微藻脂肪酸合成累積代謝基因調(diào)控的研究進(jìn)展

鄭勝 錢院紅

摘要隨著環(huán)境與能源問題的日益緊張，微藻成為生物柴油的重要原料，并且成為研究者們關(guān)注的熱點(diǎn)。首先介紹了微藻作為生物柴油原料的優(yōu)勢，如生長速度快、生物量大、油脂含量多等。其次綜述了關(guān)于微藻代謝途徑的研究進(jìn)展，分別從脂肪酸的合成和分解途徑綜述了人們近些年來對關(guān)鍵限速酶的研究進(jìn)展，總結(jié)了不同限速酶取得的成果。提出采用基因沉默等方法來抑制脂肪酸的分解代謝。最后對微藻作為生物柴油原料的前景做了展望，目前已有乙酰輔酶A羧化酶（ACCase）等酶被研究，但還有脂肪酸合成酶（FAS）等酶以及其他旁路途經(jīng)的相關(guān)酶有待于更深入地開發(fā)和研究。

關(guān)鍵詞微藻； 脂肪代謝； 生物柴油； 基因工程

中圖分類號S181.3；Q946文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2014）23-07942-04

基金項(xiàng)目國家自然科學(xué)基金（31101009）。

作者簡介鄭勝（1979- ），男，山東泰安人，副教授，博士，從事生物藥物與微生物耐藥性、生物能源方面的研究。

收稿日期20140707隨著社會經(jīng)濟(jì)的迅速發(fā)展，全球?qū)δ茉吹男枨蟛粩鄶U(kuò)大，為了減輕地球溫室效應(yīng)，減小空氣的污染程度，可替代石油能源的可再生清潔能源受到人們的廣泛關(guān)注[1]。因?yàn)槿紵锊裼秃苌僭黾佣趸嫉膬襞欧牛源罅ν苿由锊裼偷陌l(fā)展是一個必然的趨勢。生物柴油（脂肪酸甲酯）是一種已被證明的較為成功的替代型燃料[2]，由于它的環(huán)保性和可再生性而得到了世界各國的大力發(fā)展。傳統(tǒng)的生物柴油原料是植物油脂和動物油脂，但提供大量的植物油會對占地和糧食供應(yīng)構(gòu)成很大的威脅，又由于目前植物油的價格飆升，導(dǎo)致生物柴油產(chǎn)業(yè)面臨困難，綜上所述，發(fā)展生物柴油，原料是關(guān)鍵。

通過大量的研究發(fā)現(xiàn)，微藻可以替代植物油，因?yàn)槲⒃逵偷某煞峙c植物油的成分相似，而且微藻中含有大量的油脂成分。近年來，微藻等引起各國關(guān)注的生物柴油原料正在被大力開發(fā)和研究。

1制備生物柴油的新型原料——微藻

微藻包括金藻綱、黃藻綱、硅藻綱、綠藻綱等類別，是自熱界中光合效率最高的低等植物，種類繁多，生長迅速，分布廣泛，可在高鹽、高堿的水體中生長。在培養(yǎng)過程中，可用海水或吸收工業(yè)廢氣中的CO2大量培養(yǎng)，在工業(yè)生產(chǎn)中具有重要的意義。微藻是單細(xì)胞生物，呈鏈狀、團(tuán)狀生長，且無根莖葉分化。與傳統(tǒng)油料作物（大豆、高油玉米、菜油籽）相比，微藻具有顯著的優(yōu)點(diǎn)[3]：①光反應(yīng)效率高，微藻通過光合作用產(chǎn)生的油脂比油料作物多，且其全部生物量都可以用來制取生物柴油。②含油量高，Hu等的研究表明，與油料作物中產(chǎn)量最高的作物相比，單位面積微藻的年產(chǎn)量比其還高7～23倍[4]。有些微藻的含油量高達(dá)20%～50%[5]。部分微藻的含油量還超過了微藻干重的80%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了最好的產(chǎn)油作物。③成本低，微藻比其他原料更易培養(yǎng)，用工業(yè)廢水廢氣就能大量培養(yǎng)微藻，大大節(jié)約了柴油的生產(chǎn)成本。所以，微藻是極具潛力的生產(chǎn)生物柴油的原料。與此同時，大部分微藻是單細(xì)胞生物，與植物細(xì)胞相比，對微藻進(jìn)行基因的改造相對較簡單，更使微藻具有作為生物柴油原料的潛力。

