自體脂肪移植及其血管生成的研究進(jìn)展

高揚(yáng) 伍尚敏

嚴(yán)重的燒傷[1]、創(chuàng)傷或正常情況下的美容手術(shù)都有進(jìn)行脂肪組織移植的需求，但脂肪移植在供區(qū)[2]和受區(qū)位點(diǎn)仍然存在一定的限制或可能會(huì)發(fā)生一些并發(fā)癥；而自體脂肪組織作為軟組織修復(fù)重建的材料之一，其具有來(lái)源豐富、取材方便、無(wú)免疫排斥反應(yīng)等特點(diǎn)。自體脂肪移植后因血供不足導(dǎo)致脂肪移植組織被吸收和脂肪細(xì)胞凋亡是影響自體脂肪移植存活率的關(guān)鍵。以自體顆粒脂肪移植或脂肪組織工程學(xué)為主的許多研究已經(jīng)證明了影響自體脂肪移植最重要和最關(guān)鍵的因素是新生血管的質(zhì)量、數(shù)量和新生脂肪組織的長(zhǎng)期存活率[3]。

1關(guān)于脂肪來(lái)源干細(xì)胞（Adipose-derived stem cell, ASC）的研究應(yīng)用

盡管具有無(wú)法預(yù)測(cè)的臨床結(jié)果和低移植存活率，但自體脂肪組織已被用作軟組織缺陷的潛在填充材料。有報(bào)道顯示，ASCs通過(guò)促進(jìn)血管生成在脂肪移植組織存活率方面起到了舉足輕重的作用[4]。含有脂肪來(lái)源干細(xì)胞的自體脂肪組織移植通過(guò)增加血管再生提高了脂肪移植組織的質(zhì)量和存活率，是一種有效的替代治療方法。ASCs的早期作用是誘發(fā)新血管從受區(qū)向周?chē)L(zhǎng)并釋放大量的血管生長(zhǎng)因子到脂肪移植組織,且該效應(yīng)在缺氧環(huán)境下增強(qiáng)。脂肪組織血管再生是自體脂肪移植的關(guān)鍵一步，因?yàn)檠苌刹蛔銓?dǎo)致脂肪移植組織在體內(nèi)被吸收。解決這方面問(wèn)題的一個(gè)可能方法是，聯(lián)合植入ASCs和內(nèi)皮細(xì)胞到受區(qū)，以刺激血管網(wǎng)形成。為此，Strassburg等[5]將分別取自人體腹部的ASCs和人體外周血的內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）進(jìn)行聯(lián)合培養(yǎng)，用以刺激受精雞卵絨毛尿囊膜（CAM）的纖維蛋白結(jié)構(gòu)血管化，并與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）進(jìn)行直接對(duì)比。經(jīng)過(guò)9天的孵化，細(xì)胞-纖維蛋白結(jié)構(gòu)向外延伸，并從組織學(xué)上評(píng)估鳥(niǎo)類(lèi)血管向內(nèi)生長(zhǎng)形成相關(guān)結(jié)構(gòu)和人類(lèi)血管的生成。可得出，通過(guò)聯(lián)合植入人類(lèi)內(nèi)皮細(xì)胞，ASCs成功地引導(dǎo)主要血管轉(zhuǎn)化為相應(yīng)結(jié)構(gòu)（血管化）和毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)形成。由于人類(lèi)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞優(yōu)于EPCs，因此形成了纖維蛋白結(jié)構(gòu)的鳥(niǎo)類(lèi)和人類(lèi)毛細(xì)血管網(wǎng)。以上實(shí)驗(yàn)表明：利用自體顆粒脂肪移植的脂肪來(lái)源干細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞之間的相互作用能促進(jìn)血管生成。

