大孔樹(shù)脂對(duì)樟子松松塔多酚的純化工藝研究

劉榮 欒淑瑩 方妍等

摘要[目的]優(yōu)化樟子松松塔多酚純化工藝，提高松多酚利用率。[方法]以吸附解析率為衡量指標(biāo)，確定純化樟子松松塔多酚的最佳樹(shù)脂；以多酚回收率和純度為衡量指標(biāo)，單因素試驗(yàn)研究純化過(guò)程中各因素對(duì)純化效果的影響，并且利用響應(yīng)面優(yōu)化樟子松松塔多酚的純化工藝。[結(jié)果]樟子松松塔多酚的初步純化最適條件為上樣液濃度0.2 mg/ml，上樣液體積2.10 ml，樣液pH 7，徑高比1∶25.8，洗脫乙醇濃度57.75%。在此工藝參數(shù)下，樟子松松塔多酚的回收率可達(dá)68.78%。[結(jié)論]經(jīng)D4020大孔樹(shù)脂純化，樟子松松塔多酚純度由21.6%升至59.4%，說(shuō)明D4020大孔樹(shù)脂適宜用于初步純化樟子松松塔多酚。

關(guān)鍵詞樟子松松塔；多酚；純化；大孔樹(shù)脂；響應(yīng)面

中圖分類(lèi)號(hào)S791.253文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2014）23-07869-04

基金項(xiàng)目國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31170510）。

作者簡(jiǎn)介劉榮（1971- ），女，黑龍江哈爾濱人，副研究員，博士，碩士生導(dǎo)師，從事食品營(yíng)養(yǎng)學(xué)與功能性食品研究。*通訊作者，教授，博士生導(dǎo)師，從事功能性食品開(kāi)發(fā)研究。

收稿日期20140710多酚類(lèi)化合物是廣泛分布于植物體內(nèi)的次生代謝產(chǎn)物[1]，是一類(lèi)具有苯環(huán)并結(jié)合有多個(gè)羥基化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物總稱(chēng)，其大量存在于植物中，是許多藥用植物的主要活性成分[2]。研究發(fā)現(xiàn)松科植物的體內(nèi)含有大量的多酚類(lèi)化合物，具有一系列獨(dú)特的化學(xué)性質(zhì)和生物活性，這類(lèi)化合物被統(tǒng)稱(chēng)為松多酚。松多酚具有抗腫瘤、抗氧化、降血糖、降血脂、抗動(dòng)脈硬化、防治冠心病與中風(fēng)等心腦血管疾病以及抗菌等多種生理功能，在食品、醫(yī)藥、化妝品、日用化學(xué)品以及保健品應(yīng)用等方面起到了一定的作用。目前多酚的提取方法包括有機(jī)溶劑浸提[3]、超聲波輔助提取[4]和酶法輔助提取[5]等。多酚純化的方法包括溶劑萃取和柱層析等，其中大孔樹(shù)脂柱層析因具有較好的吸附和解析效果被廣泛應(yīng)用。該試驗(yàn)使用大孔吸附樹(shù)脂對(duì)樟子松松塔多酚進(jìn)行純化，并優(yōu)化其工藝，以期提高樟子松松塔多酚的利用率，為減少能源消耗、充分開(kāi)發(fā)利用植物多酚資源提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與儀器樟子松松塔，產(chǎn)地是大興安嶺地區(qū)；沒(méi)食子酸、無(wú)水乙醇由天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠(chǎng)提供；濃鹽酸、無(wú)水碳酸鈉、氫氧化鈉、福林酚由天津光復(fù)精細(xì)化工研究所提供；大孔樹(shù)脂ADS7、大孔樹(shù)脂 ADS17、大孔樹(shù)脂 NKA2、大孔樹(shù)脂 D4020、大孔樹(shù)脂 AB8、大孔樹(shù)脂 D3520由天津海光試劑公司提供。

（FW135）高速萬(wàn)能粉碎機(jī)、（DK98IIA）電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；（RE52E）旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠(chǎng)）；722型可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司）；（DHG9240型）電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；JA2003N電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；（Φ1 cm×500 mm）層析柱（天津海光試劑公司）。

1.2研究方法

1.2.1松塔多酚粗提物的制備。將干燥后的樟子松松塔剪成碎片，在粉碎機(jī)中粉碎成粉末，過(guò)40目篩，得到樟子松松塔多酚粉末。按照乙醇濃度50%，料液比1∶25（g/ml），提取時(shí)間4 h，提取溫度50 ℃的條件進(jìn)行水浴提取，提取后抽濾[6]。上清液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后定容。按照FolinCiocalteu法[7]測(cè)定提取液中多酚含量為19.35 mg/ml，純度為21.6%。