2微藻的代謝研究

利用微藻生產(chǎn)生物柴油，其中提高微藻脂肪酸含量是研究的目的之一，為了實(shí)現(xiàn)這一目的，就需要深入地研究微藻的細(xì)胞代謝過程。該部分主要綜述了目前微藻細(xì)胞代謝的研究進(jìn)展。所示是微藻細(xì)胞主要的脂肪酸合成途徑和三酰甘油（TAG）合成途徑。

微藻脂肪TAG可能的生物合成代謝途徑通過深入研究微藻的代謝途徑，許多學(xué)者將目光轉(zhuǎn)移到與脂肪酸的合成有密切聯(lián)系的一系列關(guān)鍵酶上，主要包括乙酰輔酶A羧化酶（ACCase）、丙二酰輔酶A（malonyCoA）、脂肪酸合成酶（FAS）等。早在1993年， Roessler等在硅藻中找到了編碼乙酰輔酶A羧化酶的基因[11]。之后Dunahay等在硅藻（Cyclotella cryptica）中過量表達(dá)了該基因，但是卻沒有得到很好的預(yù)想效果[12]。但是在微藻的基因工程領(lǐng)域算是取得了一個很大的突破。2007年，Song等研究人員克隆了藍(lán)藻脂肪酸合成途徑中的ACC基因，并與特定的宿主啟動子相連，通過PCR方法驗(yàn)證，成功地構(gòu)建了藍(lán)藻穿梭表達(dá)載體[7]。之后，該課題組進(jìn)行了ACC調(diào)控微藻脂肪酸合成能力的研究，實(shí)驗(yàn)室目前正在篩選并轉(zhuǎn)化ACC基因的絲狀體微藻。Ohlrogge等將擬南芥的ACCase編碼基因上連接了油菜種子的貯藏蛋白napin的特異性表達(dá)啟動子，轉(zhuǎn)入大油菜中表達(dá)，獲得的第一代種子的ACCase活性增加了12～19倍，同時脂肪酸的含量也增加了6%[13]。閆晉飛通過電擊轉(zhuǎn)化法將大腸桿菌的乙酰輔酶A合成酶基因（acetylcoA synthetase，ACS）引入到海洋裂壺藻Schizochytrium sp.TIO1101中，檢測結(jié)果顯示：外源ACS基因表達(dá)可以增加細(xì)胞內(nèi)乙酰輔酶A庫存，顯著提高生物量和脂肪酸含量[14]。在脂肪酸的合成過程中，另外一個重要的催化碳鏈加長的酶是脂肪酸合成酶（FAS），但是在國內(nèi)外的研究報道中，還未見在微藻體內(nèi)超表達(dá)脂肪酸合成酶的相關(guān)報告，這將成為潛在的重要研究方向。

在的Kennedy 途徑中，脂肪酸在輔酶A、酰基輔酶A等酶的催化下，發(fā)生一系列的反應(yīng)，最終生成了三酰甘油（TAG）。為了提高細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的積累，獲得脂肪酸分泌型微藻，必須抑制脂肪酸被分解。Zou等把酵母推測編碼的基因sn2 acyltransferase在甘藍(lán)油菜中過量表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶（LPAT）在轉(zhuǎn)基因油菜中活性提高并且油脂含量提高到了原來的6倍左右[15]。另有研究表明，酵母的LPAT基因SLC11在擬南芥和油菜中超表達(dá)，增加了長鏈脂肪酸的比例和含量，并且種子的含油量增加了8%～48%[16]。既然可以超表達(dá)編碼的基因，那么采用基因工程的方法來抑制LPAT的活性也是一個很有潛力的研究方向。類似地，油菜ACCase（乙酰輔酶A羧化酶）的活性通過反義表達(dá)技術(shù)被抑制，最終測得的種子的含油量明顯降低[16]。Beopoulos等將從3磷酸甘油醛（G3P）轉(zhuǎn)化到磷酸二羥丙酮（DHAP）的關(guān)鍵酶GUT2敲除，改變了代謝過程中的碳的轉(zhuǎn)化方向，因此生成的酵母油脂提高了3倍[17]。Dulerhno等把負(fù)責(zé)G3P穿梭的Gpd1基因過表達(dá)，缺失酯酰輔酶A氧化鎂（AOX）后細(xì)胞的油脂含量提高了34%[18]。田琪琳等利用反向載體技術(shù)構(gòu)建了萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（pepc2）基因的表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)入萊茵衣藻來獲得pepc2表達(dá)量降低的轉(zhuǎn)基因突變株[19]。由此可見，利用基因敲除或沉默工具，在微藻代謝途徑中抑制相關(guān)酶基因的表達(dá)也是一種有效的提高脂肪酸積累的方法。這為進(jìn)一步篩選高含油量的基因工程微藻提供了基礎(chǔ)材料。

