噴霧冷凍干燥對(duì)家蠅幼蟲(chóng)活性成分抗菌及抗炎活性影響

褚夫江，劉文彬，朱家勇*

(1.廣東省生物活性藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州510006；2.廣東藥學(xué)院 基礎(chǔ)學(xué)院，廣東 廣州 510006)

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噴霧冷凍干燥對(duì)家蠅幼蟲(chóng)活性成分抗菌及抗炎活性影響

褚夫江1,2，劉文彬1,2，朱家勇1,2*

(1.廣東省生物活性藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州510006；2.廣東藥學(xué)院 基礎(chǔ)學(xué)院，廣東 廣州 510006)

以人工飼養(yǎng)繁殖的家蠅(Musca)3齡幼蟲(chóng)為材料，探討噴霧冷凍干燥對(duì)家蠅幼蟲(chóng)活性提取物抗菌及抗炎活性的影響。結(jié)果表明，經(jīng)噴霧冷凍干燥處理的家蠅幼蟲(chóng)活性提取物對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌具有有效抑制作用；對(duì)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥因子TNF-α和IL-6表達(dá)具有明顯的抑制作用。

家蠅幼蟲(chóng)；噴霧冷凍干燥；冷凍干燥；抗菌；抗炎

家蠅隸屬昆蟲(chóng)綱(Insecta)雙翅目(Diptera)環(huán)裂亞目(Cyclorrhapha)蠅科(Muscidae)家蠅屬(Musca)。其幼蟲(chóng)蠅蛆含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪酸、甲殼素 、維生素、礦物元素和抗菌肽等多種活性物質(zhì)[1]，是一種非常重要的昆蟲(chóng)資源，其所特有的抗菌[2]及抗炎[3]活性逐漸引起研究者的重視。隨著蠅蛆養(yǎng)殖規(guī)模逐漸擴(kuò)大，工廠化養(yǎng)殖為蠅蛆資源的利用奠定了充分的原料基礎(chǔ)。目前，關(guān)于蠅蛆的研究開(kāi)發(fā)利用還處于初級(jí)階段，特別是在醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用還有待進(jìn)一步開(kāi)發(fā)，而有效減少加工過(guò)程中蠅蛆體內(nèi)藥用成分的活性缺失成為蠅蛆資源開(kāi)發(fā)的重點(diǎn)。

在前期的研究中，我們比較了傳統(tǒng)炮制和現(xiàn)代加工方法對(duì)蠅蛆抗菌及抗炎活性的影響，結(jié)果表明現(xiàn)代加工工藝能夠有效保護(hù)蠅蛆中抗菌及抗炎物質(zhì)的活性[4]。真空冷凍干燥(freeze drying，F(xiàn)D)能有效減少活性缺失，但是此法所需干燥時(shí)間長(zhǎng)、耗能高，不能滿足規(guī)?；a(chǎn)的需要。因此，有必要尋求一種更快速的樣品干燥方法。

噴霧冷凍干燥(spray freeze drying， SFD)是近年發(fā)展起來(lái)的新型干燥技術(shù)，其結(jié)合了噴霧干燥和冷凍干燥兩項(xiàng)技術(shù)優(yōu)點(diǎn)[5]。干燥后的物料為粉狀固體，產(chǎn)品原有的生物、化學(xué)特性基本不變，易于長(zhǎng)期保存，特別適用于熱敏性、黏稠性、活性物料及含糖量高的產(chǎn)品的低溫干燥。本實(shí)驗(yàn)以實(shí)驗(yàn)室人工飼養(yǎng)的家蠅3齡幼蟲(chóng)為原料，經(jīng)組織勻漿、過(guò)濾、離心及超濾離心進(jìn)行活性成分的提取，采用冷凍干燥及噴霧冷凍干燥技術(shù)進(jìn)行活性成分的制備，研究不同方法所獲產(chǎn)品含水量及體外抗菌、抗炎活性的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

