血管抑素基因治療Lewis肺癌移植瘤小鼠的實(shí)驗(yàn)研究

李真斌　齊協(xié)飛

【摘要】 目的：觀察血管抑素基因?qū)ewis肺癌小鼠移植瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移的抑制作用。方法：建立C57BL/6j小鼠肺癌模型，30只荷瘤鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為生理鹽水空白對(duì)照組、陽(yáng)離子脂質(zhì)體對(duì)照組、血管抑素基因（PAng）治療組，每組10只。以陽(yáng)離子脂質(zhì)體為介導(dǎo)，將血管抑素基因的重組質(zhì)粒直接注入移植瘤內(nèi)，每周3次，共5周，每周測(cè)瘤體大小1次，第7周末處死所有小鼠，觀察瘤體大小變化、肺表面轉(zhuǎn)移灶數(shù)、小鼠生存期等。結(jié)果：治療組小鼠移植瘤生長(zhǎng)速度減慢，瘤體縮小，肺內(nèi)轉(zhuǎn)移少，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），小鼠活動(dòng)能力、飲食、對(duì)外界刺激的反應(yīng)能力均無明顯改變，生存期明顯長(zhǎng)于對(duì)照組（P<0.05）。結(jié)論：陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)血管抑素基因可有效地抑制Lewis肺癌移植瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移。

【關(guān)鍵詞】 陽(yáng)離子脂質(zhì)體； 血管抑素基因； Lewis肺癌； 小鼠移植瘤

腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移與血管生成密切相關(guān)[1]。20世紀(jì)70年代初Folkman[2]首次提出腫瘤的生長(zhǎng)、發(fā)展和轉(zhuǎn)移依賴血管形成的觀點(diǎn)。以腫瘤新生血管為靶點(diǎn)，抑制腫瘤血管生成，阻斷腫瘤生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及轉(zhuǎn)移途徑，已成為近年來治療腫瘤的新方法[3]。本文建立Lewis肺癌小鼠移植瘤動(dòng)物模型，將血管抑素基因的質(zhì)?；旌衔镏苯幼⑸溆谝浦擦鲶w內(nèi)，觀察瘤體大小變化，移植瘤小鼠對(duì)外界的反應(yīng)能力、飲食、營(yíng)養(yǎng)狀況、生存期等，同時(shí)計(jì)數(shù)肺表面腫瘤轉(zhuǎn)移灶數(shù)，來評(píng)價(jià)血管抑素基因的抑瘤能力。

1 資料與方法

1.1 建立Lewis肺癌小鼠移植瘤模型 在無菌條件下取出Lewis肺癌種鼠的腫瘤組織，去除筋膜組織，配制成1×107/mL的細(xì)胞勻漿懸液，每只小鼠右腋皮下注射細(xì)胞懸液0.2 mL，建立Lewis肺癌小鼠移植瘤模型，室溫下飼養(yǎng)[4]。

1.2 血管抑素基因的重組質(zhì)粒及轉(zhuǎn)染 取含血管抑素基因的質(zhì)粒（PAng）（南昌大學(xué)二附院分子實(shí)驗(yàn)室保存）和SA脂質(zhì)體，按質(zhì)粒DNA與SA脂質(zhì)體重量比為1：7混合，輕搖混合物，室溫下靜置20 min后進(jìn)行試驗(yàn)[5]。

1.3 移植瘤小鼠分組及治療 觀察移植瘤瘤體生長(zhǎng)，選擇直徑生長(zhǎng)至8 mm左右成瘤小鼠30只，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為3組，每組10只。將SA脂質(zhì)體-質(zhì)粒DNA混合物用微量注射器進(jìn)行瘤內(nèi)注射治療，3次/周，周一、周三、周五，共計(jì)5周。（1）生理鹽水空白對(duì)照組：0.9%氯化鈉60μL/次/只，（2）SA脂質(zhì)體對(duì)照組：0.9%氯化鈉10μL+脂質(zhì)體50μL/次/只，（3）PAng治療組：PAng10μL+脂質(zhì)體50μL/次。

