應(yīng)用薄層色譜—生物自顯影技術(shù)篩選蕪菁子中抗氧化活性成分

代文潔 孫蓮

摘要 [目的]建立蕪菁子中黃酮類成分的TLC鑒別方法和采用薄層色譜分離和生物活性檢測相結(jié)合的薄層色譜-自顯影技術(shù)，初步篩選蕪菁子藥材中的抗氧化活性成分。[方法]以槲皮素和山奈酚為對(duì)照品，采用3種薄層展開系統(tǒng)，選出最佳薄層展開系統(tǒng)；噴以二苯代苦味肼自由基 （DPPH）溶劑（1 ml含0.08 mg的甲醇溶液）顯色，篩選抗氧化活性。[結(jié)果]蕪菁子中黃酮類物質(zhì)的TLC鑒別的最佳展開系統(tǒng)為甲苯-乙酸乙酯-甲酸（22∶14∶1.2）；TLC-生物自顯影抗氧化活性篩選中，黃酮類成分的薄層板呈紫色背景白色斑點(diǎn)。[結(jié)論]蕪菁子藥材中黃酮類成分的TLC鑒別方法可行，重復(fù)性好，可作為蕪菁子藥材的薄層鑒別方法；蕪菁子藥材中的黃酮類成分具有抗氧化活性。

關(guān)鍵詞 蕪菁子；黃酮；TLC；TLC-生物自顯影

中圖分類號(hào) S567 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）26-08944-02

Using TLC-DPPH to Screen Antioxidant Component in Brassica rapa L. Seeds

DAI Wen-jie， SUN Lian （College of Pharmacy， Xinjiang Medical University， Urumqi， Xinjiang 830011）

Abstract [Objective] To establish the thin-layer chromatography for identifying flavonoids and using TLC-DPPH preliminarily screen antioxidant components in Brassica rapa L. seeds. [Method] Quercetin and kaempferol as reference substance， using three ordinary organic deployable system to chose the best one， using TLC-DPPH to screen antioxidant active. [Result] The best deployable system is methylbenzene-ethyl acetate-formic acid （22∶14∶1.2）； the thin-layer board of flavonoids ingredients shows purple background white spots. [Conclusion] This TLC method is simple with good reproducibility. It can be utilized as TLC method for Brassica rapa L. seeds， the flavonoids ingredients of Brassica rapa L. seeds have antioxidant activity.

Key words Brassica rapa L. seeds； Flavonoids； TLC； TLC-DPPH

蕪菁子為十字花科植物蕪菁（Brassica rapa L.）干燥成熟的種子^[1]，為種子植物門、雙子葉植物綱、十字花科、蕓苔屬，二年生草本植物，是維吾爾醫(yī)藥常用藥材^[2-3]。蕪菁子具有清肝明目、破積通淋、利濕退黃的功效，主治下氣消積、黃疸、利濕解毒、乳癰、消渴、瘰疬、目暗積聚、風(fēng)熱毒腫、青盲、癃閉^[4]。蕪菁子中有揮發(fā)油、脂肪酸、黃酮、氨基酸、微量元素、糖類化合物等眾多成分^[5]。黃酮類化合物作為一種功能成分，具有許多有益的生理效應(yīng)與藥理作用，越來越受到重視^[6]?，F(xiàn)代研究表明，黃酮類化合物在體內(nèi)具有改善微循環(huán)、改變體內(nèi)酶活性、降血脂、降膽固醇、抗自由基、抗氧化、增強(qiáng)免疫功能、抑菌、抗病毒和抗炎癥等藥理作用^[7]。孫蓮等采用硅膠、凝膠柱色譜及重結(jié)晶等方法從蕪菁子中分離出槲皮素、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、5-羥基-3′，4′，6，7-四甲氧基黃酮等黃酮類單體^[8]。從天然產(chǎn)物中得到的成分往往要進(jìn)行生物活性測定，傳統(tǒng)的活性測定方法在使用過程中有一定的局限性^[9]。薄層色譜（thin—layer chromatography，TLC）-自顯影技術(shù)（autography）就是利用薄層層析和生物活性測定相結(jié)合的活性物質(zhì)篩選方法，是一種集分離、活性成分測定及鑒定于一體的藥物篩選的“化合物+生物活性”的測定方法^[10]?？蓮浹a(bǔ)傳統(tǒng)活性測定方法的不足，其操作簡單、耗費(fèi)低、靈敏度和專屬性高，是一種快速測定生物活性的方法。筆者首先建立了蕪菁子中黃酮類物質(zhì)的TLC鑒別方法，并采用TLC-生物自顯影法對(duì)蕪菁子的黃酮類物質(zhì)進(jìn)行抗氧化活性成分的初步篩選。

1 材料與方法

1.1 儀器 半自動(dòng)點(diǎn)樣儀（CAMAG LINOMAT5），薄層色譜數(shù)碼成像系統(tǒng)（CAMAG REPROSTAR3），100 μl微量進(jìn)樣針，KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司），HWS26型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司），雙槽展開缸（20 cm×20 cm），分析天平（Mettler-Teledo，AL204-S，d=0.01/0.1mg）。

