苯酚-硫酸法測定益肺通絡(luò)顆粒水提液總多糖含量

譚喜平，夏新華*，羅純清，黃 莉, 顏 紅，曾建國，劉艷科

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，湖南 長沙 410208；2.長沙市中心醫(yī)院，湖南 長沙 410004)

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苯酚-硫酸法測定益肺通絡(luò)顆粒水提液總多糖含量

譚喜平1，夏新華1*，羅純清1，黃 莉1, 顏 紅1，曾建國2，劉艷科2

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，湖南 長沙 410208；2.長沙市中心醫(yī)院，湖南 長沙 410004)

目的：建立益肺通絡(luò)顆粒水提液總多糖的含量測定方法。方法：以葡萄糖為對照品，通過單因素試驗(yàn)，優(yōu)選苯酚-硫酸法測定總多糖的最佳顯色條件。結(jié)果：最佳顯色條件為：加 5%苯酚1.0mL,濃硫酸6.0mL,在100℃的條件下反應(yīng)20min，冰水中冷卻至室溫。葡萄糖質(zhì)量在16.6～124μg范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系(r=0.999 1)，平均回收率為100.6%,RSD為2.5%。結(jié)論：該法快速準(zhǔn)確、穩(wěn)定方便，可用于益肺通絡(luò)顆粒工藝研究中總多糖的含量測定。

益肺通絡(luò)顆粒；苯酚-硫酸法；總多糖；含量測定

多糖是由糖苷鍵結(jié)合、超過10個(gè)以上的單糖組成的聚合糖高分子碳水化合物，在自然界分布極廣，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、抗菌、抗肝炎等方面的作用[1-2]。益肺通絡(luò)顆粒是國家“十一五”科技重大專項(xiàng)中醫(yī)藥治療肺結(jié)核臨床科研基地建設(shè)中的自擬處方，由黃精、白及等11味藥組成，常與抗結(jié)核西藥聯(lián)合治療肺結(jié)核，具有益氣養(yǎng)陰、化瘀通絡(luò)、去腐生肌之功效，其中黃精、白及為處方中的君藥，主要活性成分為黃精多糖、白及多糖，具有抗菌、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能作用[3-4]，為處方中的主要活性成分。本研究擬采用苯酚-硫酸法建立該處方總多糖的含量測定方法[5-7]，以加強(qiáng)該制劑的工藝研究與質(zhì)量控制，為進(jìn)一步深入研究奠定基礎(chǔ)。

目前，多糖的含量測定方法主要有比色法、滴定法、色譜法、毛細(xì)管電泳法(HPCE)等[1，8]。滴定法受溫度和滴定速度的影響較大，且不能排除還原糖的干擾；色譜法(主要有薄層掃描法、HPLC法、GC法)雖然簡便、快捷、準(zhǔn)確，但需多糖標(biāo)準(zhǔn)品和特定酶，應(yīng)用受限制[9]；HPCE主要用于蛋白質(zhì)、多肽等大分子物質(zhì)的分析，在糖分析中的應(yīng)用較少；而比色法(應(yīng)用最為廣泛的有苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法)雖干擾因素多、重現(xiàn)性較差，但操作簡單，易于快速測定，兩種方法對比，以苯酚-硫酸法較為穩(wěn)定，為多糖較為理想的含量測定方法[10]。本研究通過采用單因素試驗(yàn)，對苯酚-硫酸法顯色條件進(jìn)行優(yōu)化，為該處方中多糖的含量測定方法的建立提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料、試劑與儀器

1.1 材料與試劑

黃精、白及等11味藥材(均購自湖南省三湘中藥飲片有限公司)；D-無水葡萄糖(批號：110833-201205，供含量測定用，含量以 99.5%計(jì)，由中國食品藥品檢定研究院提供)；無水乙醇(湖南匯虹試劑有限公司)。

1.2 儀器與設(shè)備

UV1102紫外分光光度計(jì)(上海天美科學(xué)儀器有限公司)；電子分析天平(AY120，Shimadzu 0.1mg～120g)，80-1型電動(dòng)離心機(jī)(城西曉陰電子儀器廠)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52(上海亞榮生化儀器廠)；98-1C型數(shù)字控溫電熱套(天津市斯特儀器有限公司)，SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵(上海亞榮生化儀器廠)；10mL具塞刻度試管。

2 方法與結(jié)果

2.1 復(fù)方水提液制備

稱取黃精、白及等11味藥(一個(gè)處方量165g)，加熱回流提取2次，第1次加10倍量水，回流提取2h；第2次加8倍量水，回流提取1.5h，過濾，合并2次提取的藥液，減壓濃縮，定容至1 000mL，備用。