1.4 觀察指標(biāo) （1）腫瘤體積的變化：實(shí)驗(yàn)期間，每周一用游標(biāo)卡尺測(cè)量瘤體橫直徑，按v=ab2/2計(jì)算瘤體大小。（2）肺內(nèi)轉(zhuǎn)移灶數(shù)：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取出死亡處或死后小鼠的肺臟計(jì)數(shù)肺表面肉眼可見的轉(zhuǎn)移灶數(shù)，HE染色證實(shí)肺內(nèi)轉(zhuǎn)移。（3）一般情況：實(shí)驗(yàn)期間，觀察小鼠對(duì)外界的反應(yīng)能力及活動(dòng)能力、飲食、營(yíng)養(yǎng)狀況等。（4）生存期：以小鼠接種癌細(xì)胞之日為起點(diǎn)，直至小鼠死亡或被處死時(shí)為止，計(jì)算每只實(shí)驗(yàn)小鼠生存天數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 10.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組治療后小鼠移植瘤平均體積的比較 Lewis肺癌細(xì)胞懸液接種于C57BL/6j小鼠右腋皮下后3～5 d見生長(zhǎng)出大小約2 mm肉眼所見腫瘤。兩對(duì)照組瘤體呈生長(zhǎng)迅速，壞死結(jié)痂直至小鼠死亡；PAng組治療后第5天見移植瘤生長(zhǎng)開始減慢，第15天后體積開始縮小，第22天PAng組平均體積為（156±8）mm3、與空白鹽水對(duì)照組（5207±126）mm3及SA脂質(zhì)體對(duì)照組（5436±131）mm3比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），第5周末，PAng組有2只小鼠瘤體肉眼消失，見表1。

2.2 小鼠進(jìn)食、營(yíng)養(yǎng)、反應(yīng)能力等變化 治療組小鼠治療前后活動(dòng)能力，對(duì)外界刺激反應(yīng)能力無明顯變化，進(jìn)食良好，營(yíng)養(yǎng)狀況較佳。對(duì)照組小鼠對(duì)外界刺激反應(yīng)能力、活動(dòng)能力逐漸變差，進(jìn)食差，消瘦，漸呈惡病質(zhì)，直至死亡。

2.3 三組肺內(nèi)轉(zhuǎn)移灶數(shù)目情況 兩對(duì)照組小鼠肺臟肉眼所見色蒼白，表面粗糙、凹凸不平，見較多魚肉樣結(jié)節(jié)樣病灶，結(jié)節(jié)樣病灶病理切片HE染色后，鏡下見大量核大、深染、形狀不規(guī)則腫瘤細(xì)胞（圖1）。治療組僅3只小鼠肺臟色粉紅，表面光滑見數(shù)個(gè)較小結(jié)節(jié)樣病灶，病理組織學(xué)僅見少許腫瘤細(xì)胞（圖2），其他小鼠均未見明顯病灶，病理組織學(xué)未見腫瘤細(xì)胞。

2.4 三組小鼠生存期比較 對(duì)照組小鼠在35 d內(nèi)全部死亡，觀察期結(jié)束PAng組死亡4只，第7周末處死所有小鼠。治療組平均為45 d以上，與生理鹽水空白對(duì)照組（30.1±3.2）d和SA脂質(zhì)體對(duì)照組（33.5±2.9）d比較，生存期顯著延長(zhǎng)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3 討論

