大孔吸附樹脂純化蒺藜呋甾皂苷和總黃酮工藝研究

劉李梅，楊 明，郭志燁，梅 明，韓 麗，鄒文銓

(1.成都中醫(yī)藥大學，四川 成都，611137；2.江西中醫(yī)藥大學，江西 南昌 330004；3.四川大學，四川 成都 610064)

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大孔吸附樹脂純化蒺藜呋甾皂苷和總黃酮工藝研究

劉李梅1，楊 明2*，郭志燁1，梅 明1，韓 麗1，鄒文銓3

(1.成都中醫(yī)藥大學，四川 成都，611137；2.江西中醫(yī)藥大學，江西 南昌 330004；3.四川大學，四川 成都 610064)

目的：研究大孔吸附樹脂純化蒺藜呋甾皂苷、總黃酮的工藝條件。方法：以蒺藜呋甾皂苷、總黃酮含量及其轉(zhuǎn)移率為指標，采用單因素試驗法，優(yōu)選樹脂富集純化蒺藜呋甾皂苷和總黃酮的最佳工藝。結(jié)果：純化最優(yōu)工藝條件：上樣量為0.4g/mL，樹脂徑高比為1∶8，4BV水以2mL/min流速洗脫，分別用5BV50%乙醇、2BV/h 70%乙醇洗脫。D101樹脂純化后蒺藜呋甾皂苷純度由22.59%提高到53.54%，增加了1.37倍；總黃酮的純度由12.46%提高到32.11%，增加了1.58倍。結(jié)論：D101大孔吸附樹脂可用于蒺藜呋甾皂苷和總黃酮的純化。

大孔吸附樹脂；蒺藜；呋甾皂苷；總黃酮；純化工藝

蒺藜為蒺藜科植物蒺藜的干燥成熟果實，具有平肝、活血祛風、明目、止癢之功效，用于治療頭痛眩暈、乳閉乳癰、目赤黯障、風疹瘙癢等癥。蒺藜化學成分復雜，有關(guān)文獻報道其主要藥效成分為皂苷類物質(zhì)，黃酮類次之?，F(xiàn)代藥理及臨床研究表明，蒺藜呋甾皂苷[1]具有改善心腦血管循環(huán)、降低血液黏度的作用，用于緩解心血疲阻所致的胸痹、冠心病、心絞痛、胸悶等癥；蒺藜黃酮類物質(zhì)具有抗氧化作用。大孔吸附樹脂對于皂苷和黃酮類化合物都是比較理想的吸附劑，但迄今為止，尚未見對蒺藜皂苷和黃酮類成分同時純化的報道。本文采用大孔吸附樹脂以呋甾皂苷和總黃酮為指標對蒺藜進行富集純化，通過對樹脂富集純化蒺藜工藝條件與參數(shù)的考察，確立純化工藝進而為蒺藜制劑的研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

TU-1810紫外可見分光光度計、BP211DAG電子分析天平、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-2000B(上海亞榮生化儀器廠)、ZHWY-110X型水浴恒溫搖床(上海智城分析儀器有限公司)；蒺藜飲片(四川科倫天然藥業(yè)有限公司，批號：131001a)經(jīng)成都中醫(yī)藥大學生藥教研室盧先明教授鑒定為蒺藜干燥成熟果實；AB-8型大孔吸附樹脂(南開大學化工廠，批號：030605)，D101型、HPD-100型大孔吸附樹脂(成都市科龍化工試劑廠，批號：20120305、批號：20130105)；蘆丁(MUST-13040302)、氯化鈷(成都市科龍化工試劑廠，批號：20130807)，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 蒺藜呋甾皂苷、總黃酮含量測定方法

2.1.1 呋甾皂苷含量測定[2]方法 準確稱取氯化鈷0.6g，加水溶解定容于25mL容量瓶中，搖勻，作為對照品溶液。精密吸取待測溶液適量，加入5mL改良對二甲氨基苯甲醛溶液，58℃保溫2h，取出，冰水浴中放置2min，取出置室溫放置5min，冷卻至室溫。以甲醇代替樣品溶液，同法處理得到的溶液作空白。照分光光度法(附錄ⅤB)，于515nm波長處測定吸收度。精密吸取氯化鈷溶液，以水作空白于515nm波長處測定吸收度，計算含量。

