泰國巨竹試管快繁研究

周玲，王曉芹，林新春

（浙江農(nóng)林大學(xué)亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，浙江臨安 311300）

泰國巨竹試管快繁研究

周玲，王曉芹，林新春

（浙江農(nóng)林大學(xué)亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，浙江臨安 311300）

以泰國巨竹Gigantochloatekserah成熟種胚為材料，研究不同激素組合對泰國巨竹叢生芽增殖及生根的影響，建立其試管繁殖體系。結(jié)果表明：泰國巨竹叢生芽的最佳增殖培養(yǎng)基為MS（Murashige and Skoog）+3mg·L-1BA（6-芐基腺嘌呤）+0.01mg·L-1TDZ（噻苯?。?0.3mg·L-1NAA（萘乙酸），增殖系數(shù)為2.11，芽叢生長旺盛；最優(yōu)生根培養(yǎng)基為1/2MS+3.0 mg·L-1IBA（吲哚丁酸），生根率達70%，根系發(fā)達、粗壯；試管苗移栽至等配比的泥炭、蛭石、珍珠巖的基質(zhì)中，成活率達100%。圖1表2參8

植物學(xué)；泰國巨竹；組織培養(yǎng)；叢生芽；植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)

泰國巨竹Gigantochloatekserah屬禾本科Poaceae竹亞科Bambusoideae巨竹屬Gigantochloa，主產(chǎn)東南亞及南亞次大陸，多生于熱帶雨林中，中國主要分布于云南地區(qū)。泰國巨竹竹竿高大直立，竹材用途廣，竹筍營養(yǎng)豐富，是筍材兩用竹種［1］。竹類植物的組織培養(yǎng)起步于1968年，迄今已對剛竹屬Phyllostachys，牡竹屬Dendrocalamus，箬竹屬Indocalamus等20余屬70多個竹種進行了愈合組織誘導(dǎo)、微體繁殖等研究［2］，未見泰國巨竹的組織培養(yǎng)方面的報道。本研究通過探索不同植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)組合對泰國巨竹試管快繁的影響，成功建立了其組織培養(yǎng)體系，能夠?qū)崿F(xiàn)方便地將基因?qū)胄枰牧嫉闹褡硬牧现?，進行遺傳轉(zhuǎn)化得到竹子新品種。同時，試管苗免受季節(jié)限制，可以根據(jù)科研者的需要隨時進行取材，為科學(xué)研究提供實驗材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

泰國巨竹成熟種子采自云南省。種子乳白色，長圓形，千粒質(zhì)量為71.2 g，大小如圖1A。

圖1 泰國巨竹的試管快速繁殖Figure 1 In vitro rapid propagation of Gigantochloa tekserah

1.2 試驗方法

1.2.1 無菌苗的獲得將泰國巨竹的種子在自來水下沖洗12 h左右，用體積分?jǐn)?shù)約2.5%的次氯酸鈉（NaClO）溶液真空抽濾20min，無菌水沖洗5～6次，在超凈工作臺上體視顯微鏡（OLYMPUSSZ61）下剝離種胚，于MS培養(yǎng)基中進行叢生芽增殖培養(yǎng)。約4周后分化出芽，從而獲得泰國巨竹的無菌苗。將誘導(dǎo)出的長勢一致的芽作為增殖試驗的材料。

1.2.2 增殖培養(yǎng)基本培養(yǎng)基為MS（Murashige and Skoog）培養(yǎng)基，同時添加30 g·L-1蔗糖和8 g·L-1A型瓊脂，pH 5.7，并設(shè)計了BA（6-芐基腺嘌呤）質(zhì)量濃度（1.0，3.0，10.0 mg·L-1），TDZ（噻苯?。┵|(zhì)量濃度（0，0.001，0.010 mg·L-1），KT（激動素）質(zhì)量濃度（0，0.3，1.0 mg·L-1）和NAA質(zhì)量濃度（0，0.3，1.0 mg·L-1）的4因素3水平正交試驗。試驗材料選擇高度約3 cm叢生芽，3個·從-1，1叢·管-1，20管·處理-1。1月后，觀察芽的生長情況。

1.2.3 生根選取增殖良好的長勢一致的叢生芽接種于生根培養(yǎng)基中：1/2 MS+IBA（吲哚丁酸）（0，1.0，3.0，10.0 mg·L-1），共4個處理，20管·處理-1。1月后，觀察泰國巨竹生根狀況。