2血管基質(zhì)(Stromal vascular fraction, SVF)的研究

脂肪組織經(jīng)膠原酶消化、過(guò)濾、離心除去成熟脂肪細(xì)胞后，可得到血管基質(zhì)部分（SVF），這種血管基質(zhì)含有多向分化潛能的多功能細(xì)胞（脂肪來(lái)源干細(xì)胞）。因此，Luan等[6]從C57BL/6J-GFP小鼠分離得到SVF并進(jìn)行綠色熒光蛋白染色，再?gòu)腃57BL/6J小鼠腹股溝處切取脂肪組織后剁碎，并與綠色熒光蛋白陽(yáng)性的SVF混合，然后一起植入BALB/c小鼠。運(yùn)用熒光成像技術(shù)探測(cè)植入的綠色熒光蛋白陽(yáng)性的血管基質(zhì)部分細(xì)胞的存活情況，持續(xù)監(jiān)控56天；接著運(yùn)用免疫熒光染色技術(shù)分析第7、14、28、35、 42和56天缺血脂肪組織中的綠色熒光蛋白陽(yáng)性的SVF的分化情況。熒光信號(hào)強(qiáng)度在共同植入的第14天出現(xiàn)大幅度下降，并持續(xù)下降，在第56天有17.3%的信號(hào)強(qiáng)度（相對(duì)于第1天）。免疫熒光染色揭示了一些綠色熒光蛋白陽(yáng)性細(xì)胞從第7天開(kāi)始能自發(fā)性分化成脂肪組織，一些植入的SVF能合并成新生血管。該實(shí)驗(yàn)揭示了SVF參與脂肪移植的血管再生和形成，并表現(xiàn)出了多態(tài)性改變。Lu等[7-8]研究發(fā)現(xiàn)：SVF通過(guò)分泌促進(jìn)脂肪組織再生的生長(zhǎng)因子，促進(jìn)血管再生，增加脂肪來(lái)源干細(xì)胞的密度，提高了移植物的存留率。以上實(shí)驗(yàn)研究表明，通過(guò)自體顆粒脂肪移植，SVF對(duì)自體脂肪移植組織的血管再生起到促進(jìn)作用，值得繼續(xù)研究和探討。

3M2巨噬細(xì)胞對(duì)SVF的輔助作用

由前面研究可知，SVF能通過(guò)增強(qiáng)血管再生極大地提高了脂肪移植組織的存活率。然而，在脂肪移植早期階段，由于急性缺氧，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞聚集。Dong等[9]研究發(fā)現(xiàn)血管基質(zhì)部分細(xì)胞很少能保留到SVF協(xié)助脂肪組織移植的后期；而M2巨噬細(xì)胞通過(guò)充當(dāng)血管再生信號(hào)源增強(qiáng)脂肪移植組織的血管再生，促進(jìn)端細(xì)胞遷移，并協(xié)助端細(xì)胞融合。由M2巨噬細(xì)胞創(chuàng)造的血管再生和抗炎的微環(huán)境可刺激浸潤(rùn)性巨噬細(xì)胞向M2巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化，這些M2巨噬細(xì)胞可通過(guò)促進(jìn)血管再生增加脂肪移植組織的長(zhǎng)期保留?；诖耍赏茢郙2巨噬細(xì)胞能輔助血管基質(zhì)部分細(xì)胞保持其長(zhǎng)期血管再生效應(yīng)，M2巨噬細(xì)胞與脂肪移植組織的微血管形成可能有聯(lián)系。以上的研究和分析使我們對(duì)M2巨噬細(xì)胞有了新的認(rèn)識(shí)，也啟發(fā)了我們對(duì)SVF輔助脂肪組織移植機(jī)制的理解。

