人臍帶間充質干細胞治療慢性HIV感染者的回顧性研究

王嗣予，金磊，李元元，黃輝煌，徐若男，福軍亮，張政，王福生

人臍帶間充質干細胞治療慢性HIV感染者的回顧性研究

王嗣予，金磊，李元元，黃輝煌，徐若男，福軍亮，張政，王福生

目的明確人臍帶間充質干細胞（human umbilical cord-derivedmesenchymal stem cells,UC-MSC）治療慢性HIV感染者的長期安全性和有效性。方法回顧性分析2009年3月—2012年7月在我院接受UC-MSC治療的57例慢性HIV感染者隨訪3年的資料。根據(jù)UC-MSC治療前CD4+T淋巴細胞水平，將所有患者分為≤200個/mm3組（免疫重建失敗組）和> 200個/mm3組（免疫重建成功組）。分析UC-MSC治療的長期安全性和有效性。結果2組患者接受UC-MSC治療1、2、3年，其外周血CD4+T淋巴細胞計數(shù)及CD4/CD8比值均較基線水平顯著升高。進一步分析發(fā)現(xiàn)，免疫重建失敗組UC-MSC治療1年和2年的有效率（以CD4+T淋巴細胞計數(shù)較基線水平升高30%為有效）顯著高于免疫重建成功組。2組隨訪中未發(fā)現(xiàn)明顯不良事件，安全性好。結論UC-MSC治療慢性HIV感染者3年安全性好，可顯著持續(xù)升高外周血CD4+T淋巴細胞計數(shù)和CD4/CD8比值，UC-MSC治療免疫重建失敗患者療效更為顯著。本研究提示慢性HIV感染者免疫重建失敗可能是UC-MSC治療的適應證。

獲得性免疫缺陷綜合征；HIV；間充質干細胞；治療結果

AIDS是由HIV-1感染后引起的一種嚴重危害人類健康的致死性傳染病。在我國HIV-1感染者目前已達78萬，并正以每年40%的速度增長[1]。高效抗反轉錄病毒治療（highly active antiretroviral therapy,HAART）顯著抑制了病毒復制，減少了機會性感染和腫瘤的發(fā)生，降低了HIV-1感染者的病死率[2-3]。然而，近年來發(fā)現(xiàn)，在接受HAART大于2年的患者中，仍有20%的患者即使其病毒復制長期受到抑制，但其外周血CD4+T淋巴細胞數(shù)量卻始終難以恢復，這部分患者被稱為免疫重建失敗患者[4-6]。免疫重建失敗發(fā)生的具體機制目前尚不清楚，可能與胸腺功能障礙[7]、抗病毒治療前CD4+T淋巴細胞數(shù)量[8]、共感染情況以及機體免疫超活化狀態(tài)有關[9-11]。

對于免疫重建失敗患者，目前臨床上尚無特異有效的治療方法。采用白細胞介素-7治療已經(jīng)初步顯示出良好的治療前景，但缺乏大樣本、隨機、對照試驗證實其療效[12-13]。我們前期應用人臍帶間充質干細胞（human umbilical cord-derived mesenchymalstem cells,UC-MSC）開展了小樣本、隨機、對照試驗，發(fā)現(xiàn)UC-MSC治療免疫重建失敗1年安全性好，能顯著增加患者CD4+T淋巴細胞數(shù)量，顯示出良好的臨床應用前景[14-15]。本研究通過回顧性觀察接受UC-MSC治療的57例慢性HIV感染者，旨在闡明UC-MSC治療免疫缺陷患者的長期（3年）安全性和有效性，為發(fā)現(xiàn)UC-MSC治療的適應證提供科學依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 對象選擇57例2009年3月—2012年7月在解放軍第三〇二醫(yī)院就診的慢性HIV感染者，其中男51例，女6例，平均年齡39歲（18～55歲）；44例感染途徑為性傳播，13例為血液傳播；平均感染時間73個月，接受HAART平均31周。診斷依據(jù)《艾滋病診療指南》[16]，并排除現(xiàn)癥機會性感染、腫瘤等并發(fā)癥。

