2013年美國《感染性疾病微生物學(xué)實驗室診斷應(yīng)用指南》簡介
——部分病毒綜合征

寧永忠

2013年美國《感染性疾病微生物學(xué)實驗室診斷應(yīng)用指南》簡介
——部分病毒綜合征

寧永忠

本文主要介紹和討論2013年美國感染性疾病學(xué)會和美國微生物學(xué)會聯(lián)合推薦的《感染性疾病微生物學(xué)實驗室診斷應(yīng)用指南》中關(guān)于幾種重要的病毒綜合征的臨床微生物學(xué)實驗室檢查。

微生物學(xué)；實驗室；傳染??；指南

2013年美國《臨床感染病》雜志發(fā)表了美國感染性疾病學(xué)會和美國微生物學(xué)會聯(lián)合推薦的《感染性疾病微生物學(xué)實驗室診斷應(yīng)用指南》[1]。該指南針對感染性疾病的實驗室診斷，幾乎涉及所有感染性疾病、經(jīng)典病原（朊病毒和病毒、細(xì)菌、真菌、寄生蟲等）和臨床檢查［涂片、培養(yǎng)、免疫學(xué)、抗原檢查、核酸擴(kuò)增試驗（nucleic acid amplification tests,NAATs）、耐藥性檢查等］，并強(qiáng)調(diào)臨床和實驗室之間的合作，呼吁建立彼此間“緊密的、積極的工作關(guān)系”。本文主要介紹和討論幾種重要的病毒綜合征的臨床微生物學(xué)實驗室檢查。

1 相關(guān)內(nèi)容簡介

1.1 病毒綜合征實驗室檢查要點①基于患者的年齡、免疫狀態(tài)、病史和其他許多變量來考慮病毒綜合征。②對多數(shù)病原因子而言，可以采集標(biāo)本進(jìn)行檢查。需要額外檢查時，可以采集額外的標(biāo)本冷凍保存在實驗室。對原始標(biāo)本進(jìn)行多種病毒的廣泛檢查是不符合成本-效益原則的。③標(biāo)本的采集和運(yùn)輸是獲得可信的病毒學(xué)檢查結(jié)果的基本保證。應(yīng)咨詢微生物學(xué)實驗室以確定應(yīng)該采集什么樣的標(biāo)本，以及如何送達(dá)實驗室。④很多實驗室沒有病毒學(xué)檢查能力。標(biāo)本將會送至其他實驗室進(jìn)行，周轉(zhuǎn)時間因此會延長。⑤一些病毒因子的交叉反應(yīng)會導(dǎo)致非特異性血清學(xué)結(jié)果。⑥免疫力檢查、既往病毒感染（如組織捐獻(xiàn)者）檢查和新發(fā)感染檢查可能需要不同的方式，即使考慮是同種病毒也需如此。

1.2 幾種重要的病毒綜合征

1.2.1 Epstein-Barr病毒（Epstein-Barr virus,EBV）感染EBV是免疫抑制患者單核細(xì)胞增多癥和淋巴細(xì)胞增殖性疾病的病因。WBC數(shù)量增加伴異型淋巴細(xì)胞比例升高，常見于EBV相關(guān)單核細(xì)胞增多癥。嗜異性抗體通常在癥狀開始后6～10 d可以檢測到，病程的第2周或第3周升高，之后逐漸下降，持續(xù)1年或更長時間。假陽性結(jié)果見于白血病、胰腺腫瘤、病毒性肝炎和巨細(xì)胞病毒（cytomegalovirus,CMV）感染等。假陰性結(jié)果見于約10%的患者，尤其多見于＜10歲的兒童。

