人參黑斑病生防用內(nèi)生拮抗菌分離鑒定及發(fā)酵濃縮液的性質(zhì)

賈斌，趙貞麗，沈國(guó)娟，屈俊亭，李熙英

(1.延邊大學(xué)長(zhǎng)白山生物資源與功能分子教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 延吉 133002;2.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

人參 Panax ginseng C.A.Mey.為名貴中藥，具有大補(bǔ)元?dú)?、?fù)脈固脫、補(bǔ)脾益肺、生津、安神之功能[1］。國(guó)內(nèi)外已有描述的人參病害有40多種，其中人參黑斑病Alternaria panax是人參地上部發(fā)生最普遍、危害最嚴(yán)重的病害之一。主要危害人參的葉片、莖、果實(shí)及根，常年發(fā)病率為20% ～30%，嚴(yán)重時(shí)90%以上，可造成人參早期落葉、植株提前枯萎，參籽質(zhì)量變劣、不能結(jié)實(shí)，參根減產(chǎn) 30% ～80%[1－3］。

以往人參黑斑病的防治主要采用化學(xué)防治，但化學(xué)防治防效不高、不穩(wěn)定，并出現(xiàn)農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染等問(wèn)題。國(guó)內(nèi)對(duì)生物防治人參其它病害(主要是銹腐病)方面有較多報(bào)道[4－6］，但有關(guān)人參黑斑病生物防治方面報(bào)道較少[7－11］。本試驗(yàn)通過(guò)室內(nèi)抑菌試驗(yàn)分離篩選對(duì)人參黑斑病具有較強(qiáng)抑菌活性的拮抗細(xì)菌，并研究其發(fā)酵濃縮液的性質(zhì)，為人參黑斑病生物防治打基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試病原菌和分離材料 植物病原菌有人參黑斑病菌Alternaria panax、人參銹腐病菌Cylindrocarpon destructans、人參灰霉病菌 Botrytis cinerea，水稻紋枯病菌Rhizoctonia solani，楊樹(shù)爛皮病菌Cytospora chrysosperma，水稻惡苗病菌Fusarium moniliforme，由延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理研究室提供。分離材料有人參根莖葉、委陵草根莖葉、狗參根、菖蒲根、龍須草根等，于6—7月在延邊地區(qū)的安圖、琿春、圖們等地采集。

1.2 內(nèi)生拮抗細(xì)菌的分離 分離材料用70%酒精表面清洗后剪成5～10 mm小段，70%乙醇和0.1%升汞表面消毒后置于PDA平板上培養(yǎng)36 h。挑選未長(zhǎng)出微生物菌落的小段1 g放在加入9 mL滅菌水的研缽中碾碎后，取上清液梯度稀釋至10－2，10－3，10－4，然后取其稀釋液均勻涂抹于 PDA 和 NA培養(yǎng)基平板上，每個(gè)處理重復(fù)3次。在25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d后，根據(jù)菌落形態(tài)、顏色、質(zhì)地等對(duì)微生物菌株數(shù)和菌落數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并將不同種類的微生物進(jìn)行劃線純培養(yǎng)后保存作為參試菌株。

1.3 人參黑斑病生防用拮抗菌篩選 PDA平板上培養(yǎng)7 d的人參黑斑病菌菌落用打孔器打出直徑7 mm的菌碟，放置于新的PDA平板中間，在距黑斑病菌菌碟左右兩側(cè)20 mm處點(diǎn)接內(nèi)生菌菌株，以只接病原菌的作對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)5次，置于25℃恒溫箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)第6天時(shí)測(cè)人參黑斑病菌菌落寬度，計(jì)算抑菌率，篩選出抑菌效果好的拮抗菌株。

1.4 拮抗菌鑒定

1.4.1 拮抗細(xì)菌的形態(tài)觀察及生理生化鑒定 對(duì)BJ33進(jìn)行菌落形態(tài)觀察、液體培養(yǎng)特性、革蘭氏染色、芽孢染色、運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)、厭氧生長(zhǎng)試驗(yàn)、V-P測(cè)定、淀粉水解試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、糖類發(fā)酵試驗(yàn)、耐鹽性試驗(yàn)、生長(zhǎng)pH試驗(yàn)、生長(zhǎng)溫度試驗(yàn)、檸檬酸利用試驗(yàn)、丙酸鹽利用試驗(yàn)[12－14］。