1.2 治療和隨訪本研究獲得解放軍總后勤部衛(wèi)生部批準（衛(wèi)醫(yī)療［2009］126號），并在美國國立衛(wèi)生院臨床試驗網(wǎng)站完成注冊（NCT01213186），得到解放軍第三〇二醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會通過。患者簽署知情同意書后，接受靜脈回輸UC-MSC。首個療程時，分別于0、1、2個月給予3次回輸，每次回輸3×107個細胞；部分患者在首次治療的第2～3年接受第2個或第3個療程治療。患者平均接受UCMSC治療4次。記錄患者治療基線、1年、2年、3年的CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細胞計數(shù)、血常規(guī)和肝腎功能等生化指標，以及病情變化和病史。

1.3 UC-MSC細胞培養(yǎng)參加UC-MSC細胞培養(yǎng)及質量控制的人員均經(jīng)過良好操作規(guī)范（goodmanufacturing practice,GMP）培訓和健康查體，符合GMP上崗要求。在符合GMP的實驗室條件下，取新生兒臍帶剪成0.2～0.5 cm3小塊組織，加入無血清培養(yǎng)基，6～10 d UC-MSC貼壁后傳代。回輸前將細胞懸浮于0.9%氯化鈉溶液。具體培養(yǎng)及回輸方法見文獻［17］。

1.4 實驗室檢查肝功能檢測使用日本Olympus生化分析儀，試劑為英國朗道公司產(chǎn)品。采用熒光定量RT-PCR法檢測血清HIV RNA，試劑盒由北京匹基生物制品有限公司提供，PCR儀為美國ABI公司7900型。外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細胞絕對計數(shù)檢測方法參考文獻［14-15］。

1.5 統(tǒng)計學處理使用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析，定量數(shù)據(jù)以中位數(shù)（最小值，最大值）表示，定性資料以頻數(shù)或百分比表示。2組定量資料采用Mann-Whiteny U檢驗，2組1、2、3年時間點數(shù)據(jù)與基線水平比較采用Wilcoxon配對檢驗。2組定性資料比較采用χ2檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般情況根據(jù)UC-MSC治療前CD4+T淋巴細胞水平，將患者分為≤200個/mm3組（免疫重建失敗組）和＞200個/mm3組（免疫重建成功組）。2組患者基線水平的性別比例、年齡、感染途徑和接受HAART時間等差異均無統(tǒng)計學意義。但免疫重建失敗組CD4+T淋巴細胞最低計數(shù)、UC-MSC治療前CD4+T淋巴細胞計數(shù)及CD4/CD8比值均顯著低于免疫重建成功組（表1）。

表1 UC-MSC治療慢性HIV感染者基線數(shù)據(jù)Table 1 Baseline data of patients w ith chronic HIV infection treated w ith UC-MSC

2.2 長期有效性觀察隨著隨訪時間延長，2組均有部分患者失訪，其原因主要包括：經(jīng)濟問題不愿隨訪、工作改變隨訪不方便以及參加其他臨床試驗等。進一步分析我們發(fā)現(xiàn)：免疫重建失敗組患者接受UC-MSC治療1年和2年外周血CD4+T淋巴細胞計數(shù)較基線水平顯著升高（P＜0.01），而治療3年CD4+T淋巴細胞計數(shù)保持在高水平，但差異無統(tǒng)計學意義。而免疫重建成功組患者接受UC-MSC治療1、2、3年外周血CD4+T淋巴細胞計數(shù)較基線水平均顯著升高（P＜0.01）。2組在治療1、2、3年CD4/CD8比值均較基線水平顯著升高（P＜0.01）。見表2。

表2 UC-MSC治療后慢性HIV感染者外周血T淋巴細胞計數(shù)及肝腎功能改變Table 2 Changes of peripheral blood T lym phocyte counts and liver and kidney function parameters of patients w ith chronic HIV infection after UC-MSC treatment

