代謝型谷氨酸受體5 mRNA與腦梗死的相關(guān)性研究

楊巧蓮等

【摘要】 目的：觀察急性腦缺血大鼠腦組織中mGluR5 mRNA在不同時段的表達變化的規(guī)律，探討mGluR5 mRNA與腦梗死的相關(guān)性。方法：75只雄性Wistar大鼠按照隨機數(shù)字表法分為正常對照組、手術(shù)組1、3、6、12、24 h及3 d、14 d組及其相對應(yīng)的假手術(shù)對照組，采用大鼠MCAO模型，利用原位雜交技術(shù)，檢測各組mGluR5 mRNA的表達。結(jié)果：與正常對照組相比，假手術(shù)對照組mGluR5 mRNA表達無明顯改變（P>0.05）。手術(shù)組mGluR5 mRNA各時間段表達均顯著高于假手術(shù)對照組及正常對照組，缺血1 h其表達即有升高，比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。 mGluR5 mRNA 表達6 h達到高峰（F=5.328，P<0.00），3 d后表達開始下降（P<0.01），14 d基本降至正常對照水平（P>0.05）。結(jié)論：mGluR5在腦缺血后升高，提示mGluR5在腦梗死中有著重要作用，從而對我們的臨床研究指出一條途徑。

【關(guān)鍵詞】 腦梗死； mGluR5； mRNA

谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，其受體介導(dǎo)神經(jīng)毒性作用[1-2]。本研究以線栓法建立大鼠大腦中動脈栓塞模型，采用原位雜交技術(shù)對鼠腦mGluR5 mRNA進行檢測，來觀察谷氨酸受體在腦梗死中的動態(tài)變化規(guī)律，以待從基因水平為腦梗死治療提供理論依據(jù)，從而針對相應(yīng)不同環(huán)節(jié)進行基因敲除，早期遏制缺血性腦損害基本環(huán)節(jié)，為腦梗死的防治提供從理論到實踐的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 mGluR5原位雜交檢測試劑盒，胃蛋白酶，預(yù)雜交液，mGluR5寡核苷酸探針雜交液，封閉液，生物素化鼠抗地高辛，SABC-POD，生物素化過氧化物酶，DAB顯色試劑盒，原位雜交專用PBS緩沖液。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物及分組 健康Wistar雄性大鼠75只，體重240～300g，由內(nèi)蒙古大學(xué)動物試驗中心提供。按照隨機數(shù)字表法分為：正常對照組、腦缺血后1、3、6、12、24 h及3 d、14 d組（手術(shù)組）及相應(yīng)的假手術(shù)對照組，每組5只。

1.2.2 動物模型制備 采用左側(cè)大腦中動脈（MCAO）線栓法[3-4]。大鼠用3%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，取仰臥位固定于鼠臺上，消毒后頸部正中切口，暴露左頸總動脈和頸內(nèi)外動脈，結(jié)扎并切斷頸外動脈，結(jié)扎翼腭動脈，血管夾夾閉頸內(nèi)、頸總動脈，在頸總動脈近分叉處剪一約0.3 mm小口，將頭部蘸硅橡膠的尼龍魚線經(jīng)小口處插入，沿頸內(nèi)動脈入顱，進線從分叉處算約19～21 mm，稍感阻力時停止，此時已至大腦中動脈，結(jié)扎頸總動脈進線處，剪去多余的栓線，縫合手術(shù)切口。

1.2.3 腦組織的處理 于上述規(guī)定時間點，將大鼠深麻后快速斷頭取出腦組織，固定、脫水、浸蠟、包埋腦組織，再制成6 μm厚冠狀切片。

1.2.4 進行原位雜交 將石蠟切片烤箱內(nèi)過夜，經(jīng)常規(guī)脫蠟至水，用胃蛋白酶混勻，經(jīng)預(yù)雜交、雜交后洗滌，滴加封閉液、SABC及生物素化過氧化物酶，DAB顯色后用蘇木素復(fù)染后充分水洗，經(jīng)酒精脫水、二甲苯透明后用樹膠封片。