1.2.2大孔樹(shù)脂的預(yù)處理。采用6種不同極性的大孔樹(shù)脂進(jìn)行試驗(yàn)，將各種型號(hào)大孔樹(shù)脂置于95%的乙醇中浸泡12 h，充分溶脹后用蒸餾水洗滌，沖洗至無(wú)白色渾濁物出現(xiàn)，用5%鹽酸浸泡4 h，蒸餾水充分洗滌至中性，再用5%氫氧化鈉溶液浸泡4 h，蒸餾水充分洗滌至中性后備用。每次上樣洗脫完畢后，先用5%HCl 洗至無(wú)色，用蒸餾水洗至pH為中性，再用5%NaOH 洗至無(wú)色，最后用蒸餾水洗至pH為中性，方可重復(fù)利用。

1.2.3大孔樹(shù)脂對(duì)樟子松松塔多酚吸附劑解吸附性能研究。將預(yù)處理后的各種型號(hào)大孔樹(shù)脂各10.0 g，置于100 ml錐形瓶中。向各錐形瓶中分別加入40 ml濃度為2 mg/ml的樟子松松塔多酚樣品液。將錐形瓶放置于恒溫恒速振蕩器中，在25 ℃條件下振蕩吸附6 h，在振蕩開(kāi)始后的1、2、3、4、5、6 h時(shí)，分別量取1 ml多酚樣品液，采用FolinCiocalteu法測(cè)定多酚含量，按照式Ⅰ計(jì)算吸附率，繪制吸附曲線(xiàn)。隨后過(guò)濾除去樟子松松塔多酚樣品溶液，將各種型號(hào)樹(shù)脂用蒸餾水洗凈并置于100 ml錐形瓶中，分別加入40 ml 50 %乙醇置于恒溫恒速振蕩器中，在25 ℃條件下振蕩解析6 h，在解析進(jìn)行1、2、3、4、5、6 h時(shí)，分別量取1 ml溶液，解析后的樟子松松塔多酚解析液，采用FolinCiocalteu法顯色后測(cè)定吸光值，并計(jì)算多酚含量，繪制解析曲線(xiàn)，按照式Ⅱ計(jì)算解析率。比較6種大孔樹(shù)脂對(duì)樟子松松塔多酚的吸附率與解析率的影響，確定純化時(shí)可使用的最佳樹(shù)脂。

。

1.2.4靜態(tài)吸附下樣品濃度和pH的適宜工藝條件研究。準(zhǔn)確稱(chēng)取6份10.0 g預(yù)處理后的大孔樹(shù)脂于100 ml錐形瓶中，加入濃度為1.0 mg/ml的樟子松松塔多酚樣品液40 ml，并分別調(diào)節(jié)pH至2、3、4、5、6、7，調(diào)節(jié)pH后加入蒸餾水補(bǔ)齊體積至50 ml。放置于恒溫恒速振蕩器中，在25 ℃條件下振蕩吸附一定時(shí)間，量取1 ml樟子松松塔多酚樣品液，采用FolinCiocalteu法顯色后測(cè)定其吸光值，研究pH對(duì)大孔樹(shù)脂吸附樟子松松塔多酚效果的影響。

準(zhǔn)確稱(chēng)取6份10.0 g預(yù)處理后的大孔樹(shù)脂于100 ml錐形瓶中，加入濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/ml的樟子松松塔多酚提取物樣品液50 ml。放置于恒溫恒速振蕩器中，在25 ℃條件下振蕩吸附一定時(shí)間，量取1 ml樟子松松塔多酚樣品液，采用FolinCiocalteu法顯色后測(cè)定其吸光值，研究樣品液濃度對(duì)大孔樹(shù)脂吸附多酚效果的影響。

1.2.5動(dòng)態(tài)吸附下純化工藝條件研究。大孔樹(shù)脂濕法裝柱，向玻璃層析柱中滴加濃度為25 mg/ml的粗提液5 ml，吸附2 h，先用2倍柱體積的蒸餾水清洗，再用50%乙醇溶液洗脫，收集流出液，每5 ml收集1次，測(cè)定其中樟子松松塔多酚的濃度（mg/ml），繪制洗脫曲線(xiàn)。收集濃度最大的30 ml，計(jì)算多酚回收率（式Ⅲ），并于40 ℃烘干后復(fù)溶，測(cè)定其多酚含量，計(jì)算純度（式Ⅳ）。

樟子松松塔多酚提取響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平

水平因素A洗脫劑乙醇濃度∥%B上樣液體積∥mlC徑高比-1401.51∶200502.01∶251602.51∶30

利用Design expert 6.0.5軟件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以多酚回收率為響應(yīng)值，確定最佳的純化條件，并根據(jù)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)[8]。