同樣，二?；视王；D(zhuǎn)移酶（DGAT）是TAG合成的關(guān)鍵酶，所以，采用反義表達(dá)技術(shù)抑制DGAT的活性，也可能會實(shí)現(xiàn)積累脂肪酸的目的，在目前的研究中，BouvierNave等將擬南芥的DGAT基因在煙草（N.tabacum）和酵母中超表達(dá)，DGAT的活性增加了200多倍[20]。研究表明，紅花和大腸桿菌甘油三磷酸酰基轉(zhuǎn)移酶（GPAT）基因在擬南芥中超量表達(dá)，提高了種子的重量和含油量，含油量增加了8%～29%[21]。

在微藻的研究中，硅（Thalassiosira pseudonana）和綠藻（Ostreococcus tauri）的DGAT基因已經(jīng)被克隆和表達(dá)，萊茵衣藻的DGAT基因的研究也在進(jìn)行中。近幾年，王娟飛等成功完成了三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）丙酮酸磷酸二激酶（PPDK）基因和PPDKiSe載體的構(gòu)建[22]。隨后，朱聰聰?shù)壤秒姶┛追?，成功?gòu)建了三角褐指藻的葉綠體表達(dá)體系[23]。劉玉等通過PCR驗(yàn)證，成功構(gòu)建了栗酒裂殖酵母絲氨酸蛋白激酶（CDC2）基因的淡水舟形藻表達(dá)載體[24]。這些試驗(yàn)操作復(fù)雜，對專業(yè)具有很高的嚴(yán)格性，但是學(xué)者們還是努力去嘗試，并且得到理想的結(jié)果，這對微藻脂肪酸的積累提供了一個很有價值的參考。

最近又發(fā)現(xiàn)了一種新的增加藻類油脂含量的方法——混合培養(yǎng)法。例如，Cheirsilp等用混合培養(yǎng)的方式培養(yǎng)小球藻和粘紅酵母，培養(yǎng)5 d后發(fā)現(xiàn)油脂含量達(dá)到2.88 g/L[25]。苗金鑫等用類似方法培養(yǎng)螺旋藻和粘紅酵母，油脂產(chǎn)量效果達(dá)到216 mg/L[26]?；旌吓囵B(yǎng)技術(shù)相對簡單，操作方便，也是一種很有前景的培養(yǎng)油脂微藻的方法。

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2014年3總結(jié)與展望

用微藻作為原料生產(chǎn)生物柴油的主要過程就是大量合成積累微藻中的脂肪酸，提取出來生產(chǎn)生物柴油。積累脂肪酸的途徑和方法主要包括以下3個方面。①生化代謝調(diào)控。通過生化調(diào)控來積累脂肪酸，通常采用的手段是限制藻類生長的營養(yǎng)元素，比如氮源等。相關(guān)研究綜述有秦松等[27]的微藻生物柴油技術(shù)的研究進(jìn)展。但是這個方法有個弊端，就是限制了細(xì)胞的正常生長和繁殖，可能會影響脂肪酸在細(xì)胞體內(nèi)的積累。②基因工程技術(shù)。微藻的基因工程手段已經(jīng)很成熟，目前，已經(jīng)成功地在綠藻和硅藻[28]中利用基因槍法將葉綠體和線粒體的基因進(jìn)行傳導(dǎo)[29]。其他能將外源DNA導(dǎo)入微藻細(xì)胞的技術(shù)包括玻璃珠法、金剛砂法、電擊法等[30-31]。在最近微藻研究中，微藻（Dunaliella salina）外源基因的表達(dá)采用了在載體中加入核基質(zhì)結(jié)合區(qū)（MARs）的方式提高了基因的表達(dá)水平[32-33]。在高等植物的研究中，這樣只增強(qiáng)脂肪酸的合成并沒有導(dǎo)致TAG成倍增加，但是在微藻中這個方法是否可靠還有待于進(jìn)一步實(shí)踐來驗(yàn)證。③基因工程和生化調(diào)控雙管齊下。將兩種方法結(jié)合在一起的僅見于大腸桿菌的一篇報道。今后在微藻中將兩者結(jié)合研究，也許微藻的脂肪酸積累會達(dá)到更好的效果。

