反相高效液相色譜法同時測定金銀花中的綠原酸和木犀草苷方法的優(yōu)化

劉文靜 潘葳 涂杰峰 楊繼偉

摘要 [目的]研究反相高效液相色譜法同時測定金銀花中的綠原酸和木犀草苷的優(yōu)化色譜條件。[方法]采用反相高效液相色譜法（RP-HPLC）同時測定金銀花中綠原酸和木犀草苷含量，并對色譜條件進行優(yōu)化。[結(jié)果]最佳色譜條件為色譜柱Waters SunFireTMC18（4.6 mm×150 mm，3.5 μm）、柱溫40 ℃，流動相為乙腈-0.5%冰醋酸，梯度洗脫為0～15 min（10∶90～20∶80）、16～17 min（20∶80～10∶90），流速1.0 ml/min，檢測波長0～15 min 328 nm、16 ～17 min 350 nm。[結(jié)論]優(yōu)化后縮短了測試時間，為金銀花質(zhì)量的快速檢測提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞 反相高效液相色譜法；金銀花；綠原酸；木犀草苷；優(yōu)化

中圖分類號 S567 文獻標識碼

A 文章編號 0517-6611（2014）26-08948-03

Optimization of the Determination Method of the Chlorogenic Acid and Luteolin-7-O-glucoside in Flos Lonicerae by RP-HPLC

LIU Wen-jing， PAN Wei et al （Central Laboratory， Fujian Academy of Agricultural Sciences， Fuzhou， Fujian 350003；Fujian Key Laboraotory of Precision Measurement of Agriculture， Fuzhou， Fujian 350003）

Abstract [Objective] The research aimed to study the optimal chromatographic conditions of the deter mination method of the chlorogenic acid and luteolin-7-O-glucoside in flos lonicerae by RP-HPLC. [Method] A RP-HPLC method with UV detector was established and optimized to deter mine the chlorogenic acid and luteolin-7-O-glucoside in Flos Lonicerae. [Result] The chromatographic conditions were： Waters SunFireTMC18 （4.6 mm× 250 mm， 3.5 μm） used for column（at 40 ℃）with 0.5% acetic-acetonitrile.Linear gradient elution： 0-15 min（10∶90～20∶80），16-17 min（20∶80～10∶90）， flow rate ：1 ml/ min， deterction wavelength：0-15 min 328 nm，16-17 min 350 nm. [Conclusion] After optimization， the test time was shortened.The study provides the reference for deter mination method of rapid detection of flos lonicerae quality.

Key words RP-HPLC；Flos lonicerae；Chlorogenic acid；Luteolin-7-O-glucoside；Optimization

金銀花為忍冬科忍冬屬植物忍冬（Lonicera japonica Thunb.）的干燥后的花蕾或初開的花，是我國常用的清熱解毒傳統(tǒng)中藥，其味甘、性寒，具有清熱解毒、疏風散熱之功效^[1]。金銀花中主要活性成分為綠原酸以及木犀草苷為代表的黃酮類成分^[2]，目前對金銀花中綠原酸和木犀草苷的含量的測定主要是以高效液相色譜（HPLC）為主^[3-7]，但大部分方法測試分析時間相對較長，增加了檢測工作量；且色譜峰不易分開，峰形分離度也不理想^[8]。該試驗建立高效液相轉(zhuǎn)換波長法，同時測定金銀花中綠原酸和木犀草苷的含量，通過優(yōu)化色譜條件，以期更為簡單快速的檢測這2種有效成分的含量，為金銀花質(zhì)量的快速檢測分析提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料 金銀花由福建省科技廳農(nóng)牧業(yè)科研中試中心提供。

1.2 儀器

Waters 2695型高效液相色譜儀，Waters 2996二極管陣列（PDA）檢測器，Waters Empower色譜工作站，MILLIPORE超純水器，中草藥粉碎機（天津泰斯特儀器有限公司），超聲波清洗器KQ-250DB （昆山市超聲儀器有限公司），離心機Microfuge UV（美國貝克曼庫爾特有限公司），電子分析天平AL24（梅特勒-托利多儀器上海有限公司），微量可調(diào)移液器（eppendorf）。

1.3 試劑及其配制

乙腈色譜純，無水乙醇、冰醋酸為優(yōu)級純，綠原酸（Sigma，純度≥98%，美國），木犀草苷（Sigma，純度≥98%，美國），所有試驗用水為超純水（蒸餾水再經(jīng)過Millipore超純水系統(tǒng)制備）。

1.3.1 70%乙醇水溶液。移取無水乙醇700 ml，用超純水稀釋并定容至1 000 ml。

1.3.2 0.5% 醋酸溶液。移取冰醋酸5 ml，用超純水稀釋并定容至1 000 ml，然后用0.45 μm孔徑的水相濾膜過濾，再經(jīng)超聲脫氣，即為流動相B，過濾乙腈為流動相A。

