藤梨根提取物對人胃癌BGC細(xì)胞凋亡及Bax蛋白表達(dá)的影響

郭 潔，王小平，白吉慶

(陜西中醫(yī)學(xué)院，陜西 咸陽 712046)

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藤梨根提取物對人胃癌BGC細(xì)胞凋亡及Bax蛋白表達(dá)的影響

郭 潔，王小平，白吉慶

(陜西中醫(yī)學(xué)院，陜西 咸陽 712046)

目的：探討藤梨根提取物對人胃癌BGC-823細(xì)胞凋亡的影響及其調(diào)控機(jī)制。方法：體外培養(yǎng)對數(shù)生長期胃癌BGC-823細(xì)胞，采用不同濃度的藤梨根提取物作用于人胃癌BGC-823細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，采用免疫組織化學(xué)方法檢測Bax蛋白表達(dá)。結(jié)果：藤梨根作用于BGC-823，在8～32mg·mL-1時(shí)呈不同程度的促進(jìn)凋亡；藤梨根提取物大、中、小劑量組對人胃癌BGC-823細(xì)胞中Bax表達(dá)水平上調(diào)。結(jié)論：藤梨根提取物對人胃癌BGC-823細(xì)胞的增殖具有明顯抑制作用，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)呈濃度依賴性促進(jìn)細(xì)胞凋亡，這可能與激活 Bax 蛋白表達(dá)有關(guān)。

藤梨根；人胃癌BGC細(xì)胞；Bax蛋白

胃癌是我國最常見的腫瘤之一，其死亡人數(shù)在我國居惡性腫瘤的首位[1]。藤梨根為獼猴桃科(Actinidiaceae)獼猴桃屬(Actinidialindi)軟棗獼猴桃(Actinidiaarguta(Sieb. et Zucc.)Planch的根[2]?，F(xiàn)代藥理研究表明：藤梨根具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫等作用，可用于治療消化系統(tǒng)癌癥等癥[3-4]。本實(shí)驗(yàn)采用藤梨根乙酸乙酯提取物，經(jīng)初步實(shí)驗(yàn)，對人胃腺癌SGC-7901細(xì)胞有較好的抗瘤效果。為了進(jìn)一步驗(yàn)證藤梨根提取物的抗胃癌效果，本實(shí)驗(yàn)研究藤梨根提取物對人胃癌BGC-823細(xì)胞凋亡及其部分作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用研究提供相關(guān)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

人胃癌 BGC-823細(xì)胞株(陜西中醫(yī)學(xué)院病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室)，RPMI 1640 培養(yǎng)基(購自GIBCO公司)，小牛血清(Hyclone公司)，Bax一抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供)，SABC試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司提供)，DAB試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司提供)。Ep-ics XL流式細(xì)胞儀(美國Beckmon-Coulter公司)。熒光酶標(biāo)儀(TECAN公司)，低溫高速離心機(jī)(TGL-16G型上海醫(yī)用分析儀器廠)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

胃癌細(xì)胞株 BGC-823培養(yǎng)于含10%新生牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，置 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天換液。待細(xì)胞生長密度80%以上時(shí)，以0.25%胰蛋白酶消化，傳代。

2.2 MTT法檢測細(xì)胞增殖水平

取對數(shù)增長的BGC-823 細(xì)胞制成1× 105個/mL的細(xì)胞懸液，每孔加入 150μL，給不同濃度(8，16，32mg/mL)的藥物30μL/孔，每個濃度重復(fù)3個孔，置CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，分別在24h、48h、72h測一次指標(biāo)，檢測前4h加入5mg/mL MTT貯存液25μL/孔，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。用自動酶標(biāo)讀數(shù)儀在570nm波長處測定每孔吸光度(A)值。計(jì)算細(xì)胞生長抑制率(GI)，GI=(1-實(shí)驗(yàn)組A值/對照組A值)×100%。重復(fù)實(shí)驗(yàn)5次。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡水平

取6 孔板，接種培養(yǎng)細(xì)胞，置37℃、5%CO2溫箱培養(yǎng)，培養(yǎng)至細(xì)胞生長密度為80%以上，加無血清培養(yǎng)基，置37℃、5% CO2溫箱繼續(xù)培養(yǎng)24h，加入藥物，使各組藤梨根提取物的濃度為 0、16、32mg/mL。置37℃、5% CO2溫箱繼續(xù)培養(yǎng)24h。PBS液洗滌，調(diào)整細(xì)胞濃度約為1×105個/mL。每個濃度藥物各取1mL細(xì)胞置于EP管中，每管1mL細(xì)胞，離心5min，棄上清液，每管加入1mL PBS，使細(xì)胞懸浮，離心5min，棄上清液；重復(fù)步驟，PBS棄凈，將細(xì)胞重懸于200μL Buffer，每管加入10μL Annexin V-FITC混勻，避光反應(yīng)15min，每管加入300μL Buffer。上機(jī)前5min加入10μL碘化乙啶(PI)染色，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

2.4 Bax蛋白表達(dá)水平檢測

將對數(shù)生長期BGC-823細(xì)胞接種于12孔板內(nèi)，按組加入相應(yīng)濃度的藥物24h后取出，按照試劑盒使用說明檢測Bax蛋白表達(dá)水平。

