真核表達(dá)載體pcDNA3.1—Beclin1的構(gòu)建及其對(duì)子宮內(nèi)膜癌HEC細(xì)胞增殖的影響

何玨　張文書　王珍玲

【摘要】 目的：構(gòu)建自噬基因Beclin1的真核表達(dá)載體pcDNA3.1-Beclin1，檢測(cè)人子宮內(nèi)膜癌HEC細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Beclin1后，外源性基因Beclin1在蛋白水平的表達(dá)，并觀察其對(duì)HEC細(xì)胞增殖的影響。方法：通過RT-PCR和T/A克隆等方法，構(gòu)建自噬基因Beclin1的真核表達(dá)載體pcDNA3.1-Beclin1，并通過脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法將外源性Beclin1基因?qū)肴祟愖訉m內(nèi)膜癌細(xì)胞株HEC中，通過實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后Beclin1在HEC中表達(dá)的情況，并設(shè)立實(shí)驗(yàn)組（轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Beclin1真核載體）、空質(zhì)粒對(duì)照組（轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載體）、空白脂質(zhì)體對(duì)照組，用Western blot法檢測(cè)子宮內(nèi)膜癌HEC細(xì)胞中Beclin1的表達(dá)情況，MTT法檢測(cè)Beclin1對(duì)HEC細(xì)胞體外生長的影響等，研究Beclin1基因與子宮內(nèi)膜癌的關(guān)系。結(jié)果：經(jīng)限制性內(nèi)切酶鑒定及測(cè)序，證明Beclin1基因真核質(zhì)粒的序列完全正確，將其轉(zhuǎn)染HEC細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后的HEC細(xì)胞在體外能繼續(xù)增殖，但增殖能力明顯下降。結(jié)論：Beclin1基因pcDNA3.1-Beclin1真核表達(dá)載體構(gòu)建成功，并能在HEC細(xì)胞中表達(dá)，轉(zhuǎn)染HEC細(xì)胞體外增殖能力明顯降低，Beclin1基因用于子宮內(nèi)膜癌基因治療具有重要靶向價(jià)值。

【關(guān)鍵詞】 Beclin1； 真核表達(dá)載體； 細(xì)胞； 增殖

子宮內(nèi)膜癌（EC）是僅次于乳腺癌和宮頸癌的常見女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，占女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的20%～30%[1]。其發(fā)病率每年10萬人約有24.6人，在我國近二十年來也呈逐年上升趨勢(shì)，但其發(fā)生、發(fā)展機(jī)理仍不十分明確。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為其發(fā)生發(fā)展與雌激素水平密切相關(guān)[2]。長期無拮抗的雌激素刺激可能是主要發(fā)病因素，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中可觀察到雌激素引起子宮內(nèi)膜有絲分裂增多的現(xiàn)象。