腫瘤的血管生成對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移起關(guān)鍵性作用，當(dāng)腫瘤體積達(dá)1～2 mm3時(shí)繼續(xù)生長(zhǎng)則必須依賴新省生血管形成[6]。腫瘤血管系統(tǒng)即為腫瘤細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)供給，同時(shí)調(diào)控著腫瘤的病理生理狀態(tài)，如腫瘤的發(fā)展、侵入、轉(zhuǎn)移，以及對(duì)各種治療的響應(yīng)[7]?？寡苌芍委熆墒鼓[瘤血管網(wǎng)和微循環(huán)出至少暫時(shí)性的正?；厔?shì)[8]。1994年，Reilly等[9]通過Lewis肺癌的小鼠實(shí)驗(yàn)研究從小鼠的血清中分離獲得血管抑素（Angiost-atin），他對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、增殖直接起抑制作用，促使腫瘤細(xì)胞休眠對(duì)腫瘤細(xì)胞無抑制作用，是最有潛力的血管生成抑制因子。而且所有腫瘤細(xì)胞的血管內(nèi)皮細(xì)胞均相同或相似，抗血管治療可針對(duì)所有實(shí)體瘤[10-11]。汪力慧[12]通過將血管內(nèi)皮抑素直接瘤體內(nèi)注射治療Lewis肺癌的C57小鼠移植瘤，結(jié)果顯示血管內(nèi)皮抑素對(duì)移植瘤生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，減少腫瘤肺轉(zhuǎn)移率，其作用程度與內(nèi)皮抑素劑量呈現(xiàn)明顯正相關(guān)，且血管內(nèi)皮抑素中未見獲得性耐藥現(xiàn)象發(fā)生，沒有明顯的毒副作用，但作用持續(xù)時(shí)間很短。石磊等[13]采用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將真核表達(dá)載體導(dǎo)入人胰腺癌細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，檢測(cè)到轉(zhuǎn)染細(xì)胞所分泌的血管抑素，進(jìn)一步建立種植瘤模型，結(jié)果顯示血管抑素轉(zhuǎn)染組的種植瘤生長(zhǎng)明顯低于對(duì)照組，種植瘤微血管密度顯著少于對(duì)照組，同時(shí)也表明基因轉(zhuǎn)染有效可行，可有效轉(zhuǎn)染目的基因，進(jìn)而翻譯表達(dá)出目的基因蛋白。孫平等[14]以陽(yáng)離子脂質(zhì)體為載體，構(gòu)建血管抑素基因真核表達(dá)質(zhì)粒，直接注射入瘤體，治療人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，基因治療組腫瘤的生長(zhǎng)速度和體積均低于空質(zhì)粒對(duì)照組，表明血管抑素基因治療確有抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。黃春錦等[15]建立人胰腺癌細(xì)胞PC3裸鼠原位移植瘤模型，觀察血管抑素基因?qū)σ浦擦錾L(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的影響，血管抑素基因?qū)σ认侔┰灰浦擦瞿Ｐ吐闶竽[瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移有抑制作用。本實(shí)驗(yàn)通過建立Lewis肺癌小鼠移植瘤，觀察血管抑素基因?qū)σ浦擦錾L(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示血管抑素基因治療組移植瘤體積小于對(duì)照組，肺轉(zhuǎn)移發(fā)生率較低，治療組小鼠營(yíng)養(yǎng)狀況及活動(dòng)能力良好，生活質(zhì)量改善。endprint

抗血管生成治療腫瘤目前還處于試驗(yàn)階段，還有很多問題有待解決，如何種基因載體轉(zhuǎn)載效率高，如何控制，是否存在劑量依賴關(guān)系，何種劑量最佳等。但本文為攻克惡性腫瘤提供了新的思路和方法，隨著科技的進(jìn)步，有望成為治療腫瘤的新方法。

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（收稿日期：2013-09-05） （本文編輯：黃新珍）endprint

抗血管生成治療腫瘤目前還處于試驗(yàn)階段，還有很多問題有待解決，如何種基因載體轉(zhuǎn)載效率高，如何控制，是否存在劑量依賴關(guān)系，何種劑量最佳等。但本文為攻克惡性腫瘤提供了新的思路和方法，隨著科技的進(jìn)步，有望成為治療腫瘤的新方法。

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抗血管生成治療腫瘤目前還處于試驗(yàn)階段，還有很多問題有待解決，如何種基因載體轉(zhuǎn)載效率高，如何控制，是否存在劑量依賴關(guān)系，何種劑量最佳等。但本文為攻克惡性腫瘤提供了新的思路和方法，隨著科技的進(jìn)步，有望成為治療腫瘤的新方法。

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