大腸埃希菌(Escherichia coli)ACCC01309、金黃色葡萄球菌(Staphylococus aureus)ATCC 25923為本實(shí)驗(yàn)室保存。細(xì)胞株為鼠源巨噬細(xì)胞(Macrophage, Mφ) RAW264.7，購(gòu)于中山大學(xué)細(xì)胞與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。種蠅獲贈(zèng)于廣東省疾病預(yù)防與控制中心，雙翅目(Diptera)，蠅科(Muscidae)，蠅屬(Musca)，家蠅(M.domestica)，實(shí)驗(yàn)室自行繁育獲得家蠅3齡幼蟲(chóng)。籠養(yǎng)方式飼養(yǎng)成蠅，成蠅交配、產(chǎn)卵、孵化，發(fā)育為幼蟲(chóng)，待幼蟲(chóng)成長(zhǎng)為3齡幼蟲(chóng)后，采用冷熱刺激的方式進(jìn)行誘導(dǎo)富集小分子活性成分，收集幼蟲(chóng)待用。

1.2 工藝流程

3齡幼蟲(chóng)經(jīng)組織勻漿，過(guò)40目紗網(wǎng)，12 000r/min離心10min，收集上清，依次用截留分子量為100KD及30KD超濾膜進(jìn)行超濾，收集濾液后進(jìn)行冷凍干燥及噴霧冷凍干燥。

1.3 冷凍干燥制備家蠅幼蟲(chóng)活性成分

準(zhǔn)確量取400.00mL超濾截留液，于-80℃冰箱中速凍3h，轉(zhuǎn)移至多歧管式真空冷凍干燥器中進(jìn)行干燥，條件：冷阱溫度-60℃、真空度20Pa、干燥時(shí)間20h。干燥結(jié)束后，收集產(chǎn)品，準(zhǔn)確稱(chēng)量，獲得產(chǎn)品1，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 噴霧冷凍干燥制備家蠅幼蟲(chóng)活性成分

準(zhǔn)確量取400.00mL超濾截留液，檢查儀器氣密性，待儀表顯示穩(wěn)定10min后，設(shè)定條件：冷阱溫度-60℃、真空度20Pa、物料溫度-25℃、運(yùn)行時(shí)間8h。干燥結(jié)束后，收集產(chǎn)品，準(zhǔn)確稱(chēng)量，獲得產(chǎn)品2，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.5 含水量測(cè)定

方法參照國(guó)家藥典2010版附錄ⅨH水分測(cè)定法第一法(烘干法)進(jìn)行。取供試品2.5g，平鋪于干燥至恒重的扁形稱(chēng)量瓶中，厚度不超過(guò)5mm；疏松供試品不超過(guò)10mm ；精密稱(chēng)定，打開(kāi)瓶蓋在100～105℃干燥5h，將瓶蓋蓋好，移置干燥器中，冷卻30min，精密稱(chēng)定，再在上述溫度干燥1h，冷卻，稱(chēng)重，至連續(xù)兩次稱(chēng)重的差異不超過(guò)5mg為止。根據(jù)減失的重量，計(jì)算供試品中含水量(%)，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.6 抗菌活性檢測(cè)

取無(wú)菌96孔板，每孔加入濃度為1×106CFU/mL菌液100μL，再分別加入相應(yīng)濃度的產(chǎn)品1和2 (倍比稀釋?zhuān)?00mg/mL、100mg/mL、50mg/mL、25mg/mL、12.5mg/mL、6.25mg/mL、3.12mg/mL、1.56mg/mL、0.78mg/mL、0.39mg/mL)，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照組(蒸餾水)、空白組(無(wú)細(xì)菌)，37℃培養(yǎng)16～20h。每孔加入5μL0.5%氯化三苯四氮唑，37℃培養(yǎng)至無(wú)藥物對(duì)照組變紅色時(shí)終止培養(yǎng)，有細(xì)菌生長(zhǎng)的孔顯紅色，無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)則不顯色。試驗(yàn)組無(wú)菌生長(zhǎng)的最小稀釋度所對(duì)應(yīng)的濃度為最小抑菌濃度(MIC)。將上述未顯色的孔各取培養(yǎng)的混合物100μL，涂布于LB固體平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，菌落數(shù)小于5個(gè)的平板對(duì)應(yīng)的濃度為最小殺菌濃度(MBC)。