2.2 含測用溶液制備

2.2.1 對照品溶液制備 精密稱取置105 ℃條件下干燥恒重的葡萄糖對照品0.082 9g，加水制成葡萄糖含量為0.082 9mg/mL的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備 精密移取供試品藥液2mL置離心管中，加無水乙醇8mL，搖勻，3 000r/s 離心15min，棄去上清液，沉淀物加80%的乙醇洗滌2次，8mL/次(每次離心10min)，揮干乙醇后，沉淀加蒸餾水溶解，定容至100mL，精密量取上述稀釋液10mL，加蒸餾水定容至25mL，即得。

2.2.3 不同濃度苯酚溶液制備 分別精密量取苯酚2、3、4、5、6、7g，置100mL容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，即得。

2.3 總多糖含量測定

2.3.1 顯色條件確立

(1)檢測波長確定。精密吸取對照品溶液0.8mL,供試品溶液2mL，置有刻度的具塞試管中，加水定容至2mL，加5%苯酚溶液1.0mL，搖勻，加入濃硫酸5.0mL(移液管垂直懸于試管口，快速加入)，搖勻，沸水中反應(yīng)20min，取出，迅速置冰水中冷卻至室溫。以相應(yīng)的試劑作空白對照，在波長400～800nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。結(jié)果顯示，對照品在489.6nm處有最大吸收，供試品在488.6nm處有最大吸收，空白對照在此無吸收，故本試驗(yàn)選擇489nm作為測定波長,見圖1。

圖1 葡萄糖對照品溶液(A)與供試品溶液(B)可見吸收光譜

(2)顯色劑苯酚不同濃度考察。精密吸取對照品溶液1.0mL、供試品溶液2mL置于有刻度的具塞試管中，分別加入2%、3%、4%、5%、6%、7%的苯酚溶液1.0mL，搖勻，迅速加入濃硫酸5.0mL，搖勻，置于沸水浴中20min，取出，迅速至冰水中放至室溫，并加水定容至9mL。平行制備3份，以蒸餾水代替糖溶液，以同樣的方法制備空白對照品，在489nm 處測定吸光度。結(jié)果顯示，對照品溶液、供試品溶液的吸光度值均在苯酚的濃度為5%時(shí)最大(分別為：0.339±0.014、0.348±0.09)，故本試驗(yàn)選擇濃度為5%的苯酚,見圖2。

圖2 5%苯酚用量考察

(3)顯色劑硫酸用量考察。精密吸取對照品溶液1.0mL、供試品溶液2mL，同“苯酚濃度考察”中方法分別加入濃硫酸3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0mL顯色，489nm處測定吸光度。結(jié)果顯示：隨著濃硫酸加入量的遞增，供試品(最大值：0.489±0.014)與對照品(最大值：0.465±0.014)的吸光度也呈現(xiàn)遞增趨勢，故本研究選擇濃硫酸的用量為6mL。見圖3。

圖3 濃硫酸加入量考察

(4)反應(yīng)溫度考察。精密吸取對照品溶液1.0mL、供試品溶液2mL，同苯酚濃度考察中方法，分別置于0、20、40、60、80、100℃不同溫度條件下顯色，在489nm處測定吸光度。結(jié)果顯示，對照品在反應(yīng)溫度為100℃時(shí)有最大吸光值(0.471±0.012)，供試品在反應(yīng)溫度為80℃時(shí)有最大吸收值(0.487±0.015)，因供試品在反應(yīng)溫度為80℃、100℃時(shí)的吸光值相差甚小，故本試驗(yàn)選擇100℃作為最佳反應(yīng)溫度，見圖4。

圖4 反應(yīng)溫度考察

(5)反應(yīng)時(shí)間考察。精密吸取對照品溶液1.0mL、供試品溶液2mL，同“苯酚濃度考察”中方法，分別置沸水浴中反應(yīng)10、15、20、25、30、35min，于489nm處測定吸光度，結(jié)果顯示，反應(yīng)時(shí)間為20min時(shí)，吸光度值均最大(分別為0.468±0.012，0.501±0.018)，故本試驗(yàn)選擇20min作為最佳反應(yīng)時(shí)間，見圖5。

圖5 反應(yīng)時(shí)間考察

(6)冷卻條件考察。精密吸取對照品溶液1.0mL、供試品溶液2mL，同“苯酚濃度考察”中方法顯色，分別置于冰水、常溫水中冷卻至室溫，以蒸餾水代替糖溶液以同樣的方法制備空白對照，在489nm處測定吸光度，結(jié)果顯示，冰水中冷卻時(shí)，對照品吸光值(0.475±0.014)、供試品吸光值(0.495±0.019)均優(yōu)于常溫水冷卻，故本試驗(yàn)選擇在冰水中迅速冷卻的方法，見圖6。

