與純化[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報， 2004， 26（3）： 324-328.

[33] 林 玲， 楊燕凌， 何海福， 等. 總RNA提取方法的比較與分析[J]. 武夷科學(xué)， 2009（25）： 97-100.

[34] 楊占軍， 谷守琴， 張 健. 幾種植物組織總RNA提取方法的特點(diǎn)及疑難對策[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2009， 37（18）： 8 341-8 342.

[35] 郭長奎， 羅淑萍， 李 疆， 等. 新疆巴旦木花藥總RNA的提取[J]. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2010， 47（5）： 898-901.

[36] 趙寶勰， 程李香， 林必博， 等.兩種馬鈴薯塊莖總RNA提取方法的比較[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2010（1）： 124-127.

[37] 李 宏， 王新力. 植物組織RNA提取的難點(diǎn)及對策[J]. 生物技術(shù)通報， 1999， 1（5）： 1-6.

[38] 王玉成， 楊傳平， 姜 靜.木本植物組織總RNA提取的要點(diǎn)與原理[J]. 東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報， 2002， 30（2）： 1-4.

[39] Manning K. Isolation of nucleic acids from plants by differential solvent precipitation[J]. Analytical Biochemistry，1991， 195（1）： 45-50.