4關(guān)于富血小板血漿（Platelet-rich plasma, PRP）的應(yīng)用

富血小板血漿是通過(guò)離心自體全血而獲得的血小板濃縮物。因PRP可來(lái)源于自體，其獲取簡(jiǎn)便，無(wú)免疫排斥反應(yīng)，并發(fā)癥少，研究證實(shí)，PRP還具有使脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和分化的作用。國(guó)內(nèi)外已有將PRP應(yīng)用于顱面及皮膚軟組織修復(fù)等的研究報(bào)道。Li等[10]從一成年女性大腿外側(cè)提取脂肪組織并制備成PRP，向?qū)嶒?yàn)組12只雌性裸鼠背部?jī)蓚?cè)皮下層各注入0.8ml脂肪組織-PRP混合液（10:2），向?qū)φ战M12只雌性裸鼠背部?jī)蓚?cè)皮下層則注入0.8mL脂肪組織-生理鹽水混合液（10:2）。5天后，將0.14ml活化的脂肪組織注入實(shí)驗(yàn)組；10天后，將0.14ml生理鹽水注入對(duì)照組。在15、30、90和180天后，獲取樣本做總量和組織學(xué)觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：移植組織無(wú)炎癥和膿腫形成；實(shí)驗(yàn)組在血管再生、脂肪液化和壞死方面都要好于對(duì)照組；在15、30和90天后，實(shí)驗(yàn)組的移植脂肪的重量和體積均顯著大于對(duì)照組(P<0.05)，但在180天后，兩組沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。組織學(xué)觀察得出：實(shí)驗(yàn)組顯示出了良好的形態(tài)學(xué)，均勻的脂肪，增加的液泡，無(wú)壞死和鈣化；對(duì)照組則顯示為無(wú)序分布，明顯的壞死和鈣化，實(shí)驗(yàn)組壞死區(qū)域的比例顯著低于對(duì)照組(P< 0.05)；在15、180天后，實(shí)驗(yàn)組的微血管數(shù)量顯著多于對(duì)照組(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在180天內(nèi)，反復(fù)利用PRP輔助脂肪移植能明顯提高脂肪移植組織存活率和移植組織質(zhì)量。Willemsen 等[11]做了24例富血小板血漿自體脂肪的雙側(cè)臀部移植，通過(guò)吸取臨近區(qū)域的脂肪獲取輪廓形狀。記錄術(shù)后結(jié)果和并發(fā)癥，并通過(guò)問(wèn)卷調(diào)查來(lái)獲取患者的滿意度和結(jié)果。平均隨訪時(shí)間為44個(gè)月，雙側(cè)脂肪移植量是481cc，術(shù)后隨訪期間無(wú)血腫、感染和其他并發(fā)癥發(fā)生，恢復(fù)快。因此，臀部的PRP脂肪注入術(shù)是安全有效的，其具有低并發(fā)癥和持續(xù)穩(wěn)定性。以上研究表明PRP混合自體顆粒脂肪組織移植能加速移植組織早期血管重建，避免纖維化和脂肪細(xì)胞凋亡，另一方面，制作簡(jiǎn)單，降低了醫(yī)療成本，減輕了患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，且對(duì)患者損傷較小，恢復(fù)快，頗具深入研究的臨床意義。

5關(guān)于透明質(zhì)酸（Hyaluronan，HA）水凝膠的應(yīng)用

透明質(zhì)酸作為一種細(xì)胞外基質(zhì)，被廣泛運(yùn)用于美容修復(fù)領(lǐng)域，具有修復(fù)軟組織缺損的功能，研究發(fā)現(xiàn)，HA還具有促脂肪移植組織血管再生的作用。Alghoul 等[12]從27只大鼠的腹股溝獲取脂肪組織處理后，注入到動(dòng)物們的背部皮下形成2個(gè)移植組織塊：1個(gè)僅包含脂肪，另1個(gè)包含脂肪和透明質(zhì)酸水凝膠的混合物（1:1）。分別在第4、12和20周將它們安樂(lè)死，運(yùn)用高分辨率計(jì)算機(jī)斷層掃描這些活體內(nèi)的移植組織，并計(jì)量?jī)煞N移植組織的體積。之后進(jìn)行組織學(xué)研究并評(píng)估脂肪壞死和血管密度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：所有的移植組織都能存活，和僅包含脂肪的移植組織相比，包含脂肪和HA的移植組織的脂肪壞死有顯著性差異（P<0.001）。這種差異在第4周是最顯著的(P =0.008)，但在第12周和第20周沒(méi)有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在第12周，混合移植組織的血管密度明顯高于脂肪移植組織的(P =0.016)，但這在第4周和第20周并沒(méi)有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在第20周，混合移植組織的脂肪成分明顯比脂肪移植組織有更少的體積丟失(P=0.008)。從而得出，當(dāng)與脂肪組織混合時(shí)，透明質(zhì)酸水凝膠能提高早期脂肪移植的存活率，增加血管分布并使脂肪體積長(zhǎng)期保存。Sarkanen 等[13]將脂肪組織提取物（ATE）和HA混合后注入嚙齒動(dòng)物背部皮下組織。在第1～40周，可觀察到局部炎癥反應(yīng)，血管再生和脂肪形成。運(yùn)用微血管密度分析評(píng)估血管再生，運(yùn)用自動(dòng)圖像分析評(píng)估脂肪生成，運(yùn)用免疫染色評(píng)估免疫反應(yīng)并計(jì)數(shù)炎性細(xì)胞。這種非細(xì)胞移植物在移植早期誘導(dǎo)微血管形成，12周以后有脂肪沉積，同時(shí)皮下組織體積增大，ATE-HA混合物被擁有毛細(xì)血管、神經(jīng)束和健康結(jié)締組織且無(wú)局部炎癥反應(yīng)和囊腫的脂肪組織替代。實(shí)驗(yàn)可得出，和簡(jiǎn)單的HA移植相比，非細(xì)胞性的HA水凝膠移植物能顯著誘導(dǎo)活體內(nèi)的脂肪形成和血管再生。以上的研究結(jié)果表明，對(duì)于軟組織的損傷或出于美容目的自體顆粒脂肪移植，HA水凝膠移植物在血管再生和脂肪形成方面具有積極意義。