1.2.4 練苗與移栽泰國巨竹在根長4～5 cm左右時放在馴化室強光下（20 000 lx）煉苗1周，之后取出試管苗用溫水（30℃左右）洗凈根部殘余的培養(yǎng)基后，移栽于泥炭、蛭石、珍珠巖的混合基質(zhì)中并套袋，7 d左右后開始剪袋，15 d左右完全脫袋。期間進行養(yǎng)護管理，1個月后統(tǒng)計移栽成活率。

1.2.5 培養(yǎng)條件與統(tǒng)計分析培養(yǎng)室溫度為（25±2）℃，光照強度2 400 lx，光照時間16 h·d-1。運用SPSS 17.0與DPS 9.50進行數(shù)據(jù)分析，方差分析采用Duncan法。增殖系數(shù)=新生總芽數(shù)/接種芽數(shù)；試管苗根誘導(dǎo)率=（誘導(dǎo)出根的試管苗/試管苗總數(shù)）×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對泰國巨竹叢生芽增殖的影響

不同植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)組合對泰國巨竹芽的增殖產(chǎn)生不同的影響。由R值可看出：BA在芽增殖中作用最大（0.60），KT作用最?。?.02）。由表1可見：當(dāng)BA質(zhì)量濃度從1.0mg·L-1增加到3.0mg·L-1時，芽增殖系數(shù)升高，但當(dāng)增加到10.0 mg·L-1時，增殖系數(shù)下降；KT的添加對芽增殖效果不顯著，但隨著KT的質(zhì)量濃度增大，芽褐化較嚴(yán)重，葉片發(fā)黃；NAA的添加亦是隨著質(zhì)量濃度的增加，增殖系數(shù)先升高后下降，在質(zhì)量濃度為0.3 mg·L-1時，芽生長良好，綠色、健壯；隨著TDZ的質(zhì)量濃度升高，芽的增殖系數(shù)呈先升高后降低的趨勢。綜上所述，處理6時，芽的增殖系數(shù)為2.21，與其他處理差異顯著，芽生長健壯、葉片鮮綠，幾乎沒有褐化，為最適合的培養(yǎng)基，即泰國巨竹的最佳增殖培養(yǎng)基為MS+3.0 mg·L-1BA+0.010 mg·L-1TDZ+ 0.3mg·L-1NAA。

2.2 IBA對泰國巨竹生根誘導(dǎo)的影響

泰國巨竹的生根狀況受IBA濃度的影響（表2），在沒有添加IBA的1/2 MS培養(yǎng)基中，只有2管生根，且根纖細(xì)，根數(shù)1～2條；IBA質(zhì)量濃度為1.0 mg·L-1時，生根率升高，但根仍纖細(xì)，較短。IBA質(zhì)量濃度為3.0 mg·L-1時，生根率達到最大，為70%，生根數(shù)為10條，根較粗壯，植株生長良好（圖1C）。但是，在添加10.0 mg·L-1IBA的培養(yǎng)基中所誘導(dǎo)出的根粗短、基部膨大，為畸形根，且植株發(fā)黃，易褐化，長勢較差。綜上所述，泰國巨竹最優(yōu)生根培養(yǎng)基為1/2MS+3.0 mg·L-1IBA。

2.3 移栽

將生根的泰國巨竹組培苗在強光下練苗1周，移栽于等配制比的泥炭、蛭石、珍珠巖的混合基質(zhì)中，期間進行觀察、澆水等養(yǎng)護管理，1個月后苗成活率達100%（圖1D）。

表1 不同植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)處理的泰國巨竹叢生芽增殖情況Table 1 Circumstances of different plant growth regulators on budsmultiplication of Gigantochloa tekserah

表2 不同質(zhì)量濃度IBA處理的泰國巨竹誘導(dǎo)生根情況Table 2 Circumstances of different concentrations of IBA on roots induction ofGigantochloa tekserah