圖6 冷卻條件考察

(7)最佳顯色條件驗(yàn)證。精密吸取對照品溶液1.0mL，供試品溶液2mL，置有刻度的具塞試管中，加入5%苯酚溶液1.0mL，搖勻，迅速加入濃硫酸6.0mL，搖勻，置沸水浴中反應(yīng)20min，取出，迅速至冰水中放冷至室溫，分別平行制備3份，以蒸餾水代替糖溶液，以同樣的方法制備空白對照，在489nm處測定吸光度，結(jié)果顯示，在最佳顯色條件下制備的溶液中，對照品溶液吸光度的平均值為(0.475±0.023)，供試品溶液吸光度的平均值為(0.496±0.016)。

2.3.2 方法學(xué)考察

(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍。分別精密量取0.0829mg/mL的對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5mL置于有刻度的具塞試管中，按“最佳顯色條件驗(yàn)證”項(xiàng)條件顯色，用蒸餾水以同樣方法作空白參比，在489nm處測定吸光度(Abs)。結(jié)果顯示葡萄糖在16.6～124μg范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系，R2=0.9991，見圖7。

圖7 葡萄糖對照品標(biāo)準(zhǔn)曲線

(2)精密度考察。精密吸取對照品溶液1.0mL分別置編號為6支有刻度的具塞試管中，按“最佳顯色條件驗(yàn)證”項(xiàng)下方法顯色，在489nm處測定吸光度，代入回歸方程中計(jì)算，所得RSD值為2.48%(n=6)，表明該儀器重現(xiàn)性良好。

(3)穩(wěn)定性試驗(yàn)。精密量取同一供試品溶液2mL，按“最佳顯色條件驗(yàn)證”項(xiàng)下的方法顯色，在顯色體系反應(yīng)完全后，分別在0、10、20、30、45、60min時(shí)，于489nm處測定吸光度。結(jié)果RSD值為1.06%(n=6)，表明供試品在1h內(nèi)吸光度基本不變，具有良好穩(wěn)定性。

(4)重復(fù)性試驗(yàn)。精密量取供試藥液2mL，按供試品制備方法，平行制備6份供試品溶液，分別從中精密量取2mL，按“最佳顯色條件驗(yàn)證”項(xiàng)下方法顯色，于489nm處測定吸光度，代入回歸方程中計(jì)算，得2mL供試液總多糖的平均含量為89.361μg，RSD值為1.79%(n=6)，表明該供試品重復(fù)性良好。

(5)加樣回收試驗(yàn)。精密量取同一供試品溶液1mL，加對照品溶液1mL，按“最佳顯色條件驗(yàn)證”項(xiàng)下的方法顯色，平行制備6份，于489nm處測定吸光度，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果如表1所示，加樣回收率較高，符合含量測定要求。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果

(6)樣品含量測定。稱取黃精、白及等11味藥(一個(gè)處方量165g)，按“2.1”項(xiàng)下方法平行制備3份供試品藥液。再分別精密量取3份供試品溶液2mL，按“最佳顯色條件驗(yàn)證”項(xiàng)下方法顯色，于489nm處分別測定吸光度，代入回歸方程計(jì)算，結(jié)果益肺通絡(luò)顆粒工藝研究中，一個(gè)處方量提取液總多糖的含量為(5.632±0.021)g。

3 討論

本試驗(yàn)在優(yōu)化苯酚-硫酸法顯色條件過程中，將對照品溶液和供試品溶液在不同顯色條件下的測定結(jié)果進(jìn)行綜合分析，使優(yōu)選的顯色條件更有說服力。苯酚-硫酸法是在碳水化合物中廣泛應(yīng)用的一種方法，是測定多糖的常用方法[11]。本研究選用80%乙醇除去樣品中眾多單糖、低聚糖等干擾成分,再用去離子水提取樣品中所含的多糖類成分，然后采用苯酚-硫酸法測定益肺通絡(luò)顆粒處方提取液的多糖含量，多糖在濃硫酸的作用下，水解成單糖，并迅速脫水生成糠醛生物，與苯酚縮合生成橙黃色化合物，在489nm條件下有特征吸收，一定范圍內(nèi)的葡萄糖濃度與其吸光度呈線性關(guān)系。該方法具有快速簡便、穩(wěn)定可靠等特點(diǎn)，可作為益肺通絡(luò)顆粒工藝研究中總多糖含量測定的參考依據(jù)。