2.1.2 蒺藜總黃酮含量測定[3]方法 精密稱定蘆丁對照品 5.25mg，甲醇溶解定容于5mL容量瓶中，搖勻，作為對照品溶液。精密吸取對照品溶液、樣品溶液適量，加5%NaNO2溶液0.5mL，放置6min，加入10% Al(NO3)3溶液0.5mL，放置6min，加入4%NaOH溶液5mL，最后加水至刻度，放置15min，在508nm波長處測定其吸光度值。

2.1.3 蒺藜呋甾皂苷和總黃酮標準曲線繪制 呋甾皂苷標準曲線：準確稱取氯化鈷0.9246g，加水溶解定容于25mL容量瓶，搖勻作為母液，相當于36.984mg/mL。精密吸取此液2、3、4、6mL母液，分別用水稀釋定容于10mL容量瓶中，備用。以母液、上述稀釋液、水(空白)分別在紫外分光光度計515nm處測定其吸光度值。以吸光度值A(chǔ)為縱坐標，氯化鈷濃度C(mg/mL)為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為Y=0.02X(r=0.9999)。結(jié)果表明，在7.3968～36.9840mg/mL范圍內(nèi)，吸光度與濃度呈良好線性關(guān)系。

總黃酮標準曲線：精密稱取蘆丁對照品5.25mg，甲醇溶解定容于5mL容量瓶，搖勻作為母液，相當于1.05mg/mL。精密吸取母液稀釋0.4倍溶液(相當于0.42 mg/mL)0.3、0.5、0.8、1、1.5、1.7mL分別置于10mL試管內(nèi)，加5%NaNO2溶液0.5mL，放置6min，加10% Al(NO3)3溶液0.5mL，放置6min，加入4% NaOH溶液5mL，最后用水稀釋至刻度，放置15min，于508nm波長處測定其吸光度值。以吸光度值A(chǔ)為縱坐標，蘆丁濃度C(μg/mL)為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為：Y=0.0121X(r=0.9993)。結(jié)果表明，黃酮顯色后在12.6～71.4μg/mL范圍內(nèi)，吸光度與濃度呈良好線性關(guān)系。

2.2 大孔吸附樹脂純化工藝研究

2.2.1 樹脂的預處理 95%乙醇浸泡大孔吸附樹脂24h，濕法裝柱，用乙醇沖洗至流出液與水1∶3混合不產(chǎn)生渾濁，再用蒸餾水以2BV/h沖洗至無醇味。用2BV 5%HCl溶液以4BV/h的速度通過樹脂層，并浸泡2h，用蒸餾水洗至中性；再用2BV 5%NaOH溶液以4BV/h的速度通過樹脂層，并浸泡2h，用蒸餾水洗至中性。

2.2.2 上柱供試母液制備 準確稱取蒺藜粗粉500g，加10倍量水浸泡30min，煎煮提取3次，每次90min，濾過合并濾液，離心，常壓濃縮至1.04g/mL，加乙醇使藥液含醇量達60%，密閉，置于4℃冷藏12h，取出抽濾，沉淀加60%乙醇洗滌3次，每次500mL，回收乙醇并定容于500mL容量瓶中，作為上柱供試母液。

2.2.3 不同大孔樹脂型號靜態(tài)篩選 準確稱取經(jīng)預處理過的3種不同型號大孔樹脂各2g(吸干表面水分)，分別加入100mL具塞三角瓶中，分別加入母液經(jīng)稀釋至0.2g /mL供試液75mL，20℃恒溫振搖24 h。待充分吸附，過濾，濾液測定呋甾皂苷含量和總黃酮含量，并計算吸附量、吸附率。再將吸附過濾后得到的3種大孔吸附樹脂置于磨口具塞三角瓶中，加入75mL 70%乙醇溶液，20℃恒溫振搖24 h，使呋甾皂苷、總黃酮解吸，濾過，測定呋甾皂苷含量、總黃酮含量，分別按下式計算吸附量、吸附率、解吸率。結(jié)果見表1。