當(dāng)快速單點檢查（rapid Monospot）或嗜異性檢查結(jié)果陰性時，應(yīng)考慮其他的實驗室檢查（表1），以便將EBV感染與CMV、腺病毒、HIV、岡地弓漿蟲等引起的單核細(xì)胞增多癥樣疾病區(qū)分開。此時，推薦進(jìn)行針對病毒衣殼抗原（viralcapsid antigen,VCA）和EB核抗原（Epstein-Barr nuclear antigen,EBNA）的EBV IgG和IgM抗體檢查。有VCA IgM（伴或不伴VCA IgG）抗體存在，而無EBNA抗體存在的情況提示近期原發(fā)性EBV感染。EBNA抗體的存在提示感染從標(biāo)本采集時刻算起已超過6周，因此EBV不可能是病原。原發(fā)感染后1～2月或更長時間里會有EBNA抗體產(chǎn)生，終生可以檢測到。90%以上的健康成年人有針對VCA和EBNA抗原的IgG類抗體，5%～10%的EBV感染者未能產(chǎn)生針對EBNA抗原的抗體。

表1 EBV實驗室檢查Table 1 Laboratory diagnosis of EBV

EBV與先天性或獲得性免疫缺陷患者的淋巴細(xì)胞增殖性疾病有關(guān)，包括嚴(yán)重合并免疫缺陷患者、器官移植受者、外周血干細(xì)胞移植受者和HIV感染者。EBV相關(guān)淋巴細(xì)胞增殖性疾病進(jìn)展前，通過NAATs可能會在外周血標(biāo)本中檢測到EBV載量增加；有效治療后病毒載量會明顯下降?；颊叩慕M織標(biāo)本可以是單克隆、寡克隆或多克隆病變?；铙w組織標(biāo)本中檢測到EBV DNA、RNA或蛋白的存在，即可診斷為EBV相關(guān)淋巴細(xì)胞增殖性疾病。

NAATs可以用于檢測AIDS相關(guān)中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤時CSF中的EBV DNA，然而，EBV DNA也可見于其他異常情況（中樞神經(jīng)系統(tǒng)弓漿蟲病或化膿性腦膿腫）的CSF標(biāo)本，因此其陽性是非特異性的。CSF檢出抗體提示中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染、血液污染或抗體穿過血腦屏障。CSF/血清抗體指數(shù)的計算可能會有意義。

1.2.2 CMV感染免疫功能正常宿主疑似CMV急性感染時，推薦CMV特異性抗體檢查為實驗室診斷首選檢查（表2）。免疫功能正常宿主中，IgM類抗體的存在意味著近期感染。但是，EBV感染或其他病因激活免疫系統(tǒng)后的患者會出現(xiàn)CMV IgM假陽性結(jié)果。只有IgG類抗體存在則意味著既往CMV暴露。

對于器官或外周血造血干細(xì)胞移植受者，NAATs檢測CMV載量或抗原血癥（很少有實驗室檢測，因為更青睞于NAATs）被用作搶先治療（preemptive therapy）的標(biāo)志物，用于診斷CMV相關(guān)癥狀體征，以及監(jiān)測抗病毒治療反應(yīng)。用于CMV載量檢查的標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)（Standard Reference Material, SRM）由國家標(biāo)準(zhǔn)和技術(shù)機(jī)構(gòu)提供。SRM2366含有細(xì)菌人工染色體，染色體上有CMV Towne株的基因組。SRM2366可用于評價單位體積中擴(kuò)增的CMV基因組拷貝的數(shù)量（copies/ml）。

CMV可以通過外周血單個核細(xì)胞（以及其他臨床標(biāo)本）進(jìn)行培養(yǎng)。但是，分離非常費(fèi)力，須耗時14 d；使用小瓶培養(yǎng)技術(shù)（shell vial assay）可以將等待時間縮短到1～2 d。除了周轉(zhuǎn)時間長外，基于培養(yǎng)的檢查敏感性也較差。因為病毒載量典型情況下很高，而且新生兒會從尿液排出CMV，所以尿液CMV培養(yǎng)在一些機(jī)構(gòu)一直被用于先天性CMV感染的診斷。

通過免疫組織化學(xué)或原位雜交檢測，CMV抗原可以在福爾馬林固定、石蠟包埋的組織標(biāo)本中顯示。用NAATs檢測多種臨床標(biāo)本中的CMV DNA，有助于診斷CMV感染。