1.7 抗炎活性檢測(cè)

巨噬細(xì)胞RAW264.7按照1×106cell/mL接種于6孔板，培養(yǎng)24h后，更換為無(wú)血清培養(yǎng)基。進(jìn)行分組處理：正常對(duì)照組、LPS處理組(100ng/mLLPS)、實(shí)驗(yàn)處理組[不同濃度的產(chǎn)品1和2：高劑量組(100μg/mL)、中劑量組(40μg/mL)、低劑量組(10μg/mL)+100ng/mLLPS]。各組細(xì)胞在不同處理因素作用24h后，收集培養(yǎng)液上清，參照TNF-α、IL-6檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定450nm吸光度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算相應(yīng)的濃度。

1.8 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)

2 結(jié)果

2.1 不同干燥方法對(duì)產(chǎn)品含水量的影響

經(jīng)精確稱(chēng)量，產(chǎn)品1的質(zhì)量為(3.157±0.115)g，產(chǎn)品2的質(zhì)量為(3.078±0.073)g。影響產(chǎn)品含水量的主要因素為干燥原理和溫度等因素，經(jīng)測(cè)定產(chǎn)品1的含水量為(3.45±0.98)%，產(chǎn)品2的含水量為(2.14±0.42)%，兩種干燥方法所獲產(chǎn)品的含水量均小于5%。

2.2 不同干燥方法對(duì)產(chǎn)品抗菌活性的影響

以常見(jiàn)代表性的革蘭氏陽(yáng)性菌(G+)金黃色葡萄球菌及革蘭氏陰性菌(G-)大腸埃希菌作為試驗(yàn)菌，采用微量肉湯稀釋法測(cè)定產(chǎn)品1和產(chǎn)品2對(duì)這些菌株的最小抑菌濃度(MIC)及最小殺菌濃度(MBC)。結(jié)果顯示，產(chǎn)品1和產(chǎn)品2對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌均具有一定的抑制作用，其中，相對(duì)產(chǎn)品1，產(chǎn)品2對(duì)大腸埃希菌的抑制作用更為顯著。見(jiàn)表1。

表1 不同干燥方法對(duì)家蠅幼蟲(chóng)活性成分抑菌活性的影響

2.3 不同干燥方法對(duì)產(chǎn)品抗炎活性的影響

相對(duì)LPS處理組，產(chǎn)品1和產(chǎn)品2均能有效抑制巨噬細(xì)胞TNF-α、IL-6的表達(dá)，且抑制效果具有一定的劑量依賴(lài)性。在同等劑量條件下，產(chǎn)品2能夠更顯著地降低TNF-α、IL-6水平。相對(duì)陰性對(duì)照組，在低劑量條件下，產(chǎn)品2對(duì)TNF-α的降低效率達(dá)20%以上，而產(chǎn)品1則降低12%左右；高劑量條件下，產(chǎn)品2對(duì)TNF-α的降低效率達(dá)70%以上，產(chǎn)品1則降低67%左右。產(chǎn)品1和產(chǎn)品2對(duì)IL-6表達(dá)的影響也具有同樣的趨勢(shì)。見(jiàn)表2。

3 討論

蠅蛆的藥用價(jià)值主要集中在蠅蛆體內(nèi)免疫活性物質(zhì)的開(kāi)發(fā)。研究表明，蠅蛆能分泌多種抗菌活性物質(zhì)，具有抑菌、促進(jìn)傷口愈合及殺傷癌細(xì)胞等功能[6]。前期研究發(fā)現(xiàn)，家蠅幼蟲(chóng)體內(nèi)的小分子活性成分具有改善動(dòng)物動(dòng)脈粥樣硬化，減輕炎癥反應(yīng)的作用[7-8]。而如何在放大生產(chǎn)過(guò)程中最大限度地保持家蠅幼蟲(chóng)有效成分的活性成為蠅蛆資源開(kāi)發(fā)的關(guān)鍵。為此，我們就冷凍噴霧干燥對(duì)蠅蛆活性成分抗炎及抗菌活性的影響進(jìn)行了初步研究。

