雙臂大環(huán)稀土配合物的合成及其生物活性

胡學(xué)雷，孟美娜，姜治平，張道霞，甘東東，曾令康，葛燕麗

［1．武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院，湖北 武漢 430074；2．綠色化工過程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（武漢工程大學(xué)），湖北 武漢 430074］

0 引 言

稀土配合物具有優(yōu)異的光、電、磁性質(zhì)，在許多方面有特殊用途，其理論研究對新材料、催化劑、新型藥物等的開發(fā)有重要意義，已成為化學(xué)、材料學(xué)等學(xué)科發(fā)展的前沿課題之一［1－2］．含氮的大環(huán)配體具有環(huán)形空腔和多個(gè)氮原子配位點(diǎn)，對金屬離子尤其是稀土離子具有超強(qiáng)的配位能力，并能與它們形成穩(wěn)定的配合物．本課題組在雙酚含氮大環(huán)稀土配合物的設(shè)計(jì)、合成、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)研究方面作了大量的工作，獲得了多個(gè)系列的單核、橋聯(lián)雙核、橋聯(lián)四核稀土大環(huán)配合物并研究了其晶體結(jié)構(gòu)、熒光性質(zhì)及相關(guān)的生物活性［3－10］．為進(jìn)一步發(fā)展新型的大環(huán)稀土配合物系列，本課題組近期用三足式有機(jī)胺（三氨基丙基胺trpn）與2，6－二甲?；?－甲基苯酚在高氯酸鉺為模板的條件下通過［2＋2］縮合反應(yīng)合成了一個(gè)新型的雙臂大環(huán)稀土鉺配合物［Er L］Cl O4·2 H2O（圖1，L為失去兩個(gè)酚氧氫離子的負(fù)二價(jià)雙臂雙酚大環(huán)配體），并通過元素分析、紅外光譜、紫外光譜和電噴霧質(zhì)譜對其進(jìn)行了表征，配合物對DNA有較明顯的切割活性和對大腸桿菌均有一定的抑制作用．

圖1 配合物［ErL］ClO4·2H 2 O的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig．1 The chemical structure of the compex［Er L］ClO4·2 H 2 O

1 實(shí)驗(yàn)部分

1．1 試劑與儀器

合成所用試劑均為分析純；丙烯腈和DMF為蒸餾得到；活性二氧化錳用分析純MnCO3熱分解制得；2，6－二甲?；?－甲基苯酚和三氨基丙基胺（trpn）分別參照文獻(xiàn)［10］合成，物理參數(shù)與文獻(xiàn)值一致；其它試劑均為分析純．配合物的電子吸收光譜在Shimadzu UV－2450PC紫外分光光度計(jì)上測定；紅外光譜在Perk－Elmer FT－IR光度計(jì)上測量（KBr壓片）；電噴霧質(zhì)譜（ES－MS）在 FininiganLCQ質(zhì)譜儀測定，樣品濃度約為1．0×10－3mmol／dm3，樣品稀溶液在針電壓＋4．5 k V下以5×10－6dm3min－1噴霧，流動(dòng)相為甲醇，收集正離子處理．

1．2 配合物［Er L］Cl O4·2 H 2 O的合成

稱取286．1 mg Er（ClO4）3·6H2O和82．4 mg 2，6－二甲?；?－甲基苯酚，溶解于20 m L無水甲醇中，轉(zhuǎn)移到100 m L三口瓶中，在回流溫度下滴加94．5 mg trpn的甲醇溶液，滴加完畢后回流8 h，冷卻至室溫，過濾后用乙醚擴(kuò)散，得到配合物黃色粉末99．69 mg，收率為44%．元素分析C36H58Cl N6O8Er：實(shí)測值（計(jì)算值）∕%：C，47．68（47．75）；H，6．93（6．46）；N，8．87（9．28）．紫外可見光譜（λmax／nm）［ε／（dm3·mol－1·cm－1）］：268（39 700），398（17 400）；紅外光譜（cm－1）：3 428（—OH），1 653（—C —N—），1 100（Cl O－4）．