表2 CMV實驗室檢查Table 2 Laboratory diagnosis of CMV

免疫功能受損宿主感染CMV時，有對抗病毒藥物產(chǎn)生耐藥的潛在可能。一系列檢查可以用于評估抗病毒藥物的耐藥性。最常用的檢查是UL97（磷酸轉(zhuǎn)移酶基因）測序，伴或不伴UL54（DNA聚合酶）測序?；谛蛄械臋z查可以通過臨床標(biāo)本DNA擴(kuò)增進(jìn)行，前提是標(biāo)本含有足夠量的CMVDNA。替代方式是，病毒可以首先通過細(xì)胞培養(yǎng)分離。更昔洛韋耐藥多是由于UL97的點突變或缺失（膦甲酸鈉、西多福韋不受影響）所致，最常見的是3個密碼子（460、594、595）的突變。UL54點突變或缺失的發(fā)生較少見。如果更昔洛韋或西多福韋選擇出了UL54突變，則會出現(xiàn)典型的對更昔洛韋和西多福韋的交叉耐藥，但膦甲酸鈉不受影響。如果膦甲酸鈉選擇出突變，通常不會出現(xiàn)對更昔洛韋和西多福韋的交叉耐藥。

對疑似CMV中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的患者，可以用NAATs檢測CSF中的CMVDNA。不過，可能出現(xiàn)假陽性的結(jié)果（如細(xì)菌性腦膜炎患者的CMV DNA可穿過發(fā)炎的血腦屏障污染CSF）。CSF抗體檢查可能意味著中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染、血液污染以及抗體穿過血腦屏障。CSF/血清抗體指數(shù)的計算可能會有意義。

1.2.3 單純皰疹病毒（herpes simplex virus,HSV）感染存在HSV 1或2型糖蛋白G抗原特異性的IgG抗體，就意味著既往相應(yīng)型別病毒的暴露。IgG陽性結(jié)果不能區(qū)分過去和現(xiàn)在的活動性感染，除非配對的急性期和恢復(fù)期標(biāo)本檢查顯示有血清學(xué)轉(zhuǎn)換。IgG水平升高4倍也提示近期暴露，不過，很多商品化試劑盒不能報告用于定量的滴度結(jié)果。存在HSV IgM抗體提示該病毒近期原發(fā)性感染。

對HSV相關(guān)皮膚或黏膜病變而言，NAATs是最敏感、最特異和最快速的檢查，并可以區(qū)分HSV 1和2型（表3）。用病毒培養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)拭子用力擦拭疑似病變的皮膚和黏膜的基底部，水皰被連根去除后暴露基底。舊的、干的和結(jié)痂的病變不太可能產(chǎn)生陽性結(jié)果。培養(yǎng)和直接熒光抗體檢查的敏感性低于NAATs。

表3 HSV實驗室診斷Table 3 Laboratory diagnosis of HSV

CSF標(biāo)本HSVNAATs檢查，可以用于診斷HSV相關(guān)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。該方法可以區(qū)分HSV 1和2型，1型最常與腦炎有關(guān)，而2型最常與腦膜炎有關(guān)。CSF病毒培養(yǎng)對HSV相關(guān)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病而言不夠敏感。

1.2.4 麻疹病毒感染對麻疹產(chǎn)生免疫的個體，會產(chǎn)生針對病毒IgG抗體的陽性結(jié)果。未產(chǎn)生免疫的個體，IgG和IgM結(jié)果陰性。IgM抗體陽性而無IgG抗體，提示近期有麻疹病毒感染。出疹當(dāng)天IgM通常是陽性。然而，在出疹后最初72 h內(nèi)，多達(dá)20%的IgM檢查可能是假陰性。因此，如果急性期IgM陰性，出疹72 h后應(yīng)該采集第2份血清標(biāo)本檢測IgM。在出疹后1個月或更長的時間里可檢測到IgM。近期接種麻疹病毒疫苗個體的IgM也可能是陽性。血清學(xué)診斷急性麻疹時需要有IgG抗體升高4倍（表4）。采集2份血清標(biāo)本，第1份標(biāo)本在出疹開始時盡早采集，第2份在10～30 d后采集。2份標(biāo)本應(yīng)采用相同的方法在當(dāng)時就進(jìn)行檢測。確定滴度升高的標(biāo)準(zhǔn)因所用特異性試劑盒的不同而有所差別。