1.2.5 觀察病理變化 在400倍顯微鏡視野下觀察各組腦皮質(zhì)缺血區(qū)相應(yīng)的病理變化。

1.3 圖像分析 采用江蘇省捷達科技公司的形態(tài)分析系統(tǒng)進行圖像分析，每張切片隨機選取10個單位面積，測量原位雜交的灰度值?；叶戎到档捅砻鱩GluR5 mRNA表達升高，灰度值越小，說明mGluR5 mRNA表達升高越明顯，反之亦然。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 12.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 原位雜交分析結(jié)果 與正常對照組相比，假手術(shù)對照組mGluR5 mRNA表達無明顯改變（P>0.05）。手術(shù)組與正常對照組和假手術(shù)對照組相比，腦缺血后1 h缺血皮質(zhì)區(qū)mGluR5 mRNA灰度值明顯降低，即缺血皮質(zhì)區(qū)mGluR5 mRNA胞漿內(nèi)表達明顯升高，比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。mGluR5 mRNA胞漿內(nèi)表達6 h達到高峰（F=5.328，P<0.01），3 d后表達開始下降（P<0.01），14 d基本降至正常對照水平（P>0.05）。手術(shù)組各時間點缺血皮質(zhì)區(qū)mGluR5 mRNA胞漿內(nèi)表達與手術(shù)組缺血6 h比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表1。

2.2 組織形態(tài)學(xué)改變 光鏡下假手術(shù)組未表現(xiàn)神經(jīng)元形態(tài)異常；手術(shù)組皮質(zhì)部分神經(jīng)元結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出壞死樣改變，包括細胞核濃縮、胞漿紅染加深、細胞結(jié)構(gòu)不清、呈梭形或三角形改變，異常結(jié)構(gòu)呈小灶分布，見圖1～4。

3 討論

GluR按與配體結(jié)合后的效應(yīng)的不同分為兩類：一類是iGluR，包括NMDA受體、AMPA受體和KA受體，另一類是mGluR[5]。mGluR5是1992年國外研究者由mGluR1做探針從鼠腦的cDNA文庫中首次分離[6-7]。mGluR5在腦內(nèi)分布廣泛，正常情況下mGluR5的表達在成年大鼠腦內(nèi)皮質(zhì)淺層及多個核團內(nèi)是廣泛存在的，研究表明人類與大鼠的mGluR5氨基酸序列有94.5%的同源性，推測mGluR5 mRNA高表達區(qū)也是紋狀體、海馬及大腦皮質(zhì)[8-9]。

有研究發(fā)現(xiàn)手術(shù)組mGluR5 mRNA表達多于假手術(shù)組及對照組，腦組織病理檢測也證實手術(shù)組腦細胞明顯水腫和神經(jīng)元壞死的病理形態(tài)學(xué)改變[10]。因此，本文推測mGluR5是起神經(jīng)損傷作用的，在腦缺血性損害時，Glu介質(zhì)大量釋放，激活mGluR5而引起腦細胞一系列生化反應(yīng)及病理變化。原位雜交實驗顯示大鼠缺血后大腦皮層mGluR5 mRNA表達在缺血后1 h即有明顯增加，到缺血后6 h達到高峰，3 d表達開始下降，14 d基本降至正常對照組水平。推測其實驗顯示變化過程主要與鈣離子超載有很大關(guān)系。而正常對照組與各假手術(shù)對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），說明單純的手術(shù)操作對mGluR5 mRNA表達無明顯影響。根據(jù)上述研究，可選擇性地將mGluR5作為治療腦缺血神經(jīng)損傷的靶點，為腦梗死的防治提供了新的思路，具有一定的臨床應(yīng)用前景[11-12]。endprint

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（收稿日期：2014-01-20） （本文編輯：黃新珍）endprint

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