雙黃連注射劑中黃芩苷抗原合成及抗血清制備分析探討

葉厚春

(贛縣人民醫(yī)院, 江西 贛州 341100)

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雙黃連注射劑中黃芩苷抗原合成及抗血清制備分析探討

葉厚春

(贛縣人民醫(yī)院, 江西 贛州 341100)

目的：對雙黃連注射劑中黃芩苷抗原的合成以及抗血清成分的制備情況進(jìn)行分析探討，為今后藥物研究工作提供可靠的參考依據(jù)。方法：將黃芪苷與牛血清白蛋白采用高碘酸鈉法進(jìn)行交聯(lián)，鑒定方法為紫外掃描和SDS-PAGE法；經(jīng)黃芩苷與牛血清白蛋白復(fù)合物對新西蘭兔進(jìn)行免疫產(chǎn)生抗血清，采取ELISA法進(jìn)行檢測。結(jié)果：經(jīng)紫外掃描和SDS-PAGE法證實黃芩苷與牛血清白蛋白發(fā)生了交聯(lián)，ELISA法在新西蘭兔體內(nèi)檢測出黃芩苷與牛血清白蛋白復(fù)合物的抗血清，抗血清效價為1∶8 000。結(jié)論：經(jīng)高碘酸鈉法黃芩苷抗原合成成功，其為黃芩苷單克隆抗體的制備以及ELISA法快速檢測黃芩苷提供了可靠的依據(jù)，值得關(guān)注。

雙黃連注射劑；黃芩苷抗原；藥物合成；抗血清；鑒定

目前在臨床上中藥注射劑具有不可替代的作用，在疾病的治療中發(fā)揮重要的價值，減輕了患者的痛苦。然而注射劑不良反應(yīng)的存在也對其發(fā)展產(chǎn)生了一定的阻礙作用[1]。本次實驗對雙黃連注射劑中黃芩苷抗原的合成以及抗血清成分的制備情況進(jìn)行分析探討，分別采取高碘酸鈉法合成、紫外掃描和SDS-PAGE法進(jìn)行鑒定，并采取ELISA法對抗血清進(jìn)行檢測，具體情況報道如下。

1 實驗材料

1.1 儀器

AR1140/C型電子天平，TU-1900型雙光束紫外可見分光光度計，DE-1型磁力攪拌器，透析袋，高速冷凍離心機(jī)，CM-230超純水系統(tǒng)，VE-180型電泳槽，EPS300型電泳儀，TY-80A型脫色搖床，THA-3560C高壓滅菌鍋，核酸蛋白分析儀，微量移液器，BIO-TEKELX-800酶標(biāo)儀，DZF-6050型恒溫干燥箱，MA110型電子天平，超聲波清洗器，可調(diào)電爐，無菌注射器，酶標(biāo)板，封口膜。

1.2 實驗動物與試劑

本次實驗中實驗動物為健康新西蘭大白兔；試劑包括：黃芩苷單體，蒸餾水，牛血清蛋白，DMF(分析純)，高碘酸鈉，乙二醇(分析純)，吡啶，二乙基氨基乙基纖維素，生理鹽水，β-巰基乙醇， Tris丙烯酰胺，甲叉雙丙烯酰胺， 過硫酸銨(AP)(分析純)，十二烷基磺酸鈉(SDS)(分析純)，甘氨酸、四甲基乙二胺(TEMED)，戊二醛50%(分析純)，甘油(分析純)，硝酸銀(分析純)，檸檬酸(分析純)，甲醛溶液、冰醋酸(分析純)，氨水，甲醇、無水乙醇(分析純)。

2 方法

2.1 抗原合成

精取黃芩苷單體22.3mg，經(jīng)吡啶溶解，精稱高碘酸鈉10.7mg，加1mL蒸餾水溶解，將其加入到黃芩苷溶液中，室溫下攪拌20min,加入1mL分析純乙二醇，室溫攪拌5min，稱取牛血清白蛋白16.25mg，加2mL磷酸緩沖溶液，將牛血清白蛋白溶液加入到上述黃芩苷反應(yīng)液中，4℃條件下靜置過夜，加新配制的NaHB41mL,室溫條件下反應(yīng)3h，然后在反應(yīng)液中加入磷酸緩沖溶液透析，每6h換一次液，連續(xù)透析2天，透析結(jié)束后離心分離，取濾液經(jīng)冷凍干燥最終獲得黃色固體粉末[2]。