1．3 與DNA的相互作用

CT－DNA溶液的配置：將CT－DNA用p H為7．2的5 mmol／L Tris－HCl，50 mmol／L NaCl緩沖溶液溶解后，用紫外光譜測定A260／A280＝1．8，說明該CT－DNA樣品中不含蛋白質(zhì)及苯酚．測定溶液在260 nm處的A值，通過Lambert定律A＝εbc（ε＝6 600 L／（mol·cm）），計(jì)算出 CTDNA的濃度．

1．3．1 紫外光譜 配合物用重蒸的DMF溶解，配成數(shù)量級為10－5的溶液．以Tris緩沖溶液作為參照，向5×10－5mol／L的配合物溶液和參照溶液中同時(shí)加入等量的DNA溶液，使DNA與配合物的濃度比值不斷上升，直至飽和，放置一段時(shí)間測定配合物的紫外光譜．

1．3．2 熒光光譜 溴乙錠（EB）與DNA按等體積混合的復(fù)合物溶液，以520 nm為激發(fā)波長，掃描EB－DNA復(fù)合體系在540～740 nm范圍的熒光光譜．逐漸減小配合物與EB－DNA復(fù)合物溶液的濃度比，室溫下依次測量其熒光光譜．

熒光淬滅常數(shù)的計(jì)算根據(jù)公式［11］

F0／F＝1＋K［Q］

其中F0為EB－DNA溶液的熒光強(qiáng)度；F為配合物與EB－DNA混合后的熒光強(qiáng)度；K為線性方程淬滅系數(shù)；［Q］為配合物的濃度．

1．4 對DNA的切割作用

1．4．1 溶液的配制 TAE 緩沖溶液，Tris－HCl緩沖液，溴化乙錠染色液的配制，配合物溶液的制備均見參考文獻(xiàn)［9］．

1．4．2 凝膠的制備 準(zhǔn)確稱取0．5 g瓊脂糖粉加入到100 mL錐形瓶中，加入1 mL TAE緩沖溶液和50 mL水，封好口后在微波爐中加熱5 min，瓊脂糖完全溶解，冷卻至60℃，加幾滴EB溶液，使得溶液顯淡紅色，將液體倒入帶梳子的水平槽中，室溫放置30 min后，待膠冷卻好，將水平槽放入電泳槽中．

1．4．3 時(shí)間、濃度對切割的影響 時(shí)間的影響：0號試管中加入空白對照緩沖液，1～5號中加入相同濃度的配合物，不同切割時(shí)間下觀察切割效果．

濃度的影響：0號試管中加入空白對照緩沖液，1～5號中加入1μL DNA和10μL配合物溶液（濃度分別為200、400、600、800μmol／L）．

1．5 抑菌活性

實(shí)驗(yàn)菌株為金黃色葡萄球菌和大腸桿菌．固體培養(yǎng)基為瓊脂培養(yǎng)基．

將培養(yǎng)基分裝，液體分裝高度為試管高度的1／4，固體分裝體積為三角瓶的1／2．將瓊脂培養(yǎng)基在微波爐中加熱至熔化，冷卻至50℃左右，將20 mL培養(yǎng)基均勻的鋪在表面皿的表層，冷卻凝固．將在液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)復(fù)蘇的菌種接種到上述培養(yǎng)基中．把直徑6 mm經(jīng)高壓蒸汽滅菌的濾紙片，分別投入已經(jīng)配好的不同濃度的配合物溶液和對照樣及DMSO溶液中，浸泡2 min后備用．取20μL濃度為105 cfu／mL的菌液，均勻的倒入上述鋪有培養(yǎng)基的表面皿中．把抑菌片置于該培養(yǎng)基中，在37℃的電熱恒溫箱中培養(yǎng)24 h，測量每個(gè)抑菌片上產(chǎn)生的透明抑菌圈直徑．