目前，微藻中已知的可調(diào)控酶包括：乙酰輔酶A羧化酶（ACCase）、ACC、DGAT、GPAT、LPAT、PEPC等，有待于進(jìn)一步研究的還有脂肪酸合成酶（FAS）、酰基輔酶A（acylCoA）以及其他未知旁路途經(jīng)的相關(guān)酶等。藻類的種類很多，目前研究到的只是個別藻類，還有更多潛在的微藻研究對象。相信未來微藻生產(chǎn)生物柴油會有更好的研究進(jìn)展。

參考文獻(xiàn)

[1] LOTERO E，GOODWIN J，BRUCE D A，et al.The catalysis of biodiesel synthesis[J].Journal of Catalysis，2006，19（1）：41-83.

[2] 紀(jì)威，符太軍，姚亞光，等.柴油機(jī)燃用乙醇-柴油-生物柴油混合燃料的試驗(yàn)研[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報，2007，23（3）：180-185.

[3] 童牧，周志剛.新一代生物柴油原料——微藻[J].農(nóng)業(yè)工程技術(shù)，2009，5：19-24.

[4] HU Q，SOMMERFELD M，JARVIS E，et al.Microalgal triacylglycerols as feedstocks for biofuel production：perspectives and advances[J].Plant Journa，2008，54（4）：621-639.

[5] SPOLAORE P，JOANNISO ANNISCASSAN C，DURAN E，et al.Commercial applications ofmicroalgae[J].Biosci Bioeng，2006，101：87-96.

[6] 姚茹，徐新華，張林，等.微藻的高油脂化技術(shù)研究進(jìn)展[J].化學(xué)進(jìn)展，2010，22（6）：1225-1227.

[7] SONG D H，HOU L J，SHI D J.Exploitation and utilization of rich lipidsmicroalgae，as new lipids feedstock for biodiesel productiona review[J].Chin J Biotech，2008，24（3）：341-348.

[8] ROSENBERG J N，OYLER G A，WIKINSON L，et al.A green light for engineered alage：redirecting metabolism to fuel a biotechnology revolution[J].Curr Opin Biotech，2008，19：430-436.

[9] COURCHESNE N M D，PARISIEN A，WANG B，et al.Enhancement of lipid production using biochemical，genetic and transcription factor engineering approaches[J].J of Biotechnol，2009，141（1/2）：31-41.

[10] LEONBANARES R，GONZALEZBALLESTER D，GALVAN A，et al.Transgenic microalgae as green cell-factories[J].Trends in Biotechnology，2004，22：45-52.

[11] ROESSLER P G，OHLROGGE J B.Cloning and characterization of the gene that encodes acetylcoenzyme A carboxylase in the alga Cyclotella cryptic[J].The Journal of Biological Chemistry，1993，268：19254-19259.

[12] DUNAHAY T G，JARVIS E E，ROESSLER P G.Genetic transformation of the diatoms Cyclotella cryptic and Navicula saprophila[J].Journal of Phycology，1995，31：1004-1011.

[13] OHLROGGE J B，ROESLER K R，SHORROSH B S.Methods of increasing oil content of seeds：United States， 5925805[P].1999.

[14] 閆晉飛.利用基因工程手段提高兩種微藻的生物量與特定代謝產(chǎn)物產(chǎn)量[D].沈陽：沈陽藥科大學(xué)，2013.