1.2 試劑與藥材 槲皮素對(duì)照品（中國藥品生物制品檢定所）；山奈酚對(duì)照品（中國藥品生物制品檢定所）；1，1-二苯基-2-苦肼基自由基（DPPH）；高效G板（青島海洋化工廠）；蕪菁子由新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院中藥教研室烏莉婭·沙依提副教授鑒定為蕪菁Brassica rapa L. 的種子，粉碎后過60目篩，于密閉容器置于冰箱冷藏保存。其余試劑均為分析純。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 供試品溶液的制備。精密稱取蕪菁子藥材粉末5 g，置于250 ml錐形瓶中，加入石油醚30 ml，超聲30 min（20 ℃水?。^濾，濾渣揮干石油醚，濾渣轉(zhuǎn)移至100 ml錐形瓶中，加甲醇30 ml，超聲提取30 min∕回流提取1 h（70 ℃水浴），離心，取上清液至加25%的HCl 8 ml，超聲30 min（65 ℃水浴）/回流提取1 h（80 ℃水?。杆倮渲潦覝睾筠D(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中于水浴鍋上蒸發(fā)至干，殘?jiān)?0 ml蒸餾水潤洗，過濾，濾液轉(zhuǎn)移至已加入10 ml乙酸乙酯的分液漏斗中，萃取3次，合并乙酸乙酯層于水浴鍋上濃縮至約5 ml，即得供試品溶液。

1.3.2 對(duì)照品溶液的制備。取槲皮素、山奈酚對(duì)照品各適量，加甲醇溶解并定容，制成每1 ml各含0.5 mg的對(duì)照品溶液。

1.3.3 顯色劑溶液的制備。稱取1 g的三氯化鋁用100 ml的乙醇溶解制成1%的三氯化鋁乙醇溶液。

1.3.4 薄層色譜鑒別。

1.3.4.1 展開系統(tǒng)的選擇。分別吸取槲皮素與山奈酚對(duì)照品溶液各3 μl以及蕪菁子供試品溶液6 μl，點(diǎn)于同一高效G硅膠薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（22∶14∶1.2）、甲苯-氯仿-丙酮（8∶5∶7）、正己烷-乙酸乙酯-甲酸（7∶5∶0.8）3種不同展開系統(tǒng)展開，取出，晾干，噴以1%三氯化鋁乙醇溶液顯色，105 ℃加熱5 min至斑點(diǎn)清晰，紫外光366 nm下檢視，通過圖中斑點(diǎn)數(shù)目、分離度和拖尾情況確定最佳展開系統(tǒng)。

1.3.4.2 樣品不同提取方法的考察。分別吸取用超聲提取方法的蕪菁子供試品溶液以及用回流提取的蕪菁子供試品溶液各6 μl點(diǎn)于同一薄層板上，以最佳展開系統(tǒng)展開，取出，晾干，噴以1%三氯

化鋁乙醇溶液顯色，105 ℃加熱5 min至斑點(diǎn)清晰，紫外光366 nm下檢視。

1.3.5 TLC-生物自顯影法。分別吸取槲皮素與山奈酚對(duì)照品溶液各3 μl以及蕪菁子供試品溶液6 μl，點(diǎn)于同一高效G硅膠薄層板上，以最佳展開系統(tǒng)展開，取出，晾干，噴以二苯代苦味肼自由基 （DPPH）溶劑（1 ml含0.08 mg的甲醇液）顯色，105 ℃加熱5 min至斑點(diǎn)清晰，可見光下檢視。

3 討論

（1）蕪菁子中黃酮類物質(zhì)的TLC鑒別的最佳展開系統(tǒng)為甲苯-乙酸乙酯-甲酸（22∶14∶1.2），樣品最佳提取方法為回流。該研究過程中還考察了不同檢視方法（白光、紫外366 nm、254 nm）以及不同薄層板（GF254板、G板、H板、高效G板、自鋪板）等因素對(duì)試驗(yàn)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)斑點(diǎn)在紫外366 nm條件下檢視效果最佳，自鋪板因厚度大及鋪板不均勻

等因素使斑點(diǎn)顯現(xiàn)不清晰，其他薄層板結(jié)果差異不大，但高效G板相對(duì)來說分離度更好些且有利于TLC-生物自顯影的斑點(diǎn)觀察。

（2）該研究將TLC-薄層生物自顯影法引入到蕪菁子的抗氧化活性研究中，初步篩選出蕪菁子的黃酮類成分具有抗氧化活性，從篩選結(jié)果發(fā)現(xiàn)蕪菁子中的槲皮素及山奈酚均具有抗氧化活性，由樣品展開斑點(diǎn)可初步推斷，山奈酚的抗氧化能力大于槲皮素，但進(jìn)一步確定還需要進(jìn)行定量分析。此外， TLC-生物自顯影薄層板上蕪菁子樣品除槲皮素和山奈酚外還顯現(xiàn)出4個(gè)較清晰的抗氧化斑點(diǎn)，對(duì)這4種斑點(diǎn)的確認(rèn)也將是接下來對(duì)蕪菁子抗氧化成分進(jìn)一步研究的重點(diǎn)。

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