6關(guān)于生長(zhǎng)因子的應(yīng)用

6.1血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial growth factor ,VEGF)的應(yīng)用研究:血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）可在體內(nèi)誘導(dǎo)血管再生，在自體脂肪移植中，很多學(xué)者運(yùn)用了脂肪組織工程技術(shù)[14]，取得了不錯(cuò)的成果。Chung等[15]將負(fù)載有VEGF的膠囊化的微球體（n=6）、空（聚乳酸-乙醇酸共聚物）微球體(n=6)的人類(lèi)脂肪提取物和人類(lèi)脂肪提取物(n=6)分別從皮下注入到無(wú)胸腺裸鼠的兩側(cè)。每組處死3只裸鼠，移植組織分別在第3周和第6周被取出，結(jié)果顯示VEGF樣本組的質(zhì)量和體積都有增加，另兩組則都減少，在第6周達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CD31+、伊紅和蘇木精成像顯著，則證明了VEGF樣本組比另兩組有更多的血管形成。Yi等[16]利用腺病毒做VEGF的載體，并混合人類(lèi)脂肪組織后注入到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物頭皮下。兩組對(duì)照組則分別注入綠色熒光蛋白基因-人類(lèi)脂肪組織混合物和生理鹽水。經(jīng)過(guò)一系列處理后，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組的毛細(xì)血管密度顯著增高（P<0.01），其脂肪移植組織的重量和體積明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。Lei等[17]利用編碼VEGF的質(zhì)粒混合脂肪組織后植入小鼠，實(shí)驗(yàn)證明VEGF促進(jìn)了移植體血管再生并減少了脂肪的吸收。以上研究運(yùn)用脂肪組織工程技術(shù)，顯示了VEGF在自體脂肪移植方面發(fā)揮著促血管再生作用，進(jìn)而使脂肪移植組織被吸收量減少。

6.2紅細(xì)胞生成素（Erythropoietin,EPO）：前面討論富血小板血漿對(duì)自體脂肪移植存活率的影響，進(jìn)而提出了紅細(xì)胞生成素是否對(duì)移植組織的血管再生等有促進(jìn)作用。Hamed等[18]將人類(lèi)脂肪組織注入到免疫受損的裸鼠皮下，然后用20或100UI EPO處理移植組織。15周的研究期結(jié)束后，在血管再生、細(xì)胞凋亡和組織學(xué)范圍內(nèi)評(píng)估脂肪移植組織，將實(shí)驗(yàn)結(jié)果和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）處理過(guò)的及磷酸鹽緩沖鹽水 (Phosphate buffered saline,PBS)處理過(guò)的移植組織作比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，EPO處理過(guò)的移植組織的重量和體積比PBS處理過(guò)的更大，PBS處理過(guò)的移植組織的重量和體積不同于VEGF處理過(guò)的移植組織；利用EPO也增強(qiáng)了血管生成因子的表達(dá)，增加了微血管的密度，減少了炎癥和細(xì)胞凋亡。綜上所述，EPO可能也是自體顆粒脂肪移植組織血管再生機(jī)制的一個(gè)影響因素，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)這方面的研究不多，值得繼續(xù)研究和探討。

7小結(jié)

無(wú)論是運(yùn)用自體顆粒脂肪移植或是脂肪組織工程技術(shù)，都是以增加脂肪移植存活率為目的，且日益受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的重視。以上總結(jié)了近年來(lái)較有潛力的促自體脂肪移植組織血管再生的物質(zhì)及其研究方法。還有一些活性物質(zhì)，如白細(xì)胞介素-8[19]、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子[20]、胰島素[21]、人工脂肪替代物[22]等正處于繼續(xù)研究之中。到底有多少活性物質(zhì)有促進(jìn)脂肪移植組織血管再生的能力，這些活性物質(zhì)之間是否存在協(xié)同或拮抗關(guān)系，生物工程材料是否能代替自體脂肪組織，技術(shù)手段的革新，這些都值得我們繼續(xù)研究和探討。

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[收稿日期]2014-04-08 [修回日期]2014-04-30

編輯/李陽(yáng)利