2 結(jié)果與討論

2．1 合成與表征

配合物在DMF中的電子吸收光譜處于268 nm的吸收峰歸屬為苯環(huán)上π－π＊電子躍遷；398 nm處的吸收峰為含有C—N生色團(tuán)的π－π＊電子躍遷，表明原料2，6－二甲?；?－甲基苯酚與三氨基丙基胺trpn中的羰基和氨基發(fā)生縮合形成C—N雙鍵．配合物紅外光譜在1 680 cm－1附近沒有出現(xiàn)原料2，6－二甲?；?－甲基苯酚的C—O的吸收峰，而在1 653 cm－1處有很強(qiáng)的C—N吸收峰，同樣證實(shí)了C—N基團(tuán)的形成；而在1 100 cm－1處為游離的高氯酸根的特征吸收峰，表明配合物為離子型配合物．

2．2 電噴霧質(zhì)譜

圖2為配合物［Er L］ClO4·2H2O的陽離子電噴霧質(zhì)譜圖，質(zhì)譜峰的歸屬列于表1．基峰質(zhì)荷比為m／z＝803．2，歸屬為配合物的分子離子峰［Er3＋L（CH3OH）］＋，系配合物失去陰離子ClO4－再結(jié)合一個(gè)甲醇分子形成；處于m／z＝413．6質(zhì)譜峰歸屬為基峰［Er3＋L（CH3OH）］＋結(jié)合一個(gè)質(zhì)譜系統(tǒng)內(nèi)存在的微量的鈉離子形成的二價(jià)碎片［Er3＋Na＋L（CH3OH）］2＋產(chǎn)生；在m／z＝691．22、m／z＝676．28和m／z＝301．61處的質(zhì)譜峰分別歸屬為 ［Na＋（H2L）（CH3OH）2］＋、［Na＋（H2L）（CH3OH）（H2O）］＋和［（H＋）2（H2L）］2＋，它是配合物失去稀土離子后的中性大環(huán)配體在結(jié)合鈉離子、氫離子及不同數(shù)量的甲醇和水分子形成．配合物在質(zhì)譜條件下有［Na＋（H2L）（CH3OH）2］＋、［Na＋（H2L）（CH3OH）（H2O）］＋和 ［（H＋）2（H2L）］2＋碎片峰的產(chǎn)生顯示了二十八元大環(huán)配合物［Er L］ClO4·2H2O比本課題組之前報(bào)道的二十四元大環(huán)配合物的穩(wěn)定性稍差，這是由于較大的環(huán)與較小的中心離子不匹配產(chǎn)生的．配合物質(zhì)譜圖中沒有觀察到［2＋3］型配合物或穴醚配體的裂解碎片，說明了2，6－二甲?；?－甲基苯酚與三氨基丙基胺trpn在投料比為1∶1時(shí)，只發(fā)生了［2＋2］縮合，結(jié)合元素分析結(jié)果，推斷配合物的結(jié)構(gòu)為圖1所示．

表1 配合物［Er L］ClO4·2 H2 O的電噴霧質(zhì)譜數(shù)據(jù)Table 1 The ES－MS spectroscopic data and assignments for the title complex［Er L］ClO4·2H 2 O

圖2 配合物［Er L］ClO4·2H 2 O在甲醇溶液中的電噴霧質(zhì)譜Fig．2 Positive－ion ES mass spectrum of the complex［Er L］ClO4·2H 2 O in methanol

2．3 配合物與DNA的相互作用

2．3．1 電子吸收光譜 圖3是配合物與DNA相互作用的電子吸收光譜圖．隨DNA濃度增加，配合物在390～410 nm處的吸收峰發(fā)生了減色效應(yīng)和紅移現(xiàn)象，可以初步判斷配合物以插入方式與DNA作用．減色可能的原因是配合物與DNA結(jié)合后，其π＊空軌道與DNA堿基的π軌道發(fā)生偶合，從而使π＊空軌道填充了電子，發(fā)生π→π＊躍遷的幾率減少．