2.3 血常規(guī)和肝腎功能指標比較基線和治療1、 2、3年不同時間點免疫重建失敗組和免疫重建成功組WBC、淋巴細胞計數(shù)、HGB、PLT、ALT、AST、BUN、CRE和肝腎功能等變化情況，結果表明在治療前及治療各時間點各指標差異均無統(tǒng)計學意義（表2）。

2.4 UC-MSC治療有效率我們將UC-MSC治療后CD4+T淋巴細胞計數(shù)或CD4/CD8比值較基線水平升高30%定義為治療有效，從而進一步比較2組 UC-MSC治療的有效率。分析發(fā)現(xiàn)：免疫重建失敗組UC-MSC治療1、2、3年CD4+T淋巴細胞計數(shù)升高有效率分別為16/27、12/15和3/5，而免疫重建成功組分別為7/26、7/17和7/9（表3）。統(tǒng)計學分析發(fā)現(xiàn)，免疫重建失敗組UC-MSC治療1年和2年有效率顯著高于免疫重建成功組。免疫重建失敗組UCMSC治療1、2、3年CD4/CD8比值升高有效率分別為9/27、10/15和5/5，而免疫重建成功組分別為13/26、11/17和7/9。2組比較差異無統(tǒng)計學意義（表4）。

表3 2組接受UC-MSC治療后各年度CD4+T淋巴細胞計數(shù)升高有效率比較（累計有效例數(shù)/累計存活例數(shù)）Table 3 Comparison of annual efficacy of the increased CD4+T lymphocyte counts between the two groups after UC-MSC treatment(cumulative effective cases/cumulative survival cases)

表4 2組接受UC-MSC治療后各年度CD4/CD8比值升高有效率比較（累計有效例數(shù)/累計存活例數(shù)）Table 4 Com parison of annual efficacy of the increased CD4/CD8 ratio between the two groups after UC-MSC treatment(cumulative effective cases/cumulative survival cases)

2.5 患者安全性觀察2組隨訪2年，未發(fā)現(xiàn)明顯不良事件。UC-MSC回輸后大部分患者自覺精神狀態(tài)改善，食欲增強，睡眠改善，體重增加，抗病毒藥物導致的乏力、胃腸道不適、皮疹等不良反應減輕。

3 討論

我們前期應用UC-MSC治療長期接受HAART的HIV感染者并隨訪1年，研究發(fā)現(xiàn)：UC-MSC治療免疫缺陷患者安全性好[14]，可顯著提高免疫重建失敗患者CD4+T淋巴細胞計數(shù)和CD4/CD8比值，同時降低患者炎癥程度，充分顯示了良好的治療前景[15]。本研究通過回顧性觀察57例接受UC-MSC治療的AIDS患者，旨在闡明UC-MSC治療免疫缺陷患者的長期（3年）安全性和有效性。

UC-MSC治療在1年內(nèi)可有效升高免疫重建失敗患者的CD4+T淋巴細胞水平[14]，但是否有助于免疫重建成功患者CD4+T淋巴細胞水平的恢復尚不清楚。在本研究中，我們根據(jù)UC-MSC治療前患者的CD4+T淋巴細胞計數(shù)，將其分為≤200個/mm3組（免疫重建失敗組）和＞200個/mm3組（免疫重建成功組）。結果發(fā)現(xiàn)，免疫重建成功患者在接受多次UC-MSC治療后，CD4+T淋巴細胞計數(shù)可穩(wěn)定升高，CD4/CD8比值也逐漸升高。結合我們前期的報道，我們的研究提示：UC-MSC對接受HAART的AIDS患者CD4+T淋巴細胞計數(shù)均有升高作用；UC-MSC治療后，免疫重建失敗患者1年和2年有效率（較基線水平升高30%視為有效）均顯著高于免疫重建成功患者，提示接受HAART的免疫重建失敗是UC-MSC治療的更有效適應證。