吸附量= (Co-C1)V1/W

吸附率= (Co-C1)/Co×100%

解析率=C2V2/(Co-C1)V1×100%

式中Co為吸附液初始濃度(mg/mL)；C1為吸附后樣液中剩余的濃度(mg/mL)；C2為洗脫液的質(zhì)量濃度(mg/mL)；V1為吸附液體積(mL)；V2為洗脫液體積(mL)；W：大孔吸附樹脂質(zhì)量(g)。

表1 不同型號大孔吸附樹脂對蒺藜呋甾皂苷

結(jié)果表明，D101、HPD-100大孔吸附樹脂對蒺藜呋甾皂苷和總黃酮的吸附率和解吸率均高于AB-8。擬進一步考察D101、HPD-100大孔吸附樹脂。

2.2.4 不同大孔樹脂型號動態(tài)篩選 精密稱取經(jīng)預處理過的吸干表面水分的D101、HPD-100大孔吸附樹脂各20g，水濕法裝柱，分別吸取同一質(zhì)量濃度的供試液(均相當于16g生藥)，上樣，靜態(tài)吸附30min，以2.5mL/min流速動態(tài)吸附至均勻一致。用蒸餾水以2mL/min流速沖洗至流出液無Molish反應(yīng)。收集洗出液定容，測定蒺藜總皂苷、總黃酮的沖洗量，并計算蒺藜總皂苷、總黃酮的吸附量。將吸附的成分用5BV 70%乙醇以1BV/h洗脫，收集洗脫液定容，測定蒺藜總皂苷含量、總黃酮含量，計算吸附量、動態(tài)解吸率。其結(jié)果見表2。

結(jié)果表明，D101、HPD-100大孔吸附樹脂在吸附量相當?shù)那闆r下，D101大孔吸附樹脂對有效成分的解吸性能略優(yōu)于HPD-100。故選擇D101大孔吸附樹脂富集純化蒺藜呋甾皂苷、總黃酮。

表2 不同型號大孔吸附樹脂對蒺藜呋甾皂苷

2.2.5 工藝條件優(yōu)選 (1)上樣濃度考察。準確稱取預處理過吸干表面水分的D101大孔吸附樹脂4份各25g，水濕法裝柱(d=1.8cm)，分別取母液經(jīng)稀釋的4個不同質(zhì)量濃度0.2、0.4、0.6、0.8 生藥g/mL(均相當于含8g生藥)藥液上樣，靜態(tài)吸附30min，均以2.5mL/min的流速進行動態(tài)吸附，收集流出液定容，測定總皂苷、總黃酮含量并計算其吸附量。結(jié)果見圖1。

圖1 上樣濃度考察結(jié)果

結(jié)果顯示，蒺藜呋甾皂苷吸附量隨上樣藥液質(zhì)量濃度的增大先增加后減小，總黃酮變化不明顯。當上樣濃度為0.4g生藥/mL時吸附量最大，故選質(zhì)量濃度為0.4g /mL上樣。

(2)上樣流速考察。準確稱取預處理過的吸干表面水分的D101大孔吸附樹脂4份各25g，水濕法裝柱(d=1.8cm)，0.4g/mL藥液上樣，靜態(tài)吸附30min，分別以0.5、1、2、3mL/min的流速過柱，收集流出液定容，測定呋甾皂苷和總黃酮含量并計算吸附率。呋甾皂苷吸附率分別為 92.06%、 90.49%、87.13%、 80.31%，總黃酮吸附率分別為 87.71%、84.73%、84.04%、80.19%。上樣流速越小越有利于吸附，但當流速<2mL/min，吸附率隨流速的減小而變化不顯著。上樣流速越小，耗時越長，故上樣流速選擇2mL/min。