Beclin1是一種與自噬相關(guān)的抑癌基因，位于人染色體17q21上，在卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌中該部位均存在缺失。有研究提示Beclin1的表達(dá)缺失導(dǎo)致自噬活性的減弱從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生，故Beclin1在雌激素依賴性腫瘤子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。因此，本研究旨在構(gòu)建Beclin1真核表達(dá)載體pcDNA3.1-Beclin1，建立穩(wěn)定表達(dá)Beclin1的細(xì)胞株，探討B(tài)eclin1在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖中的影響，以期對(duì)子宮內(nèi)膜癌基因治療提供科學(xué)的依據(jù)，對(duì)內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展關(guān)系的研究能進(jìn)一步深入奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 高效真核表達(dá)載體pcDNA3.1質(zhì)粒購自O(shè)ligoengine公司；G418和Lipofectamine2000購自Invivogen公司；BglⅡ、EcoRI、Hind Ⅲ、T4DNA鏈接酶、TaqDNA聚合酶和DL2000DNA分子量標(biāo)記購自北京天根生物有限公司；瓊脂凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取純化試劑盒、RNA抽提及逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）試劑盒購自Fermentas公司，兔抗人Beclin1多克隆抗體購自大連寶生物公司，所有DNA序列均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC-1-B購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院上海細(xì)胞庫，實(shí)驗(yàn)涉及各種酶類為NEB產(chǎn)品，嘌呤霉素為sigma產(chǎn)品，胎牛血清（FBS）購自杭州四季青生物制品公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)和子宮內(nèi)膜細(xì)胞Beclin1基因擴(kuò)增 在NCBI數(shù)據(jù)庫中查找Beclin1的mRNA全序列，基因編號(hào)NM003766；根據(jù)其cDNA全長序列，參照國際流行標(biāo)準(zhǔn)，利用Invivogen公司的在線軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，選取編碼區(qū)兩側(cè)的堿基合成相應(yīng)的引物。上游引物序列（上游）5′-ATCCTGGACCGTGTCACCATACAGT-3′，（下游）5′-GTTGAGCTGAGTGTCCAGCTGT-3′，分別含有EcoRI、Hind Ⅲ酶切點(diǎn)位，目的片段為326 bp。按T/A克隆操作規(guī)范，參照Trizol試劑盒說明書提取人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株HEC總RNA，利用蛋白核酸分析儀測(cè)定RNA純度及濃度，通過1%瓊脂糖電泳鑒定RNA完整性；取300 ng總RNA，根據(jù)RT-PCR試劑盒說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成Beclin1DNA；PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min、55 ℃退火1.5 min、72 ℃延伸0.5 min，共30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃再延伸6 min終止。取PCR最終產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，切取326 bp目的片段凝膠，利用試劑盒回收純化目的片段。

1.2.2 構(gòu)建Beclin1表達(dá)質(zhì)粒 經(jīng)EcoRI、HindⅢ雙酶切后，再將插入片段定向插入真核載體pcDNA3.1的相應(yīng)位點(diǎn)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑選單菌落，利用T/A法重組克隆提取質(zhì)粒，用EcoRI、Hind Ⅲ雙切酶鑒定，陽性克隆命名為pcDNA3.1-Beclin1。為檢測(cè)目的基因是否正確插入載體以及有無基因突變的產(chǎn)生，陽性克隆送上海生物有限公司測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果通過blast比對(duì)，完全正確的質(zhì)粒命名為pcDNA3.1-Beclin1.

1.2.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEC細(xì)胞 設(shè)立實(shí)驗(yàn)組（轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Beclin1）、空質(zhì)粒對(duì)照組（轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載體）、空白對(duì)照組（脂質(zhì)體組），體外傳代培養(yǎng)HEC細(xì)胞，采用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，將細(xì)胞稀釋為3×105/mL接種于6孔板，細(xì)胞密度到70%時(shí)，利用脂質(zhì)介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Beclin1重組質(zhì)粒；轉(zhuǎn)染后5 h換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。Western blot法測(cè)定HEC中Beclin1的含量，按試劑盒說明書操作，利用圖像分析系統(tǒng)對(duì)相應(yīng)分子量目的條帶進(jìn)行定性分析。

1.2.4 MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞活性 在轉(zhuǎn)染后24、48和72 h每孔加入MTT溶液（5 mg.rnL-1用PBS配制，pH=7.4）20 μL，繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜（DMSO），置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解；在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490 nm波長處，測(cè)量各孔的吸光值，重復(fù)6次，記錄結(jié)果，繪制細(xì)胞生長曲線。endprint

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 13.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，Western blot法測(cè)量結(jié)果采用重復(fù)測(cè)量方差分析（ANOVA）；計(jì)量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用 字2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Beclin1基因擴(kuò)增 T/A克隆PCR擴(kuò)增，從人子宮內(nèi)膜癌HEC細(xì)胞提取，經(jīng)鑒定其純度和完整性均較好，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳得到約326 bp的特異條帶，與預(yù)期擴(kuò)增片段大小相符，見圖1。