UC-MSC治療對接受HAART的患者是否能長期維持其療效尚不清楚。我們發(fā)現(xiàn)，UC-MSC治療1～3年，患者CD4+T淋巴細胞計數(shù)持續(xù)升高；與此同時，CD4/CD8比值也持續(xù)穩(wěn)定升高。值得注意的是，免疫重建失敗患者第3年CD4+T淋巴細胞計數(shù)較第2年并未進一步升高，其原因尚不清楚，可能與UC-MSC回輸人體后不能長久發(fā)揮治療作用有關，也可能與免疫重建失敗患者自身的免疫狀態(tài)有關，因為對于免疫重建成功患者，其第3年CD4+T淋巴細胞計數(shù)較第2年進一步升高。將來的研究應該闡明回輸?shù)腢C-MSC在患者體內(nèi)的存活時間及半衰期等動力學特征，并探索最佳的臨床治療方案，包括最佳治療劑量、時機和治療次數(shù)等[18]。

本研究還觀察了UC-MSC治療3年的安全性，發(fā)現(xiàn)UC-MSC治療3年期間患者肝腎功能及血常規(guī)均無顯著變化，提示UC-MSC治療具有良好的長期安全性。當然，本研究尚有一些不足之處。首先，本研究是回顧性研究，缺乏很好的對照，因此，UC-MSC治療AIDS患者的長期安全性和有效性尚需要隨機、對照試驗進一步證實。其次，本研究中并非所有病例都完成3年隨訪，也勢必影響3年療效的準確判斷。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)UC-MSC治療3年安全性好，可持續(xù)升高患者外周CD4+T淋巴細胞計數(shù)和CD4/ CD8比值；其中，UC-MSC治療免疫重建失敗患者療效更為顯著。該研究為明確UC-MSC治療AIDS患者的適應證提供了科學的參考依據(jù)。

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（2013-07-19收稿 2013-09-20修回）

（責任編委 趙敏 本文編輯 王姝）

Retrospective study on human umbilical cord-derived mesenchymal stem cell treatment for patientsw ith chronic HIV infection

WANG Si-yu,JIN Lei,LIYuan-yuan,HUANG Hui-huang,XU Ruo-nan,FU Jun-liang,ZHANG Zheng,WANG Fu-Sheng*
Chinese PLA Medical School,Beijing 100853,China
*Corresponding author,E-mail:fswang302@163.com

Objective To investigate the long-term safety and efficacy of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells(UC-MSC)treatment for patients with chronic HIV infection.M ethods The data of 3-year follow-up for 57 patients with chronic HIV infection treated in our hospital from Mar.2009 to Jul.2012 were analyzed retrospectively.According to the CD4+T lymphocyte counts prior to UC-MSC treatment,these patients were divided into two groups,≤200 cells/mm3group(immunological non-responder group)and>200 cells/mm3group(immunological responder group).The long-term safety and efficacy of UC-MSC treatment were analyzed.Results peripheral CD4+T lymphocyte counts and the ratio of CD4/CD8 at 1-year,2-year and 3-year UC-MSC treatmentwere found to increase significantly as compared with baseline level.Further analysis indicated that 1-year and 2-year therapeutic efficacy(defined as a 30%increase of CD4+T lymphocyte counts as compared with baseline level)in immunological non-responder group was significantly higher than that in immunological responder group.UC-MSC treatmentwas found to be safe as no significantside effects occurred in the two groups during 3-year follow-up period.Conclusions UC-MSC treatment iswell tolerant for 3 years.Peripheral blood CD4+T lymphocyte counts and the ratio of CD4/CD8 increase significantly,and UC-MSC treatment ismore effective in improvement of CD4+T lymphocyte counts in immunological non-responders.This study suggests that immunologicalnon-response to HAARTmay be an indication of UC-MSC treatment in patientswith chronic HIV infection.

acquired immunodeficiency syndrome;HIV;mesenchymal stem cells;treatment outcome

R512.91

A

1007-8134(2014)01-0025-04

國家“十二五”科技重大專項（2013ZX10001002001-002）；國家優(yōu)秀青年基金（81222024）

100853北京，解放軍醫(yī)學院（王嗣予）；100039北京，解放軍第三〇二醫(yī)院生物治療研究中心（王嗣予、金磊、李元元、黃輝煌、徐若男、福軍亮、張政、王福生）

王福生，E-mail:fswang302@163.com