1.4.2 拮抗細(xì)菌16S rDNA序列及系統(tǒng)發(fā)育分析以BJ33菌株DNA為模板，利用16S rDNA的一對(duì)通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和 1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')為探針對(duì)16S rDNA序列進(jìn)行分析。16S rDNA序列測(cè)定委托“北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司”進(jìn)行，獲得長(zhǎng)度為1445bp的16S rDNA序列。將該DNA序列在NCBI GenBank上利用BLASTN模塊進(jìn)行BLAST，對(duì)BJ33菌株的16S rDNA序列進(jìn)行同源性分析。根據(jù)BLAST結(jié)果，選擇與BJ33在16S rDNA序列上同源性最高(序列同源性均超過(guò)99%)的前20個(gè)菌株的16S rDNA序列，連同BJ33的16S rDNA序列一起，利用DNAStar分析軟件建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.5 BJ33菌株及發(fā)酵濃縮液對(duì)6種植物病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

1.5.1 BJ33菌株的抑制作用 采用打孔法，用人參黑斑病菌、人參銹腐病菌、人參灰霉病菌、水稻紋枯病菌、水稻惡苗病菌和楊樹(shù)爛皮病菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)(方法同1.5.2)。

1.5.2 BJ33菌株發(fā)酵濃縮液的抑制作用 把活化2 d的BJ33菌株接種于200 mL KB液體培養(yǎng)液中，在28℃，120 r/min恒溫雙層搖床中振蕩培養(yǎng)5 d后，4000 r/min離心25 min，取上清液濃縮至20 mL，再用直徑0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，即為拮抗菌發(fā)酵濃縮液。

用人參黑斑病菌、人參銹腐病菌，人參灰霉病菌，水稻紋枯病菌、水稻惡苗病菌和楊樹(shù)爛皮病菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。發(fā)酵濃縮液的抑菌活性采用打孔法測(cè)定。具體方法如下:先在PDA平板中間放置直徑7 mm的病菌菌碟1片，在距菌碟邊緣兩側(cè)20 mm處用直徑7 mm的無(wú)菌打孔器打孔(2孔對(duì)稱)，用移液器取100 μL濃縮液注入此小孔中，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，只接病菌菌碟的為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)5個(gè)培養(yǎng)皿。某一對(duì)照長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿時(shí)測(cè)病菌菌落直徑，計(jì)算抑菌率。

1.6 BJ33菌株發(fā)酵濃縮液在不同溫度和不同pH值條件下的抑菌作用

抑菌作用采用打孔法測(cè)定。

1.6.1 不同溫度 接種人參黑斑病菌并注入發(fā)酵濃縮液后放置15，20，25，30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d后測(cè)定病菌菌落直徑，計(jì)算抑菌率。

1.6.2 不同pH 配置自然pH及pH值為5，7，9，11的PDA培養(yǎng)基。接種人參黑斑病菌并注入發(fā)酵濃縮液后在25℃下培養(yǎng)6 d，之后測(cè)人參黑斑病菌菌落直徑，計(jì)算抑菌率。

1.7 BJ33菌株發(fā)酵濃縮液的穩(wěn)定性用打孔法測(cè)定發(fā)酵濃縮液的抑菌活性(見(jiàn)1.5.2)。

1.7.1 對(duì)熱的穩(wěn)定性 分別取5 mL發(fā)酵濃縮液在100℃水浴鍋中分別處理30，60，90 min和121℃高壓滅菌30 min，以未處理的發(fā)酵濃縮液為對(duì)照，測(cè)定其抑菌活性。

1.7.2 對(duì)紫外線的穩(wěn)定性 取5 mL發(fā)酵濃縮液放在培養(yǎng)皿中，置于超凈工作臺(tái)上，打開(kāi)紫外燈(18 W)，樣品與紫外燈距離為45 cm，分別照射8，16，24 h，以未經(jīng)紫外線照射的發(fā)酵濃縮液為對(duì)照，測(cè)其抑菌活性。

1.7.3 對(duì)蛋白酶的穩(wěn)定性 配制2 μg/mL胃蛋白酶、蛋白酶 K、胰蛋白酶水溶液，取5 mL與拮抗細(xì)菌發(fā)酵濃縮液1∶1混合，對(duì)照加蒸餾水。蛋白酶處理的pH調(diào)節(jié)至3，其他調(diào)節(jié)至pH 7，在37℃下反應(yīng)1 h后60℃水浴。冷卻后將胃蛋白酶處理調(diào)節(jié)至pH7，并將所有處理定容至同一體積后測(cè)抑菌活性。