(3)徑高比考察。準確稱取適量預處理過的D101大孔吸附樹脂，水濕法裝柱(d=1.8cm)，徑高比分別為1∶8、1∶12、1∶16，水洗至平衡，準確量取0.4g/mL的藥液20mL上樣，靜態(tài)吸附30min，以2mL/min流速過柱，水以2mL/min沖洗至流出液無Molish反應(yīng)，再用3BV 70%乙醇以1BV/h流速洗脫至幾乎無色，收集洗脫液定容，測定總皂苷和總黃酮含量并計算其飽和吸附量。結(jié)果見圖2。

結(jié)果表明，樹脂徑高比對蒺藜呋甾皂苷、總黃酮的吸附量無顯著影響。因此選擇徑高比為1∶8。

圖2 徑高比考察結(jié)果

(4)泄露曲線繪制。取適量預處理過的D101大孔吸附樹脂，水濕法裝柱(d=1.8cm，h=14.4cm)，水洗至平衡，以2mL/min的上樣速度持續(xù)通過D101大孔吸附樹脂柱，每1BV收集1份漏出液，共收集13份，測定漏出液中蒺藜呋甾皂苷含量。以漏出液含量(mg/mL)為縱坐標，吸附液體積(BV)為橫坐標，繪制泄露曲線。結(jié)果見圖3。

圖3 D101大孔吸附樹脂泄露曲線(呋甾皂苷)

結(jié)果顯示：上樣液3BV開始漏出，超過11BV開始大量漏出。 提示，最大上樣體積11BV。

(5)水洗脫用量的選擇。取適量預處理過的D101大孔吸附樹脂水濕法裝柱(d=1.8cm，h=14.4cm)，0.4g /mL的藥液上樣，靜態(tài)吸附30min，以2mL/min流速過柱，用水以2mL/min速度洗脫，每1BV收集1份洗脫液，Molish反應(yīng)檢測水洗脫液的糖類化合物。結(jié)果顯示，水洗脫用量為4BV時無Molish反應(yīng)。

(6)洗脫劑種類考察。取適量預處理過的D101大孔吸附樹脂，水濕法裝柱(d=1.8cm，h=14.4cm)，0.4g/mL藥液上樣，靜態(tài)吸附30min，以2mL/min流速過柱，4BV水以2mL/min洗脫，再分別用30%、50%、70%、90%乙醇各4BV以2mL/min流速洗脫，收集洗脫液，測定總皂苷和總黃酮含量并計算轉(zhuǎn)移率。結(jié)果見圖4。

圖4 洗脫溶劑種類考察結(jié)果

結(jié)果顯示： 50%乙醇洗脫蒺藜呋甾皂苷轉(zhuǎn)移率較高， 70%乙醇洗脫總黃酮轉(zhuǎn)移率較高。故選擇50%、70%乙醇梯度洗脫。

(7)洗脫劑用量考察。取適量預處理過的D101大孔吸附樹脂5份分別水濕法裝柱(d=1.8cm，h=14.4cm)，0.4g/mL的藥液上樣，靜態(tài)吸附30min，以2mL/min流速過柱，4BV水以2mL/min的流速洗脫，分別用2、3、4、5、6BV 50%乙醇、70%乙醇以2mL/min的流速梯度洗脫，收集各洗脫液，測定呋甾皂苷和總黃酮含量并轉(zhuǎn)移率。結(jié)果見圖5。

圖5 洗脫溶劑用量考察結(jié)果

由圖可知：5BV乙醇洗脫時，蒺藜呋甾皂苷、總黃酮的轉(zhuǎn)移率均大于90%以上，再增加洗脫劑用量對其轉(zhuǎn)移率影響不明顯。故洗脫劑用量均選擇5BV。

(8)洗脫流速考察。準確稱取預處理過吸干表面水分的D101大孔吸附樹脂4份各25g，水濕法裝柱，0.4g /mL藥液上樣，靜態(tài)吸附30min，以2mL/min流速過柱，4BV水以2mL/min的流速洗脫，5BV 50%乙醇分別以1 BV/h、2BV/h、3BV/h、4BV/h的流速洗脫，收集洗脫液，測定呋甾皂苷含量并計算轉(zhuǎn)移率。1BV/h、2BV/h、3BV/h、4BV/h的流速洗脫呋甾皂苷轉(zhuǎn)移率分別為84.29%、81.43%、77.12%、63.58%，總黃酮轉(zhuǎn)移率分別為87.41%、80.43%、75.82%、58.74%。綜合考慮，選擇2BV/h流速洗脫。