3 結(jié)論與討論

一般認(rèn)為內(nèi)源激素的平衡決定植物器官分化的傾向，外源激素則通過改變內(nèi)源激素平衡從而產(chǎn)生作用。為了讓內(nèi)源細(xì)胞分裂素和生長素達到一定平衡，外加的細(xì)胞分裂素以及生長素必須達到一定的質(zhì)量濃度和比例，才能使器官分化達到預(yù)期目的［3-4］。細(xì)胞分裂素可有效地促進芽的萌發(fā)與不定芽增殖，較低濃度的生長素促進莖的伸長生長。本研究運用正交試驗討論了BA，TDZ，KT，NAA的組合對泰國巨竹試管繁殖的影響。在一定范圍內(nèi)，高質(zhì)量濃度的BA能夠促進植株的增殖；BA的質(zhì)量濃度愈大，對增殖的影響會越明顯。但當(dāng)質(zhì)量濃度為10mg·L-1時，芽易褐化，葉片發(fā)黃，生長不健康。較低質(zhì)量濃度的BA既能在一定程度上促進增殖，但效果不明顯。這與卓仁英［5］的研究結(jié)果一致，即當(dāng)BA質(zhì)量濃度過高時可能會對竹類植物生長有一定的抑制或毒害作用。TDZ在植物組織培養(yǎng)中可以獨立使用，或者與其他植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)共同使用，實現(xiàn)對植物細(xì)胞的誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)作用，具有很強的促進細(xì)胞分裂的活性，能夠高效誘導(dǎo)離體材料的再生生長。但若濃度過高則會抑制生長，導(dǎo)致苗過細(xì)、偏黃、生長狀況差。陳意涵等［6］、張鐵等［7］和張桂和［8］對花稈綠竹Bambusaosdhamif.striata及麻竹Dendrocalamnslatiflorus等研究發(fā)現(xiàn)，TDZ活性明顯優(yōu)于BA，添加一定質(zhì)量濃度的TDZ芽的增殖系數(shù)顯著增加。本實驗中選取添加0.01mg·L-1TDZ的處理，增殖系數(shù)為2.11，苗長勢良好，對泰國巨竹植株的增殖生長和伸長生長最有利，為最適合質(zhì)量濃度。通過泰國巨竹叢芽誘導(dǎo)實驗發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中添加KT對泰國巨竹的芽增殖生長沒有太大意義，這與王曙光等［9］的研究結(jié)果一致。一般研究認(rèn)為，在試管快速繁殖中，添加一定質(zhì)量濃度的生長素更有利于誘導(dǎo)生根［10］。本實驗中，泰國巨竹在未添加植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的1/2 MS中誘導(dǎo)的根數(shù)量少，較纖細(xì)，對于移栽成活不利［6，11］。在培養(yǎng)基中添加3mg·L-1IBA時，試管苗生根率最高，根粗壯、發(fā)達，生長最好。但質(zhì)量濃度過高10 mg·L-1時，所誘導(dǎo)的根基部膨大、較短，為畸形根，植株長勢較差，易褐化，這與劉倩倩等［11］的研究結(jié)果相同。練苗移栽在試管快繁技術(shù)中是很重要的一環(huán)，練苗是否過關(guān)直接限制了工廠化育苗能否成功運行。同時，練苗成活率直接影響繁殖系數(shù)，最終影響商業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模。本實驗將生根的泰國巨竹組培苗在強光下練苗1周，移栽于等配制比的泥炭、蛭石、珍珠巖的混合基質(zhì)中，成活率達100%。

本研究利用正交實驗研究了泰國巨竹芽的增殖狀況，之后進行生根誘導(dǎo)，從而成功獲得完整植株，對于其他巨竹屬的組織培養(yǎng)研究具有一定參考性。竹子種子很難獲得，且通過種胚快繁產(chǎn)生幼苗的變異性較大，優(yōu)良性狀難以保持。采用變異性小的幼枝節(jié)段進行快速繁殖，還需進一步研究。

［1］耿伯介，王正平.中國植物志：第9卷第1分冊［M］.北京：科學(xué)出版社，1996：434-435.

［2］張春霞，謝寅峰，張幼法，等.竹子組織培養(yǎng)研究的進展及應(yīng)用前景［J］.竹子研究匯刊，1999，18（3）：46-49.

ZHANG Chunxia，XIE Yinfeng，ZHANG Youfa，etal.The current advance of bamboo tissue culture and its prospective［J］.JBambooRes，1999，18（3）：46-49.

［3］楊南，李福秀，普曉蘭，等.竹類植物育苗技術(shù)的研究進展［J］.竹子研究匯刊，2008，27（3）：37-41.

YANG Nan，LIFuxiu，PU Xiaolan，etal.Advances in bamboo breeding technology［J］.JBambooRes，2008，27（3）：37-41.

［4］謝利娟，韓蕾，錢永強，等.爆仗竹組培快繁6-BA與NAA組合濃度配比優(yōu)化分析［J］.核農(nóng)學(xué)報，2005，19（3）：181-185.