表2 不同干燥方法對(duì)家蠅幼蟲(chóng)活性成分抗炎活性的影響 ±s，n=6)

注：與本產(chǎn)品陰性對(duì)照組比較，##P< 0.01 ；與產(chǎn)品1對(duì)應(yīng)劑量組比較，**P< 0.01。

含水量是檢驗(yàn)干燥效果的重要指標(biāo)之一。結(jié)果表明，冷凍干燥和噴霧冷凍干燥均能有效去除產(chǎn)品中的水分，且含水量均在5%以下，其中噴霧冷凍干燥所獲產(chǎn)品的含水量低于冷凍干燥所獲產(chǎn)品，主要原因是噴霧冷凍干燥增大了干燥面積，能夠更有效地提高干燥效率[9]。有效去除產(chǎn)品中的水分后，產(chǎn)品的活性有何影響呢？我們就兩種方法所獲產(chǎn)品的抗菌及抗炎活性進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示，兩種方法所獲產(chǎn)品對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌均具有一定的抑制作用。其中，噴霧冷凍干燥方法所獲產(chǎn)品對(duì)大腸埃希菌的抑制作用更為顯著；兩種方法所獲產(chǎn)品均具有明顯抗炎效果，其中噴霧冷凍干燥所獲產(chǎn)品的抗炎作用更顯著。在針對(duì)不同干燥方法對(duì)葛仙米藻蛋白抗氧化特性影響的研究中，也同樣證實(shí)噴霧冷凍干燥能夠更好地保持提取物的活性[10]。

綜上所述，噴霧冷凍干燥能夠有效去除家蠅幼蟲(chóng)活性成分中的水分，同時(shí)能有效保持活性成分的抗菌及抗炎活性，是一種可用于規(guī)模化開(kāi)發(fā)蠅蛆資源的理想干燥技術(shù)。

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(責(zé)任編輯：宋勇剛)

Effects of Spray Freeze Drying on Antibacterial and Anti-inflammatory Activity of Housefly Larvae

Chu Fujiang1,2,Liu Wen bin1,2,Zhu Jiayong1,2*

(1.Guangdong Provincial Key Laboratory of Pharmaceutical Bioactive Substances, Guangzhou 510006, China; 2.School of Basic Courses, Guangdong Pharmaceutical University,Guangzhou 510006,China)

Three instar larvae of housefly (Musca) which harvested by captive breeding was taken as raw materials. The effects of spray freeze drying on antibacterial and anti-inflammatory activity of housefly larvae were investigated. And the results showed that the extract of housefly larvae which was treated by spray freeze drying had the function of inhibiting the Staphylococcus aureus and Escherichia coli. And also the expression of TNF-α and IL-6 of macrophage which induced by LPS were inhibited when treated with the extract of housefly larvae.

Housefly Larvae; Spray Freeze Drying; Freeze Drying; Antibacterial; Anti-inflammatory

2014-03-17

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81274061)；廣東省戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)核心技術(shù)攻關(guān)項(xiàng)目(2012A080800016)；廣東省醫(yī)學(xué)科研基金項(xiàng)目(B2013189)；廣東省自然科學(xué)基金(S2013040014444)；廣東省高等學(xué)校學(xué)科與專(zhuān)業(yè)建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)資金項(xiàng)目(2013LYM0045)

褚夫江(1980-)，男，博士，廣東省生物活性藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室助理研究員，研究方向?yàn)樯锘钚运幬锏慕Y(jié)構(gòu)與功能。

朱家勇(1954-)，男，廣東藥學(xué)院教授，研究方向?yàn)樯锘钚运幬锏慕Y(jié)構(gòu)與功能。

R282.74

A

1673-2197(2014)13-0006-03