3 結(jié)果

MTT 法檢測細(xì)胞增殖的影響。不同濃度的藤梨根提取物作用于人胃癌BGC-823細(xì)胞12h后，對細(xì)胞增殖均有不同程度抑制。MTT 法檢測結(jié)果顯示，當(dāng)藤梨根提取物濃度為8mg/mL時(shí)，對胃癌細(xì)胞增殖的抑制率為20.95%；濃度為16mg/mL，對胃癌細(xì)胞增殖的抑制率明顯增強(qiáng)，為25.63%；當(dāng)濃度為32mg/mL時(shí)，對人胃癌 BGC-823 細(xì)胞的增殖抑制率達(dá)到 53.19%。

對人胃癌 BGC-823 細(xì)胞凋亡水平的影響。本實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對照和3個藤梨根提取物組，結(jié)果表明，藤梨根提取物濃度在16mg/mL、32mg/mL時(shí)能夠顯著誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的凋亡。濃度為16mg/mL時(shí)，凋亡細(xì)胞最多，濃度為32mg/mL時(shí)，死亡細(xì)胞迅速增多。見表1。

16mg/mL藤梨根提取物處理12h后，免疫組化檢測胃癌BGC-823細(xì)胞Bax的蛋白表達(dá)水平，與對照組相比，藤梨根提取物預(yù)處理可明顯增加細(xì)胞內(nèi)Bax蛋白表達(dá)水平。見表2。

表1 流式細(xì)胞術(shù)檢測BGC-823壞死、正常和凋亡細(xì)胞比例變化

注：與空白對照組比較，**P<0.01。

表2 藤梨根對胃癌BGC-823細(xì)胞Bax基因蛋白表達(dá)的影響

注：與陰性對照組比較，**P<0.01。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)中，我們通過免疫組化的方法證實(shí)了藤梨根預(yù)處理可以有效增加Bax表達(dá)水平，與此同時(shí)降低胃癌SGC-7901細(xì)胞中P53和Bcl-2的表達(dá)[5-6]，這些結(jié)果表明，藤梨根促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡的細(xì)胞機(jī)制可能與Bax、P53和Bcl-2的表達(dá)密切相關(guān)，為了進(jìn)一步探索藤梨根提取物的抗腫瘤作用及其機(jī)理，我們還需進(jìn)一步研究，確定其抑制腫瘤生長的有效劑量。本研究的開展有利于指導(dǎo)今后藤梨根的臨床用藥。

[1] 胡家露,樊代明.內(nèi)科學(xué)[M].北京:高等教育出版社,2001:557．

[2] 國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會.中華本草(第三冊,第九卷)[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1999:536-537.

[3] 南京藥學(xué)院《中草藥學(xué)》編寫組.中草藥學(xué)(中冊)[M].南京:江蘇人民出版社,1976:662-623.

[4] 薛瑞，王小平． 藤梨根提取物對裸鼠移植瘤的抑制作用研究[J]．陜西中醫(yī)，2008，29(5):362-363．

[5] 王小平， 白吉慶， 葉崢嶸. 藤梨根提取物對裸鼠移植人胃癌SGC-7901細(xì)胞瘤p53基因蛋白的影響[J].現(xiàn)代中醫(yī)藥,2012,32(1):56-57.

[6] 白吉慶 ，王小平，葉崢嶸. 藤梨根提取物對人胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡及Bcl2的影響[J].陜西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2012,35(1):59-61.

(責(zé)任編輯：宋勇剛)

The Effects of Kiwi Root Extract on Human Gastric Cancer BGC Cell Apoptosis and Bax Protein Expression

Guo Jie, Wang Xiaoping, Bai Jiqing

(Shanxi College of Traditional Chinese Medicine， Shanxi 712046,China)

Objective:To discuss the effects of Kiwi root extract on human gastric cancer BGC cell apoptosis and its regulatory mechanism. Methods:The gastric cancer BGC-823 cells in logarithmic phase were cultivated in vitro.Kiwi root extract with different concentrations act on gastric cancer BGC-823 cells. The cell apoptosis was detected by Flow cytometry instrument, and Bax protein expression was tested by immunohistochemical methods. Results:Kiwi root can act on BGC-823 cells. Kiwi root in 8～32 mgoml-1can promote cell apoptosis in the different level. Kiwi root extract raised Bax expression levels of human gastric cancer BGC-823 cells in large dose group, medium dose group or small dose group. Conclusion:Kiwi root extract has obvious inhibitory effect on human gastric cancer BGC-823 cells proliferation. Kiwi root extract in the experimental concentration range can promote cell apoptosis in concentration dependence, which may be related to activation of Bax protein expression.

Kiwi Root;Human Gastric Cancer BGC Cell Apoptosis；Bax Protein

2014-02-21

陜西省教育廳資助項(xiàng)目(08JK266);陜西省科技廳中藥現(xiàn)代化資助項(xiàng)目[(2009K19-03(2);2010K17-02)]

郭潔 (1980-)，女，陜西中醫(yī)學(xué)院講師，研究方向?yàn)橹兴幖皬?fù)方藥理作用。

R285.6

A

1673-2197(2014)13-0012-02