實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，苯酚-硫酸法顯色反應(yīng)的操作繁多，試劑的添加、反應(yīng)時(shí)間和溫度的控制都會(huì)造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的誤差，故在分析檢驗(yàn)操作時(shí)應(yīng)注意：①苯酚溶液應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用，且使用前應(yīng)充分搖勻，將其中的大量微小氣泡排除;②樣品顯色時(shí)，加入苯酚后應(yīng)迅速搖勻；加入硫酸時(shí)，應(yīng)將滴管懸于試管口，迅速加入，搖勻；冰水中冷卻2～3min，應(yīng)立即置紫外分光光度計(jì)下測量；③應(yīng)嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)室操作規(guī)范，選用準(zhǔn)確度高的量器，減少誤差，使測量結(jié)果更加可靠。

[1] 鄭曉艷,林藝華.中藥多糖的提取、分離純化及其含量測定方法概括[J].福建分析測試,2013,22(4)：58-62.

[2] 謝明勇,聶少平.天然產(chǎn)物活性多糖結(jié)構(gòu)與功能研究進(jìn)展[J].中國食品學(xué)報(bào),2010,10(2)：1-8.

[3] 李鶯,趙兵,陳克克,等.黃精的研究進(jìn)展[J].中國野生植物資源,2012,31(1):9-13.

[4] 陸峻波,劉亞輝,楊永紅,等.從文獻(xiàn)分析看我國白芨研究進(jìn)展[J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2011,26(2):288-292.

[5] 何永超,劉雅敏,朱艷慧,等.苯酚-硫酸顯色法測定炙甘草湯的總多糖含量研究[J].中醫(yī)學(xué)報(bào),2013,28(4)：547-549.

[6] 張杰,李春艷,李勁平,等.蒽酮硫酸法與苯酚硫酸法測定竹節(jié)參多糖含量的比較研究[J].中南藥學(xué),2012,10(6)：421-424.[7] 劉玲,陶松,應(yīng)萍,等.苯酚硫酸法測補(bǔ)腎口服液中多糖含量及其不確定度評價(jià)[J].江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2013,25(3):38-41.

[8] 邸明磊,單曉菊,陶遵威.中藥多糖的含量測定方法概述[J].天津藥學(xué),2010,22(6)：53-55.

[9] 劉志明,唐彥君,吳海舟,等.苯酚-硫酸法測定葡萄酒中總糖含量的樣品處理[J].中國釀造,2011(2):158-161.

[10] 梁存權(quán).比色法測定植物多糖含量方法概述[J].北方藥學(xué),2011,8(12)：4,86.

[11] 趙寧,問亞琴,潘秋紅.苯酚-硫酸法測定干紅葡萄酒中的多糖含量[J].中外葡萄與葡萄酒,2011(5)：9-12,17.

(責(zé)任編輯：宋勇剛)

Determination of Total Polysaccharides in Aqueous Extracts of Yifei Tongluo Granules by Phenol-Sulfuric Acid Method

Tan Xiping1,Xia Xinhua1*,Luo Chunqing1,Huang Li1,Zeng Jianguo2，Liu Yanke2

(1.School of Pharmacy，Hunan University of Chinese Medicine,Changsha 410208，China；2.Changsha Central Hospital, Changsha 410004, China)

Objective:To establish the content determination method of total polysaccharides in aqueous extracts of Yifei Tongluo Granules.Methods:With grape sugar as reference substance，the best coloration conditions of phenol-sulfuric acid method for assaying total polysaccharides were optimized by single factor test.Results:The best coloration conditions were as follows: adding 1.0mL of 5% phenol and 6.0mL of sulfuric acid，reacting at 100℃ for 20min, and then cooling to room temperature in ice water. The mass of glucose had a good linear relationship with absorbance at the range of 16.6μg～124μg(r=0.999 1)，and the average recovery was 100.6%，RSD 2.5%.Conclusion:The method is fast，accurate，stable and convenient，which can be available for determination for total polysaccharide in the precess studies of Yifei Tongluo Granules.

Yifei Tongluo Granules；Phenol-sulfuric Acid Method; Total Polysaccharides；Content Determination

2014-05-09

國家科技重大專項(xiàng)“艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治”子課題(2013ZX10005004-003-001)

譚喜平(1989-)，女，湖南中醫(yī)藥大學(xué)碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幮轮苿┘爸苿┵|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。

夏新華(1962-)，男，博士，湖南中醫(yī)藥大學(xué)教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幮轮苿?、新劑型、新技術(shù)及制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。E-mail：xiaxinhua001@163.com。

R284.2

A

1673-2197(2014)17-0024-03