按文獻(xiàn)［12］方程：

［DNA］／｜εa－εf｜＝［DNA］／｜εb－εf｜＋1／Kb｜εb－εf｜

其中：［DNA］為 CT－DNA 的濃度；εa為配合物與CT－DNA共存時(shí)的表觀摩爾吸光系數(shù)；εf為配合物單獨(dú)存在時(shí)的摩爾吸光系數(shù)；εb為與DNA結(jié)合的配合物的摩爾吸光系數(shù)．

以［DNA］／｜εa－εf｜對［DNA］作圖，可以得到結(jié)合常數(shù)Kb的值為1．20×104，處在配合物以插入方式結(jié)合DNA的結(jié)合常數(shù)104～106之內(nèi)．

2．3．2 熒光光譜 圖4是配合物［Er L］ClO4·2H2O與EB－DNA體系相互作用的熒光光譜圖，隨著配合物濃度的增大，EB－DNA復(fù)合體系的熒光強(qiáng)度有明顯的淬滅，說明配合物可能取代了EB－DNA體系中部分的EB分子，導(dǎo)致體系熒光逐漸減弱，進(jìn)而說明配合物與DNA的作用方式與EB和DNA結(jié)合方式類似，均為插入結(jié)合方式［12］．

圖4 配合物對EB－DNA體系的熒光淬滅圖Fig．4 Flourescence spectra of EB－DNA in the absence and presence of ternary complex．Arrows concentration of complex

2．4 配合物［Er L］ClO4·2H 2 O對DNA的切割作用

圖5是在p H為7．2、反應(yīng)溫度和時(shí)間分別為37．5℃和6 h時(shí)，不同濃度配合物切割DNA凝膠電泳圖．實(shí)驗(yàn)表明配合物能將DNA切割成環(huán)形缺刻，隨著配合物濃度的增大，切割的活性變化不明顯．配合物對DNA具有一定的切割活性．

圖5 不同濃度配合物切割PBR322 DNA的凝膠電泳圖Fig．5 Agarose gel electrophoresis for the cleavage of PBR322 DNA by different concentrations of complex

2．5 配合物［Er L］Cl O4·2 H 2 O的抑菌活性

圖6為配合物［Er L］ClO4·2H2O對大腸桿菌的抑制作用的效果圖．浸泡配合物菌樣濾片周圍產(chǎn)生了明顯比浸泡對照稀土鹽較大的抑菌圈，配合物［Er L］ClO4·2 H2O對大腸桿菌的生長有抑制作用，并且相應(yīng)的無機(jī)稀土鹽的抑菌效果好，但配合物濃度增加對抑菌效果沒有明顯的影響．

圖6 配合物對大腸桿菌的抑制作用Fig．6 Effect on bacteriostasis of E．coli of complex

3 結(jié) 語

采用模板法用二元醛和三元有機(jī)胺進(jìn)行縮合反應(yīng)一般會得到三維［2＋3］型籠型配合物，其前提是投料比為2∶3和所形成的穴醚配體與模板金屬離子半徑匹配．本實(shí)驗(yàn)用投料比為1∶1的2，6－二甲酰基－4－甲基苯酚和相對較長的三－（3－氨基丙基）胺 （trpn）在相對較小的Er3＋離子存在下也能發(fā)生［2＋2］模板縮合反應(yīng)并合成了一個(gè)新型的懸臂大環(huán)稀土鉺配合物［Er L］Cl O4·2H2O．通過元素分析、紅外光譜、紫外光譜和電噴霧質(zhì)譜對配合物進(jìn)行了表征．標(biāo)題配合物具有一定的DNA切割活性和對大腸桿菌也有一定的抑制作用．

致謝

感謝湖北省科技廳的資助．

［1］ALEXANDER V．Design and synthesis of macrocyclic and their complexes of lanthanides and actinides［J］．Chem Rev，1995，95（2）：273－342．

［2］BüNZLI J C G，PIGUET C．Lanthanide－containing molecular and supramolecular polymetallic functional assemblies［J］．Chem Rev，2002，102（6）：1897－1928．