1.3.3 標準儲備溶液的配制。精密稱取綠原酸0.018 5 g，用70%乙醇水溶液定容至10 ml， 制成濃度為1.81 mg/ml標準溶液，精密稱取木犀草苷0.020 6 g用70%乙醇水溶液定容至50 ml，制成濃度為0.404 mg/ml標準溶液，置于4 ℃冰箱備用。

1.3.4 標準工作液的配制。取上述儲備液各1.0 ml于同一10 ml棕色容量瓶中，用70%乙醇水定容，制成綠原酸濃度181 μg/ml和木犀草苷濃度40.4 μg/ml的混合工作液1。取上述儲備液各1.0 ml于同一100 ml棕色容量瓶中，用70%乙醇水定容，制成綠原酸濃度18.1 μg/ml和木犀草苷濃度4.04 μg/ml的混合工作液2。

1.4 樣品前處理

金銀花樣品經(jīng)60 ℃烘干，粉碎，過40目篩。稱取0.5 g于50 ml棕色容量瓶中，用70%乙醇水溶液定容，搖勻，超聲提取30 min，過濾。取一定量的濾液，10 000 r/min高速離心10 min，分離沉淀干擾物質(zhì)，取上清液用0.45 μm孔徑的濾膜過濾，濾液供上機分析，分析時進樣10 μl。

1.5 色譜條件的優(yōu)化

1.5.1 流速。

使用色譜柱Waters SunFireTMC18（4.6 mm×150 mm，3.5 μm），柱溫40 ℃，比較了不同流速（0.8、1.0、1.2 ml/min）對綠原酸和木犀草苷分離情況的影響。

1.5.2 流動相。

色譜柱選擇Waters SunFireTMC18（4.6 mm×150 mm，3.5 μm），柱溫40 ℃，流速為1.0 ml/min，考察3種流動相梯度變化對綠原酸和木犀草苷分離情況的影響：①0～10 min（10%～25%A）、11～20 min（25%～10%A）；②0～15 min（10%～20%A）、16～20 min （20%～10%A）；③0～10 min（10%～15%A）、11～20 min（15%～10%A）。

1.5.3 檢測波長。采用二極管陣列檢測器在210～400 nm范圍采集紫外吸收光譜圖，檢測對綠原酸和木犀草苷的最大吸收波長。

1.6 檢測效果分析

以最佳的色譜條件測定幾種金銀花中綠原酸和木犀草苷的含量，并分析測試方法線性范圍、精密度、穩(wěn)定性、重復性和回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化確定

2.1.1 流速確定。

綠原酸隨著流速增加出峰提前，分離度影響不大，木犀草苷在1.0 ml/min分離效果最好。流速低分離時間較長，雜質(zhì)不易分離，流速增大則會增加系統(tǒng)的壓力，效率低。該試驗通過比較發(fā)現(xiàn)，流速為1.0 ml/min時，系統(tǒng)壓力適中，靈敏度也足夠高，所以該方法確定流速為1.0 ml/min。

2.1.2 流動相確定。試驗結(jié)果表明（圖1），選擇“1.5.2”中第1種梯度變化作為流動相時，因乙腈有機相占比例較大，樣品出峰較快，木犀草苷與前面雜質(zhì)不能完全分離；而選擇第3種梯度變化因水相占比例較大，樣品出峰慢，木犀草苷與后面雜質(zhì)峰不能完全分離，而綠原酸在有機相比例較大時出峰較快，水相增大時出峰保留時間延長，考慮木犀草苷的分離情況故選擇第2種流動相，因木犀草苷在15 min左右出峰，故不需設(shè)置20 min，最終流動相為0～15 min（10%～20%A）、16～17 min （20%～10%A）。

2.1.3 波長確定。

檢測結(jié)果（圖2）顯示，綠原酸在325.7 nm處有最大吸收值，考慮到儀器的穩(wěn)定性，故選定檢測波長為328 nm；木犀草苷在348.4 nm處有最大吸收值，故選定檢測波長為350 nm。

3 討論與結(jié)論

（1）此試驗綠原酸和木犀草苷含量測定方法參照《中國藥典》2010年版一部，按照藥典的梯度洗脫程序，木犀草苷與相鄰雜質(zhì)峰分離不好，無法得到較好的色譜峰，導致測定結(jié)果偏大。該試驗通過設(shè)置不同檢測條件，保證綠原酸較快出峰的前提下，使木犀草苷能與相鄰雜質(zhì)峰分離干凈，目標峰形較好，與雜質(zhì)峰達到基線分離。

（2）采用HPLC法測定金銀花中綠原酸和木犀草苷已有較多報道，但測定時間普遍較長，一般均需25 min以上^[5-7]， 增加了檢測工作量，該試驗通過優(yōu)化色譜條件，能夠在較短時間內(nèi)（16 min左右）得到理想的結(jié)果，縮短了檢測時間。

（3）用該方法中金銀花中綠原酸和木犀草苷的回收率均大于96.0%，RSD值小于1%，回收率和重現(xiàn)性均可滿足定量分析要求。該試驗建立的HPLC法檢測金銀花中2種成分的含量快速易行，可為金銀花質(zhì)量的快速檢測分析提供一定的參考。

參考文獻

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