CSF中麻疹特異性抗體的檢測可用于亞急性硬化性全腦炎（subacute sclerosing panencephalitis, SSPE）的診斷。SSPE患者CSF中麻疹抗體水平升高顯著。

表4 麻疹病毒實驗室診斷Table 4 Laboratory diagnosis ofmeasles virus

麻疹病毒可分離自喉部、鼻咽部或尿液中。出疹后應(yīng)立即采集標(biāo)本。NAATs也可考慮作為診斷試驗。

1.2.5 腮腺炎病毒感染幾種類型的檢查可用于腮腺炎診斷（表5）。腮腺炎診斷的實驗室標(biāo)準(zhǔn)包括腮腺炎病毒IgM抗體血清學(xué)檢查陽性、急性期和恢復(fù)期配對血清IgG抗體水平4倍升高、臨床標(biāo)本分離到腮腺炎病毒或臨床標(biāo)本檢測到腮腺炎病毒RNA。

表5 腮腺炎病毒實驗室診斷Table 5 Laboratory diagnosis ofmum ps virus

急性期IgG檢查的血清應(yīng)在癥狀出現(xiàn)后5 d內(nèi)采集（即診斷的時候）；恢復(fù)期血清應(yīng)在癥狀出現(xiàn)后大約2周采集。IgM抗體典型情況下在疾病最開始的幾天內(nèi)可檢測到，起病1周后達(dá)到高峰。應(yīng)用單劑或多劑腮腺炎病毒疫苗會導(dǎo)致缺失的、延遲的或暫時的IgM反應(yīng)。如果急性期IgM陰性，應(yīng)在癥狀出現(xiàn)后2～3周采集第2份標(biāo)本進(jìn)行IgM檢查。

對既往有免疫的疑似患者，腮腺炎病毒檢查尤其是確診病例的重要方法。病毒分離的首選標(biāo)本是采自腮腺管的拭子，或采自受累的唾液腺管的拭子。腮腺炎病毒可以通過分子技術(shù)（未經(jīng)美國國家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)）檢測。從腮腺炎癥狀出現(xiàn)前一直到癥狀出現(xiàn)后5～9 d，都可以檢測到腮腺炎病毒RNA。

CSF抗體檢查提示中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染、血液污染或抗體穿過血腦屏障。CSF/血清抗體指數(shù)的計算可能會有意義。

1.2.6 登革熱病毒感染登革熱是蚊子傳播的發(fā)熱性疾病。對來自特定地區(qū)的旅游者，鑒別診斷時除考慮瘧疾外，還要考慮基孔肯雅病和黃熱病。登革熱診斷需要實驗室確證，方法包括培養(yǎng)、NAATs或登革熱特異性抗體檢測（表6）。血清學(xué)檢查是診斷登革熱病毒感染最常見的方法。應(yīng)在發(fā)熱開始后5 d內(nèi)采集急性期血清標(biāo)本。登革熱病毒感染早期階段可能檢測不到IgG抗體；IgG抗體一般情況下在癥狀出現(xiàn)后至少6 d才能產(chǎn)生。登革熱病毒的IgG抗體可以持續(xù)幾十年。對高度疑似登革熱的患者，如果報告了陰性的檢查結(jié)果，應(yīng)在疾病開始后7～10 d再采集第2份血清標(biāo)本，檢測IgM和IgG抗體。登革熱病毒IgM的檢出提示近期感染，不過登革熱病毒IgG血清學(xué)轉(zhuǎn)換也可用于確診感染。抗登革熱病毒抗體檢查可能會檢測到針對其他黃病毒的抗體，包括西尼羅病毒和圣路易斯腦炎病毒。應(yīng)特殊要求，美國國家疾病預(yù)防控制中心實驗室和部分參考實驗室可以進(jìn)行登革熱病毒分子檢測。