XIE Lijuan，HAN Lei，QIAN Yongqiang，etal.Optimization of the concentration of 6-BA and NAA in the rapid propagation of Russelia equisetiformis［J］.ActaAgricNuclSin，2005，19（3）：181-185.

［5］卓仁英.竹子生物技術(shù)育種研究進展［J］.浙江林學(xué)院學(xué)報，2003，20（4）：424-428. ZHUORenying.Advances of bamboomolecular breeding［J］.JZhejiangForColl，2003，20（4）：424-428.

［6］陳懿涵，桂仁意，林新春，等.花稈綠竹試管快速繁殖［J］.浙江林學(xué)院學(xué)報，2008，25（3）：397-400.

CHEN Yihan，GUIRenyi，LIN Xinchun，etal.Micropropagation ofBambusaoldhamif.striataby tissue culture［J］.JZhejiangForColl，2008，25（3）：397-400.

［7］張鐵，萬京.勃氏甜龍竹的組培快繁［J］.云南民族大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2004，13（3）：203-206.

ZHANG Tie，WAN Jing.The organizationl culture and quick proliferate propation ofDendrocalamusbrandisi［J］.J YunnanMinzuUnivNatSciEd，2004，13（3）：203-206.

［8］張桂和.麻竹莖尖培養(yǎng)及離體快繁研究［J］.海南大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，1997，15（4）：298-303.

ZHANGGuihe.Studies on shoot-tip culture and in-vitro propagation ofDendrocalamuslatiflorus［J］.NatSciJHainan Univ，1997，15（4）：298-303.

［9］王曙光，丁雨龍，林樹燕，等.慈竹組織培養(yǎng)消毒方法篩選及叢芽誘導(dǎo)研究［J］.西部林業(yè)科學(xué)，2013，42（1）：38-41.

WANG Shuguang，DING Yulong，LIN Shuyan，etal.Optimization of disinfectionmethod forNeosinocalamusaffinisand itsmultiple shoot induction［J］.JWestChinaForSci，2013，42（1）：38-41.

［10］HUANG LC，MURASHIGE T.Tissue culture investigations ofBambusa，PhyllostachysandSasa［J］.BotBullA-cadSin，1983，24：31-52.

［11］張有珍，劉倩倩，何冬冬，等.鋪地竹試管快速繁殖研究［J］.浙江農(nóng)林大學(xué)學(xué)報，2012，29（1）：151-154.

ZHANG Youzhen，LIU Qianqian，HE Dongdong，etal.In vitro micropropagation ofSasaargenteastriatus［J］.JZhegjiangA&FUniv，2012，29（1）：151-154.

In vitromicropropagation of Gigantochloa tekserah

ZHOU Ling，WANG Xiaoqin，LIN Xinchun
（The Nurturing Station for the State Key Laboratory of Subtropical Silviculture，Zhejiang A&F University，Lin'an 311300，Zhejiang，China）

To establish a tissue culture system for commercial propagation，buds induced by mature embryos were used as explants to study the effect of different hormone combinations on bud multiplication and root induction ofGigantochloatekserah.Results showed that for budmultiplication，since the highest proliferation coefficientwas 2.11 and cluster buds grew well，Murashige and Skoog's（MS）medium supplemented with 3mg· L-16-benzylaminopurine（BA），0.01 mg·L-1thidiazuron（TDZ），and 0.3 mg·L-11-naphthylacetic acid（NAA）was the optimalmedium.The best rootingmedium was 1/2 MS supplemented with 3 mg·L-1indole-3-butyric acid（IBA）because of the rooting rate was up to 70%with long，thick roots.After transferring to an equal ratio mixture of peat，vermiculite，and perlite，the survival rate of hardening plantletswas 100%.［Ch，1 fig.2 tab.8 ref.］

botany；Gigantochloatekserah；tissue culture；clustered shoots；plant growth regulator

S723.1

A

2095-0756（2014）05-0817-04

2013-10-18；

2013-12-05

國家自然科學(xué)基金資助項目（31270677）；“十二五”浙江省農(nóng)業(yè)新品種選育“竹木育種協(xié)作組”課題（2012C12908-3）；浙江省自然科學(xué)基金重點資助項目（Z3100366）；浙江省優(yōu)先主題重點農(nóng)業(yè)項目（2010C12011）

周玲，從事林木生物技術(shù)與種質(zhì)創(chuàng)新研究。E-mail：848449187@qq.com。通信作者：林新春，教授，博士，博士生導(dǎo)師，從事竹林培育與利用研究。E-mail：lxc@zafu.edu.cn