1.8 抑菌作用的顯微觀察 將BJ33菌株與人參黑斑病菌接種在PDA平板對(duì)峙培養(yǎng)，25℃培養(yǎng)5～6 d，顯微鏡下觀察人參黑斑病菌菌絲生長(zhǎng)受抑制部位的變化并拍攝照片。

2 結(jié)果與分析

2.1 人參黑斑病生防用內(nèi)生拮抗菌的分離及篩選不同植物組織內(nèi)分離到的拮抗細(xì)菌數(shù)目見(jiàn)表1。從供式5種材料中均分離到了內(nèi)生菌和內(nèi)生拮抗菌，總共分離到82株內(nèi)生細(xì)菌菌株，其中55株為拮抗細(xì)菌。人參根中的內(nèi)生菌(含拮抗菌)菌株數(shù)最多，其次為山芍藥中的內(nèi)生細(xì)菌(含內(nèi)生拮抗細(xì)菌)菌株數(shù)。

表1 不同植物組織內(nèi)分離到拮抗菌數(shù)目

分離到的55株拮抗菌中5株對(duì)人參黑斑病菌菌絲生長(zhǎng)的抑菌率50%以上(見(jiàn)表2)。其中BJ33菌株的抑菌率最高，達(dá)到了80%;其次為BJ59和BJ68，其抑菌率為60%和59.17%。

表2 5株拮抗菌菌株對(duì)人參黑斑病菌的抑菌作用

2.2 拮抗細(xì)菌BJ33的形態(tài)觀察及生理生化特性BJ33菌株呈桿狀、革蘭氏染色陽(yáng)性、產(chǎn)芽孢，芽孢中生或近中生、孢囊膨大不明顯、有運(yùn)動(dòng)性。在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h后形成圓形邊緣不規(guī)則的扁平狀菌落，表面粘稠無(wú)褶皺，不透明，而其在水溶液中培養(yǎng)，有菌膜、沉淀產(chǎn)生，溶液變渾濁。

BJ33菌株的接觸酶反應(yīng)為陽(yáng)性;能在pH為5.7、含鹽量為10%的有氧環(huán)境中生長(zhǎng)，不能在厭氧環(huán)境中生長(zhǎng);氧化發(fā)酵試驗(yàn)產(chǎn)酸不產(chǎn)氣;V-P試驗(yàn)為陽(yáng)性;能水解明膠和淀粉;能利用檸檬酸鹽但不能利用丙酸鹽。

2.3 BJ33菌株的16S rDNA序列及系統(tǒng)發(fā)育分析在NCBI Genbank上進(jìn)行的16S rDNA序列分析結(jié)果表明，BJ33菌株屬于芽孢桿菌屬Bacillus;與BJ33菌株16S rDNA序列(GenBank登錄號(hào)為KF964025)同源性超過(guò)99%的菌株有104個(gè)。其中，有10個(gè)菌株(GenBank登錄號(hào)分別為 HM107808，JQ062537，HQ844503，KF482859，JQ229807，JQ062537，HM107807，KC441776，KC441756 和 JQ308548 等)與BJ33在16S rDNA序列上的同源性都達(dá)到99.9%，BLAST得分在4643和4651之間，E-value均為0;這10個(gè)菌株中，除JQ308548為枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis外，均為解淀粉芽孢桿菌(見(jiàn)圖1和表3)。從發(fā)育樹(shù)上看，BJ33與解淀粉芽孢桿菌Strain 15(B.amyloliquefaciens)(GenBank登 錄 號(hào):HM107808)和解淀粉芽孢桿菌 Strain D8(B.amyloliquefaciens)(GenBank登錄號(hào):KC441756)的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最近;不過(guò)，這兩個(gè)菌株與BJ33的16S rDNA序列BLAST得分(Max Score分別為2643和2647)并非最高;在所有與BJ33在16S rDNA序列同源性分析中BLAST得分最高(Max Score為4651)的為解淀粉芽孢桿菌Strain S2QPS11(B.amyloliquefaciens)GenBank登錄號(hào):HQ844503.1)。根據(jù)16S rDNA序列同源性分析、系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，結(jié)合菌株形態(tài)學(xué)及培養(yǎng)特征，初步將菌株BJ33鑒定為解淀粉芽孢桿菌B.amyloliquefaciens。