3 結(jié)語

靜態(tài)、動態(tài)吸附試驗發(fā)現(xiàn)，靜態(tài)吸附量明顯優(yōu)于動態(tài)吸附量?？赡茉颍孩偬崛∫涸跇渲贤Ａ魰r間相對縮短，影響有效成分與樹脂的結(jié)合而降低了吸附效果;②靜態(tài)吸附包括物理、化學吸附，而動態(tài)吸附主要是化學吸附。本實驗未涉及藥液pH值考察，是由于預試實驗結(jié)果表明中性對于吸附較好?；衔锏乃釅A度不同，pH對其吸附的影響不同。蒺藜呋甾皂苷呈中性；黃酮類物質(zhì)含有酚羥基，具有弱酸性。其在酸性條件下以分子狀態(tài)存在，主要以分子間力與樹脂吸附；在堿性條件下，酚羥基離子化，與樹脂的分子間力下降。但是pH較小時，對總黃酮有破壞作用。

筆者對蒺藜醇沉工藝優(yōu)化的結(jié)果：常壓濃縮至生藥濃度1.04g/mL，加乙醇使藥液含醇量達到60%,4℃冷藏12h。呋甾皂苷、總黃酮轉(zhuǎn)移率達到87.84%、83.28%。蒺藜D101樹脂純化工藝：0.4g/mL質(zhì)量濃度上樣，樹脂徑高比1∶8，4BV水以2mL/min的流速洗脫，分別用5BV 50%乙醇、 70%乙醇以2BV/h梯度洗脫。D101樹脂純化后，蒺藜呋甾皂苷純度由22.59%提高到53.54%，提高了1.37倍；總黃酮的純度由12.46%提高到32.11%，提高了1.58倍。本實驗實現(xiàn)了蒺藜呋甾皂苷、總黃酮的同步分離純化，為蒺藜治療心腦血管疾病制劑的研究奠定基礎(chǔ)。

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(責任編輯：魏 曉)

Purification Technology of Furostanol Saponins and Total Flavonoids fromTribulusterrestrisL. by Macroporous Resin

Liu Limei1,Yang Ming2*,Guo Zhiye1, Mei Ming1，Han Li1,Zou Wenquan3

(1.Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137，China；2.Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanchang 330004, China；3.Sichuan University, Chengdu 610064, China)

Objective:To discuss purification technology conditions of furostanol saponins and total flavonoids fromTribulusterrestrisL. by macroporous resin.Methods:With the the content of furostanol saponins and total flavonoids as indexes, purification technology conditions were optimized by single factor experiment. Results:Optimum purification conditions were as follow: concentration of sample liquid was 0.4g/ml, ratio of diameter to height of macroporous resin column was 1∶8, them were eluted by 4BV water at 2mL/min, 5BV 50% and 70% ethanol at 2BV/h respectively. The purity of furostanol saponins reached 53.54%, which was two times higher than that before purification. And the purity of total flavonoids reached 32.11%，which was two times higher than that before purification. Conclusion:D101 Macroporous Resin is suitable for the purification of furostanol saponins and total flavonoids fromTribulusterrestrisL.

Macroporous Resin；TribulusterrestrisL.；Furostanol Saponins；Total Flavonoids; Purification Technology

2014-10-18

劉李梅(1988-)，女，成都中醫(yī)藥大學碩士研究生，研究方向為中藥新技術(shù)、新工藝、新制劑探究。

楊明(1962-)，男，江西中醫(yī)藥大學教授、博士生導師，研究方向為中藥新劑型與新技術(shù)、中藥復方釋藥系統(tǒng)。E-mail: yangming16@126.com。

R284

A

1673-2197(2014)17-0035-04