[15] ZOU J，KATAVIC V，GIBLIN E M，et al.Modication of seed oil content and acyl composition in the Brassicaceae by expression of a yeast sn-2 acyltransferase gene[J].Plant Cell，1997（9）：909-923.

[16] SELLWOOD C，SLABAS A R，RAWSTHORNE S.Effects of manipulating expression of acetylCoA carboxylase I in Brassica napus L. embryos[J].Biochem Society，2000，28：598-600.

[17] BEOPOULOS A，MROZOVA Z，THEVENIEAU F，et al.Control of lipid accumulation in the yeast Yarrowia lipolytica[J].Appl Environ Microbiol，2008，74（24）：7779-7789.

[18] DULERMO T，NICAUD J M.Involvement of the G3P shuttle and betaoxidation pathway in the control of TAG synthesis and lipid accumulation in Yarrowia lipolytica[J].Metab Eng， 2011，13（35）：482-491.

[19] 田琪琳，施定基，賈曉金等.“細(xì)菌型”pepc2基因反向表達(dá)載體構(gòu)建及在萊茵衣藻中的表達(dá)[J].上海海洋大學(xué)學(xué)報，2013（5）：665-671.

[20] BOUVIERNAVE P，BENVENISTE P，OELKERS P，et al.Expression in yeast and tobacco of plant cDNAs encoding acyl CoA：diacylglycerol acyltransferase[J].European Journal of Biochemistry/FEBS，2000，267（1）：85-96.

[21] JAIN R K，COFFEY M，LAI K，et al.Enhancement of seed oil content by expression of glycerol3phosphate acyltransferase genes[J].Biochem Soc Trans，2000，28（6）：958-961.

[22] 王娟飛，陳志森，陳軍.三角褐指藻PPDK基因RNAi載體的構(gòu)建和基因槍轉(zhuǎn)化[J].廈門大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2010，49（5）：400-405.

[23] 朱聰聰，張乃升，謝偉紅，等.葉綠體轉(zhuǎn)化三角褐指藻表達(dá)外源蛋白[J].熱帶亞熱帶植物學(xué)報，2011，19（3）：267-272.

[24] 劉玉，朱萬鵬，王瑩瑩，等.栗酒裂殖酵母CDC2基因克隆及淡水舟形藻表達(dá)載體構(gòu)建[J].生物技術(shù)通報，2013（12）：108-112.

[25] CHEIRSILP B，SUWANNARAT W，NIYOMDECHA R.Mixd culture of oleaginous yeast Rhodotorula glutinis and microalga Chlorella vulgaris for lipid production from industrial wastes and its use as biodiesel feedstock[J].N Biotechnol，2011，28（4）：362-368.

[26] 苗金鑫，薛飛燕，張栩，等.粘紅酵母和鈍頂螺旋藻混合培養(yǎng)生產(chǎn)微生物油脂培養(yǎng)基優(yōu)化[J].生物加工過程，2007（3）：27-31.

[27] 姜進(jìn)舉，苗鳳萍，馮大偉，等.微藻生物柴油技術(shù)的研究現(xiàn)狀及展望[J].中國生物工程雜志，2010，30（2）：134-140.

[28] KROTH P G.Genetic transformation：a tool to study protein targeting in diatoms[J].Methods Mol Bio，2007，390：257-268.

[29] REMACLE C，CARDOL P，COOSEMANS N，et al.High-efficiency biolistic transformation of Chlamy domonasmit ochondria can be used to insertmutations in complex I genes[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2006，103（12）：4771-4776.

[30] SUN Y，YANG Z Y，GAO X S，et al.Expression of foreign genes in Dunaliella by electroporation[J].Molecular Biotechnology，2005，30（3）：185-192.

[31] WANG C H，WANG Y Y，SU Q，et al.Transient expression of the GUS gene in a unicellularmarine green alga，Chlorellasp MACC/C95，via electroporation[J].Biotechnology and Bioprocess Engineering，2007，12（2）：180-183.

[32] SCHENK P M，THOMASHALL S R，STEPHENS E，et al.Second generation biofuels：highefficiency microalgae for biodiesel production[J].Bioenerg Res，2008，1：20-43.

[33] WANG T Y，XUE L X，HOU W H，et al.Increased expression of transgene in stably transformed cells of Dunaliella salina by matrix attachment regions[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2007，76（3）：651-657.