圖1 BJ33菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

表3 BJ33與20個(gè)菌(株)的16S rDNA序列一致性

2.4 BJ33菌株及其發(fā)酵濃縮液對(duì)6種植物病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用 BJ33菌株與6種植物病原菌的室內(nèi)對(duì)峙培養(yǎng)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 BJ33菌株對(duì)6種植物病原菌的抑菌效果

BJ33菌株對(duì)供試6種植物病原菌均具有較強(qiáng)的抑菌活性，其中對(duì)人參黑斑病菌和楊樹(shù)爛皮病菌的抑菌活性最強(qiáng)，其抑菌率為80%和79.6%;其次對(duì)水稻紋枯病菌的抑菌作用，其抑菌率為68.1%;再次為對(duì)人參灰霉病菌的抑菌活性，其抑菌率58.30%。從抑菌帶的寬度上看，BJ33菌株對(duì)楊樹(shù)爛皮病菌的最寬，為7.3 mm;其次為對(duì)人參銹腐病菌的，為5.4 mm;再次為人參灰霉病菌和人參黑斑病菌的，分別為4.0 mm和3.5 mm。

BJ33菌株發(fā)酵濃縮液與6種植物病原菌的室內(nèi)對(duì)峙培養(yǎng)結(jié)果見(jiàn)表5。BJ33菌株的發(fā)酵濃縮液對(duì)供試的6種植物病原菌均具有較強(qiáng)的抑菌作用，其中對(duì)人參黑斑病菌的抑菌作用最強(qiáng)，其抑菌率為76.19%;對(duì)人參銹腐病菌的抑菌活性為68.18%。說(shuō)明BJ33菌株及發(fā)酵濃縮液具有較寬的抑菌譜。

表5 BJ33菌株發(fā)酵濃縮液對(duì)6種植物病菌的抑菌效果

2.5 BJ33菌株發(fā)酵濃縮液在不同溫度和pH值條件下對(duì)人參黑斑病菌菌絲生長(zhǎng)的抑菌作用

2.5.1 不同溫度 表6可見(jiàn)，BJ33菌株發(fā)酵濃縮液在15～35℃對(duì)人參黑斑病菌具有較強(qiáng)的抑菌作用，其中25℃時(shí)對(duì)黑斑病菌菌絲生長(zhǎng)抑菌作用最強(qiáng)，但在20～35℃抑菌率差異不大，均在70%以上，說(shuō)明發(fā)酵濃縮液在20～35℃均具有較強(qiáng)的抑菌活性。

表6 不同溫度下BJ33發(fā)酵濃縮液對(duì)人參黑斑病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

2.5.2 不同pH 表7可見(jiàn)，BJ33菌株發(fā)酵濃縮液在pH5～11均具有較強(qiáng)抑菌活性，其抑菌率均在60%以上，其中pH 7的條件下抑菌作用最強(qiáng)。說(shuō)明BJ33菌株發(fā)酵濃縮液在pH 7左右的中性條件下抑菌活性強(qiáng)。

表7 不同pH值下BJ33發(fā)酵濃縮液對(duì)人參黑斑病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

2.6 BJ33發(fā)酵濃縮液的穩(wěn)定性

2.6.1 對(duì)熱的穩(wěn)定性 表8可見(jiàn)，BJ33發(fā)酵濃縮液在100℃恒溫水浴60 min與未經(jīng)熱處理的對(duì)照之間抑菌活性沒(méi)有顯著差異，但100℃恒溫水浴90 min后抑菌效果下降5.95%，而經(jīng)過(guò)121℃高壓滅菌30 min后抑菌率下降19.51%。說(shuō)明BJ33發(fā)酵濃縮液中不僅含有耐高溫的抑菌物質(zhì)，還含有不耐高溫高壓抗菌活性物質(zhì)。

2.6.2 對(duì)紫外線的穩(wěn)定性 表9中可見(jiàn)，將發(fā)酵濃縮液在紫外線照射16 h與對(duì)照之間沒(méi)有顯著性差異，紫外線照射24 h后抑菌率雖有輕微的降低，但只下降了3.28%。說(shuō)明BJ33發(fā)酵濃縮液中抑菌物質(zhì)對(duì)紫外線照射不敏感。