2.2 抗血清制備

取三只健康雄性新西蘭大白兔，兩只采取上述制備的黃芩苷抗原進(jìn)行免疫，另外1只注射生理鹽水進(jìn)行對照。黃芩苷抗原注射流程為：取黃芩苷抗原溶液2mL，加入等體積的弗氏完全佐劑進(jìn)行乳化后基礎(chǔ)免疫，在兔背部進(jìn)行多點注射，每只兔子注射劑量為2mL，20天后間斷性加強(qiáng)免疫，劑量與基礎(chǔ)劑量相同，在4次免疫結(jié)束后采集兔子耳緣靜脈血，4℃條件下保存[3]。

2.3 抗血清分離

精取上述所得血清20mL,加20mL生理鹽水進(jìn)行溶解，再逐滴加入10mL(NH4)SO4飽和溶液,邊加邊攪拌，混勻后靜置30min，在3 000r/min條件下離心20min,取沉淀，加20mL生理鹽水，再次加入10mL(NH4)SO4飽和溶液，混勻后靜置30min，在3 000r/min條件下離心20min,棄上清，去除白蛋白，上述步驟重復(fù)2～3次。用10mL生理鹽水將沉淀溶解，裝入透析袋中，透析除鹽，過夜，4℃條件下透析24h，采取氯化鋇對透析液中硫酸根離子進(jìn)行檢查，在確保無硫酸根離子和NH4存在時進(jìn)行離心操作，將沉淀去除，所得上清液即為抗血清。

3 結(jié)果

本次實驗中采取紫外掃描儀和SDS-PAGE法對黃芩苷與載體蛋白的偶聯(lián)成功與否進(jìn)行了檢查，于190～400nm下對其吸收值進(jìn)行測定，以反應(yīng)前后紫外吸收光譜改變情況對偶聯(lián)與否進(jìn)行判斷，如圖1所示，經(jīng)分析，黃芩苷分別于215nm、247nm、279nm及 315nm處均有吸收峰，牛血清蛋白于278nm處出現(xiàn)最大吸收峰，而黃芩苷牛血清蛋白偶聯(lián)物于271nm出現(xiàn)最大吸收峰，相較于載體蛋白牛血清，偶聯(lián)無最大吸收峰出現(xiàn)偏移，證實偶聯(lián)成功；而后采取間接ELISA法對抗血清進(jìn)行了鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在新西蘭兔體內(nèi)檢測出黃芩苷與牛血清白蛋白復(fù)合物的抗血清，將抗血清吸光度為陰性血清吸光度2倍時，抗血清最大稀釋倍數(shù)為抗血清效價，通過對反應(yīng)液于波長為450nm處吸光度進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)抗體效價是1∶8 000，具體見表1。

圖1 牛血清蛋白、黃芩苷牛血清蛋白偶合物及黃芩苷紫外吸收曲線

稀釋倍數(shù)1∶10001∶20001∶40001∶80001∶160001∶32000陰性對照A450吸光度1.4751.2070.7580.3040.0880.0300.102

4 討論

目前臨床中藥注射劑應(yīng)用中不良反應(yīng)的發(fā)生受到了廣大醫(yī)學(xué)工作者和患者的關(guān)注。雙黃連注射劑中黃芩苷所誘發(fā)的過敏反應(yīng)一般為Ⅰ型超敏反應(yīng)，主要抗體為IgE[4]。本實驗中成功合成了黃芩苷抗原，并在新西蘭大白兔中成功免疫獲得抗血清IgG，對今后雙黃連注射液制劑中致敏原IgE的發(fā)現(xiàn)提供了可靠的依據(jù)。

[1] 丁玉峰.中藥注射劑引起的變態(tài)反應(yīng)及其影響因素[J].華中醫(yī)學(xué)雜志,2007,31(4):244-246．

[2] 李東,方世平.注射用雙黃連不良反應(yīng)的流行病學(xué)特點及對策[J].中國藥業(yè),2000,9(9):19-20．

[3] 賴宇紅,陳浩桉,楊衛(wèi)榮.中藥注射劑變態(tài)反應(yīng)研究亟待加強(qiáng)[J].中藥新藥與臨床藥理,2002,13(5):324-325．

[4] 楊曉慶,姚海,黃益民,等.魚腥草注射液致過敏反應(yīng)120例文獻(xiàn)分析[J].藥物不良反應(yīng)雜志,2005(6):421-423．

(責(zé)任編輯：魏 曉)

2014-04-01

葉厚春(1973-)，男，江西省贛州市贛縣人民醫(yī)院主管藥師，研究方向為臨床藥理。

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1673-2197(2014)21-0012-02