2結(jié)果與分析

2.1大孔樹(shù)脂的篩選所用的6種樹(shù)脂的物理特性見(jiàn)。這6種大孔樹(shù)脂對(duì)于樟子松松塔多酚的吸附率和解析率的結(jié)果見(jiàn)。由可以看出，NKA2、ADS7、D3520這3種樹(shù)脂對(duì)多酚的吸附率可高達(dá)71.55%、71.65%、72.34%，但是其解析率僅為38.24%、34.94%、35.60%，而D4020樹(shù)脂吸附率和解析率都高于其他5種樹(shù)脂，所以D4020樹(shù)脂是純化樟子松松塔多酚的理想樹(shù)脂。

6種大孔樹(shù)脂理化性質(zhì)

樹(shù)脂種類(lèi)比表面積∥m2/g平均孔徑∥nm極/非極性NKA-2160～20014.5～15.5極性ADS-790～150200極性ADS-1790～15025～30中等極性AB-8480～52013～14弱極性D3520480～52085～90非極性D4020540～580100～105非極性

6種大孔樹(shù)脂對(duì)樟子松松塔多酚的吸附率和解析率的影響2.2D4020大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附條件的研究

2.2.1上樣液濃度對(duì)樹(shù)脂吸附率、解析率的影響。樟子松松塔多酚粗提物上樣液濃度對(duì)D4020樹(shù)脂吸附率、解析率的影響如所示。隨著粗提物濃度的增加，樹(shù)脂吸附率下降，其原因可能是隨樣品濃度增大，樹(shù)脂間的孔隙被填滿(mǎn)，達(dá)到飽和狀態(tài)。樹(shù)脂解析率在粗提物濃度為0.2 mg/ml時(shí)達(dá)到最大值，之后呈下降趨勢(shì)。綜合考慮，采用上樣液濃度0.2 mg/ml進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

上樣液濃度對(duì)D4020樹(shù)脂吸附率和解析率的影響2.2.2上樣液pH對(duì)樹(shù)脂吸附率、解析率的影響。如所示，D4020樹(shù)脂對(duì)樟子松松塔多酚的吸附率與解析率在pH為7時(shí)達(dá)到最大值，而最初的樟子松松塔多酚提取液pH就在7左右，所以試驗(yàn)最適的上樣液pH為7，后續(xù)試驗(yàn)無(wú)需調(diào)節(jié)上樣液pH。

上樣液pH對(duì)D4020樹(shù)脂吸附率和解析率的影響2.3D4020大孔樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附條件的研究

2.3.1洗脫曲線(xiàn)的繪制。選取2 ml濃度為2 mg/ml的提取液充分吸附后用50%乙醇洗脫，每5 ml收集1管，測(cè)定其中多酚的濃度，繪制動(dòng)態(tài)洗脫曲線(xiàn)。由可以看出，從第2管開(kāi)始，洗脫液中多酚含量顯著增加，當(dāng)洗脫至第4管時(shí)洗脫液中多酚含量達(dá)到最大值，從第6管之后隨著洗脫體積的增加，多酚含量逐漸下降，所以該試驗(yàn)收集2～6管的30 ml樟子松松塔多酚溶液進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

樟子松松塔多酚動(dòng)態(tài)洗脫曲線(xiàn)2.3.2上樣液體積對(duì)松塔多酚回收率、純度的影響。由可知，隨著上樣液體積的增加，樟子松松塔多酚純度呈先上升后下降的趨勢(shì)，在上樣液體積為3 ml時(shí)達(dá)到最高。呈現(xiàn)這一趨勢(shì)的原因可能是隨著上樣液體積的增加，大孔樹(shù)脂對(duì)多酚的吸附量增加，但是上樣液體積過(guò)大，與松多酚競(jìng)爭(zhēng)吸附的雜質(zhì)也相應(yīng)增多，導(dǎo)致松多酚在樹(shù)脂內(nèi)部的擴(kuò)散能力降低[9]。隨著上樣液體積的增加，松多酚回收率也呈先上升后緩慢下降的趨勢(shì)，在上樣液體積為2 ml時(shí)達(dá)到最大值。由于純度變化程度比回收率變化程度小，綜合考慮上樣液體積確定為2 ml。

上樣液體積對(duì)松塔多酚回收率及純度的影響2.3.3徑高比對(duì)松塔多酚回收率、純度的影響。由可知，隨著徑高比的增加，松塔多酚的純度變化不明顯。隨著徑高比的增加，松塔多酚的回收率先呈上升趨勢(shì)，在徑高比為1∶25時(shí)達(dá)到最高，之后隨徑高比增加呈下降趨勢(shì)，在徑高比為1∶35時(shí)又呈上升趨勢(shì)，但是徑高比過(guò)大，會(huì)導(dǎo)致松塔多酚在大孔樹(shù)脂內(nèi)的擴(kuò)散路徑增加，造成大孔樹(shù)脂的浪費(fèi)，同時(shí)增加了松多酚的損失。綜合考慮其影響，確定徑高比為1∶25。