表8 不同溫度處理對(duì)BJ33菌株發(fā)酵濃縮液抑菌活性的影響

表9 紫外燈不同照射時(shí)間對(duì)BJ33菌株發(fā)酵濃縮液抑菌活性的影響

2.6.3 對(duì)蛋白酶的穩(wěn)定性 表10中可見(jiàn)，用胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K處理的BJ33菌株發(fā)酵濃縮液對(duì)人參黑斑病菌菌絲生長(zhǎng)抑制作用無(wú)明顯差異，其抑菌率分別降低了1.9%，4.31%和2.59%。說(shuō)明BJ33菌株發(fā)酵濃縮液對(duì)1 mg/mL濃度的胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K不敏感。

表10 蛋白酶處理對(duì)BJ33菌株發(fā)酵濃縮液抑菌活性的影響

2.7 顯微鏡下BJ33菌株對(duì)人參黑斑病菌的抑菌作用 人參黑斑病菌和BJ33菌株對(duì)峙培養(yǎng)5～6 d后，病菌菌落生長(zhǎng)受到明顯抑制的部位用肉眼觀察，菌絲顏色比正常菌落邊緣的菌絲顏色要深;用光學(xué)顯微鏡觀察，人參黑斑病菌菌絲畸形，如細(xì)胞膨大、直徑變寬、長(zhǎng)度變短，呈念珠狀，有些細(xì)胞顏色比較深，并且未發(fā)現(xiàn)分生孢子(見(jiàn)圖2)。

圖2 人參黑斑病菌正常菌絲(A)和BJ33處理過(guò)的菌絲(B)對(duì)比(1000×)

3 討論

內(nèi)生菌是指一類在其部分或全部生活史中存活于健康植物組織內(nèi)部、不使宿主植物表現(xiàn)出明顯感染癥狀的微生物。植物內(nèi)生菌包括內(nèi)生真菌和內(nèi)生細(xì)菌[15］。內(nèi)生菌在植物體內(nèi)廣泛存在，分布于植物的葉鞘、葉片、花、莖、果實(shí)和種子等器官、組織的細(xì)胞或細(xì)胞間隙中。對(duì)植物內(nèi)生菌的研究始于19世紀(jì)中葉，在地球已知的多數(shù)高等植物中，每個(gè)物種都與多種內(nèi)生菌共生[16］，說(shuō)明了內(nèi)生菌的普遍性。本試驗(yàn)中選用的5種在長(zhǎng)白山地區(qū)藥用植物組織中也都分離到了多種內(nèi)生菌的內(nèi)生拮抗細(xì)菌，其中人參根中分離到的BJ33菌株對(duì)人參黑斑病菌具有很強(qiáng)的抑菌活性。通過(guò)形態(tài)特性觀察、生理生化試驗(yàn)以及16S rDNA測(cè)序和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析，BJ33菌株初步鑒定為解淀粉芽孢桿菌。

解淀粉芽孢桿菌在自然界中分布十分廣泛，同時(shí)能夠?qū)Χ喾N真菌與細(xì)菌產(chǎn)生抑制作用，并且具有豐富的自身代謝產(chǎn)物[17－18］。研究BJ33菌株及發(fā)酵濃縮液的抑菌譜，對(duì)供試6種植物病原菌均具有較強(qiáng)抑菌活性，其中BJ33菌株對(duì)人參黑斑病菌和楊樹(shù)爛皮病菌的抑菌活性最強(qiáng)，其抑菌率為80%和79.6%;對(duì)比其他5種病菌，BJ33菌株發(fā)酵濃縮液對(duì)人參黑斑病菌的抑菌作用最強(qiáng)。

本試驗(yàn)中BJ33菌株發(fā)酵濃縮液在不同溫度和不同pH值下均能維持較好的抑菌效果，同時(shí)BJ33發(fā)酵濃縮液經(jīng)過(guò)熱處理、紫外線照射、蛋白酶處理后，抑菌效果基本穩(wěn)定，說(shuō)明BJ33發(fā)酵濃縮液具有良好穩(wěn)定性。這與劉俏[19］、金海強(qiáng)[20］等關(guān)于解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液的研究基本吻合。

另外，BJ33菌株的抗菌活性物質(zhì)的分離提純及鑒定、田間病害防治中的應(yīng)用方法以及防效等，有待進(jìn)一步研究。

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