［3］胡學(xué)雷，劉煥，胡丹，等．置換反應(yīng)合成稀土穴合物［J］．中國稀土學(xué)報(bào)，2005，23（專輯）：1－4．HU Xue－lei，LIU Huan，HU Dan，et al．The synthesis of Rare earth cryptates by replacement reaction［J］．China Journal of Rare Earths，2005，23（album）：1－4．（in Chinese）

［4］HU X L，CHEN Z，QIU L，et al．Characterization，crystal structure and luminescence properties of a neweuropium（III）complex with the macrocyclic ligand derived from 2，6－Diformyl－4－Methylphenol and diethylenetriamine［J］．J Rare Earths，2008，26（6）：795－799．

［5］胡學(xué)雷，邱 立，陳 中，等．雙酚大環(huán)配體硝酸銪三元配合物的合成、結(jié)構(gòu)與熒光性質(zhì)［J］．化學(xué)學(xué)報(bào)，2008，66（12）：1446－1450．HU Xue－lei，QIU Li，CHEN Zhong，et al．Synthesis，crystal structure and DNA cleavage of a new holmium（III）nitrate with a schiff－based macrocyclic ligand［J］．Acta Chimica Sinica，2008，66（12）：1446－1450．（in Chinese）

［6］張陽玲，邱立，曾慧玲，等，不對稱大環(huán)配體硝酸釓（III）三元配合物的合成與表征［J］．武漢工程大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，30（4）：39－41．ZHANG Yang－Ling，QIU Li，ZENG，Hui－ling，et al．The Synthesis and characterization of a new asymmetric gadolinium （III）nitrate with a macrocyclic ligand［J］．Journal of Wuhan Institute of Technology，2008，30（4）：39－41．（in Chinese）

［7］胡學(xué)雷，邱立，高鋒，等．異雙核 Ag（I）Cu（I）穴合物的合成［J］．武漢工程大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，29（2）：8－10．HU Xue－lei，QIU Li，GAO Feng，et al．The synthesis of a heterodinuclear（Cu（I），Ag（I））cryptate［J］．Journal of Wuhan Institute of Technology，2007，29（2）：8－10．（in Chinese）

［8］王銀平，吳起峰，夏雨佳，等．Ho（III）希夫堿大環(huán)配合物的合成、晶體結(jié)構(gòu)及其對DNA的切割活性研究［J］．高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)，2010，31（12）：2344－2348．WANG Yin－Ping，WU Qi－Feng，XIA Yu－Jia，et al．Sythesis，crystal structure and DNA cleavage of a new holminum（Ⅲ）nitrate with a schiff－based Nacrocyclicligand［J］．Chemical Journal of Chinese Universities，2010，31（12）：2344－2348．（in Chinese）

［9］胡學(xué)雷，劉 煥，袁軍，等．含吡啶基的多氮亞胺穴醚稀土配合物的合成與表征［J］．稀土，2006，27（1）：90－92．HU Xei－lei，LIU Huan，YUAN Jun，etal．Synthesis and characterization of Rare Earth Complexes containing pyridyl multiple nitrogen imine cryptand ［J］．Rare Earth，2006，27（1）：90－92．（in Chinese）

［10］姜治平．稀土大環(huán)配合物的合成及生物活性研究［D］．武漢：武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院，2011．JIANG Zhi－ping．Synthesis and biological activity of rare earth macrocyclic complexes ［D］．Wuhan：School of Chemical Engineering and Pharmacy，Wuhan Institute of Technology，2011．（in Chinese）

［11］LEPECQ J B，PAOLETTI A．Fluorescent complex between ethidium bromide and nucleic acids［J］．Journal of Molecular Biology，1967，27：87－106．

［12］楊頻．生物無機(jī)化學(xué)導(dǎo)論［M］．西安：西安交通大學(xué)出版社，1991：155－156．YANG Pin．Introduction of inorganic chemistry［M］．Xi'an：Xi'an Jiao Tong University Press，1991：155－156．（in Chinese）