42卷23期劉 榮等大孔樹(shù)脂對(duì)樟子松松塔多酚的純化工藝研究徑高比對(duì)松塔多酚的回收率及純度的影響2.3.4洗脫劑乙醇濃度對(duì)松塔多酚回收率、純度的影響。由可知，隨洗脫劑乙醇濃度的增加，松塔多酚純度先呈緩慢上升趨勢(shì)，在洗脫劑乙醇濃度為50%時(shí)達(dá)到最高，之后隨洗脫劑乙醇濃度增加呈下降趨勢(shì)。這可能是由于在一定范圍內(nèi)，乙醇濃度增加，松塔多酚的溶解性也不斷增加，因而純度提高，但由于樟子松松塔多酚既含醇溶性成分，又含有水溶性成分，過(guò)高的乙醇濃度導(dǎo)致水溶性多酚溶解性降低，同時(shí)高濃度的醇溶液會(huì)導(dǎo)致醇溶性雜質(zhì)被溶解出來(lái)，因此純度會(huì)有所下降。隨著洗脫劑乙醇濃度的增加，松塔多酚回收率也呈先上升再下降的趨勢(shì)。綜合考慮對(duì)松塔多酚純度和回收率的影響，洗脫劑乙醇濃度確定為50%。

采用響應(yīng)面法軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，其結(jié)果見(jiàn)。模型誤差P=0.008 4，差異顯著；失擬項(xiàng)P=0.139 8>0.05，差異不顯著，說(shuō)明了方程對(duì)試驗(yàn)擬合的情況好，試驗(yàn)誤差??；變異系數(shù)值為2.02，接近于1，說(shuō)明試驗(yàn)可靠性高；模型的校正決定系數(shù) R2adj=0.875 4，說(shuō)明該模型能解釋87.54%響應(yīng)值的變化，僅有總變異大約12.46%不能用此模型來(lái)解釋。

洗脫液乙醇濃度的一次項(xiàng)、徑高比一次項(xiàng)對(duì)純度的影響顯著；徑高比的二次項(xiàng)的影響為極顯著；洗脫液濃度的二次項(xiàng)、上樣液體積的二次項(xiàng)、上樣液體積和徑高比的交互項(xiàng)，洗脫液濃度和上樣液體積的交互項(xiàng)，洗脫液濃度和徑高比的交互項(xiàng)的影響不顯著。通過(guò)F值還能看出，試驗(yàn)中各因素對(duì)樟子松松塔多酚回收率的影響大小順序?yàn)閺礁弑?、洗脫液濃度、上樣液體積。

洗脫液濃度、徑高比對(duì)樟子松松塔多酚回收率影響的響應(yīng)面從樟子松松塔多酚回收率與徑高比、洗脫液濃度曲面圖可以看出，最優(yōu)點(diǎn)趨近于徑高比1∶26、洗脫液乙醇濃度60%時(shí)，回收率在這2點(diǎn)附近達(dá)到最大值。從樟子松松塔多酚與上樣液體積、徑高比曲面圖可以看出，最優(yōu)點(diǎn)趨近于上樣液體積2.10 ml和徑高比1∶25.5，回收率在這2點(diǎn)附近達(dá)到最大值。從樟子松松塔多酚與洗脫液濃度、上樣液體積曲面圖（0）可以看出，最優(yōu)點(diǎn)趨近于洗脫液濃度58%，上樣液體積2.10 ml時(shí)，回收率在這2點(diǎn)附近達(dá)到最大值。經(jīng)分析優(yōu)化后，最終確定松多酚初級(jí)純化最優(yōu)提取條件為洗脫劑乙醇濃度57.75%、上樣液濃度0.2 mg/ml、上樣液體積2.10 ml、徑高比1∶25.8，經(jīng)優(yōu)化后樟子松松塔多酚回收率可達(dá)68.78%，純度可達(dá)59.4%。

2.5響應(yīng)面優(yōu)化驗(yàn)證試驗(yàn)對(duì)試驗(yàn)進(jìn)行放大處理，采用柱體積為370 ml，上樣液體積15.5 ml，洗脫液濃度57.70%，上樣液濃度0.2 mg/ml，徑高比1∶25.8這些提取條件，選取濃度最大的6段樣液進(jìn)行混合，測(cè)其吸光值，計(jì)算得回收率為68.59%。