表6 登革熱病毒實驗室檢查Table 6 Laboratory diagnosis of dengue virus

1.2.7 腺病毒感染對無其他疾病的健康個體而言，腺病毒通常引起輕度、自限性呼吸系統(tǒng)疾病，多數(shù)病例僅僅通過臨床資料就可進(jìn)行診斷。少數(shù)情況下，宿主腺病毒感染可以致免疫功能正常尤其是患有哮喘病的兒童死亡。免疫功能受損的宿主中，腺病毒可以導(dǎo)致肺炎、播散性感染、胃腸炎、出血性膀胱炎、腦膜腦炎和肝炎等。

診斷可基于NAATs、培養(yǎng)和（或）適合的組織病理學(xué)檢查（表7）。病毒培養(yǎng)周期長，使用小瓶培養(yǎng)技術(shù)會縮短時間。血漿病毒載量（通過定量NAATs評估）可用作搶先治療的標(biāo)志物，用于診斷腺病毒相關(guān)癥狀體征，還可用于監(jiān)測一些免疫功能受損人群的抗病毒治療反應(yīng)。

血清學(xué)檢查有賴于檢測出針對群特異性抗原的抗體，通常須要分析急性期和恢復(fù)期的血清。中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的血清學(xué)診斷基于CSF/血清抗體指數(shù)、急性期和恢復(fù)期IgG滴度4倍升高或僅IgM陽性。CSF中檢測到抗體可能意味著中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染、血液污染或抗體穿過血腦屏障。

表7 腺病毒實驗室診斷Table 7 Laboratory diagnosis of adenovirus

2 討論

隨著免疫力低下人群的增多，病毒感染性疾病在增加。EBV是免疫抑制患者單核細(xì)胞增多癥和淋巴細(xì)胞增殖性疾病的病因；在免疫功能受損、造血干細(xì)胞和器官移植者中應(yīng)警惕CMV感染，當(dāng)免疫功能受損宿主感染CMV時，有對抗病毒藥物產(chǎn)生耐藥的潛在可能；HSV是人類感染比例最高的病毒之一，而且是病毒性腦炎的首位致病原因；麻疹病毒在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的感染涉及SSPE，其預(yù)后不良；近年來國際上因麻風(fēng)腮疫苗不良反應(yīng)問題，腮腺炎病毒成為關(guān)注熱點；登革熱病毒感染是熱帶亞熱帶地區(qū)經(jīng)蚊傳播的發(fā)熱性疾病，感染嚴(yán)重者預(yù)后不良；腺病毒的重癥感染預(yù)后不良，目前對該病毒的了解還遠(yuǎn)不夠深入。臨床診斷和治療的關(guān)鍵依賴實驗室檢查，病毒培養(yǎng)、血清學(xué)檢測及分子生物學(xué)檢測均受多種因素影響，本指南對各種病毒感染性疾病的檢測方法選擇、標(biāo)本及其運(yùn)輸、貯存條件給予指導(dǎo)，希望臨床與實驗室密切配合、規(guī)范操作，不斷提高病毒感染性疾病的診治能力。

[1]Baron EJ,Miller JM,Weinstein MP,etal.A guide to utilization of the microbiology laboratory for diagnosis of infectious diseases: 2013 recommendations by the Infectious Diseases Society of America(IDSA)and the American Society for Microbiology(ASM)［J］. Clin Infect Dis,2013,57(4):e22-e121.

（2013-12-04收稿 2014-01-02修回）

（責(zé)任編委 曲芬 本文編輯 王姝）

A brief introduction to a guide to utilization of them icrobiology laboratory for diagnosis of infectious diseases(2013):some viral syndromes

NING Yong-zhong
Laboratory Department,Peking University Third Hospital,Beijing 100191,China

This article focuses on themicrobiology laboratory diagnosis of some viral syndromesmentioned in a guide to utilization of themicrobiology laboratory for diagnosis of infectious diseases:2013 recommendations by the Infectious Diseases Society of America and the American Society for Microbiology.

microbiology;laboratory;communicable diseases;guidebooks

R37；R51

A

1007-8134(2014)01-0013-05

100191，北京大學(xué)第三醫(yī)院檢驗科（寧永忠）