2.2 重組載體鑒定結(jié)果 將構(gòu)建的pcDNA3.1-Beclin1重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定，測(cè)序結(jié)果與設(shè)計(jì)一致，見圖2。

2.3 轉(zhuǎn)染HEC細(xì)胞中pcDNA3.1-Beclin1表達(dá)測(cè)定 分別提取轉(zhuǎn)染組、空載體組及對(duì)照組HEC細(xì)胞總蛋白，Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染組條帶明顯增粗，提示有外源的Beclin1高表達(dá)，見圖3。用熒光顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)染數(shù)小時(shí)后即可見到部分細(xì)胞表達(dá)Beclin1，在4 h之內(nèi)表達(dá)Beclin1的HEC細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，在48 h達(dá)到高峰，其pcDNA3.1-Beclin1轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量明亮的綠色熒光，陰性對(duì)照組（空載體組）熒光表達(dá)百分率約為4.8%，轉(zhuǎn)染組熒光表達(dá)百分率約為72.0%，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效率70.0%，可以滿足實(shí)驗(yàn)需要，見圖4。

2.4 MTT檢測(cè)轉(zhuǎn)染HEC細(xì)胞增殖狀態(tài) MTT結(jié)果顯示，pcDNA3.1-Belin1轉(zhuǎn)染組與陰性對(duì)照組（脂質(zhì)體組）及pcDNA3.1空載體組間HEB細(xì)胞相比吸光度值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；陰性對(duì)照組織（脂質(zhì)體組）與空載體對(duì)照組HEC細(xì)胞相比，吸光度值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表1。描繪細(xì)胞曲線顯示轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Beclin1載體的子宮內(nèi)膜癌HEC細(xì)胞生長有明顯抑制，實(shí)驗(yàn)組織HEC細(xì)胞增殖明顯低于對(duì)照組。

3 討論

Beclin1位于人類染色體17q21上，大約有150 kb，最初是由學(xué)者在致死性Sindbis病毒性腦炎的研究中被發(fā)現(xiàn)的，被認(rèn)為是一種雙等位抑癌基因（hapliinsufficient tumor suppressor），其雜合性缺失是細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的原因之一[3]。據(jù)研究，自噬基因通過自噬作用、抑制基因空突變、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制血管構(gòu)建而抑制腫瘤的發(fā)生。據(jù)報(bào)道75%的人類卵巢癌、50%乳腺癌和40%的前列腺癌細(xì)胞存在Beclin1單等位基因缺失突變，其表達(dá)量不同程度下降[4-6]。王贊宏等[7]通過研究發(fā)現(xiàn)，自噬基因Beclin1抑制人宮頸癌HeLa細(xì)胞的生長，降低其致瘤活性，抑制腫瘤細(xì)胞的惡性增殖，誘導(dǎo)自噬和凋亡，抑制腫瘤的生長。

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率呈明顯上升和年輕化趨勢(shì)。有關(guān)子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機(jī)制仍不完全清楚，目前認(rèn)為多基因、多階段的癌基因或抑癌基因突變構(gòu)成其發(fā)生和發(fā)展的分子基礎(chǔ)。針對(duì)子宮內(nèi)膜癌的Beclin1基因研究目前較為少見，浙江醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院趙劍虹等[8]通過免疫組化的研究方法發(fā)現(xiàn)，Beclin1蛋白在正常子宮內(nèi)膜組織、良性增殖的子宮內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜癌組織中表達(dá)率逐漸下降且呈顯著差異性，Beclin1蛋白表達(dá)程度與子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞分化、組織學(xué)類型相關(guān)，而與手術(shù)病理分期和肌層浸潤深度無關(guān)。本課題組通過免疫組化實(shí)驗(yàn)證實(shí)：Beclin1蛋白在正常子宮內(nèi)膜組織、良性增殖的子宮內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜癌組織中表達(dá)率下降，呈顯著差異性，與趙劍虹等[8]實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。為更好的研究Beclin1蛋白表達(dá)程度只與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，筆者設(shè)計(jì)研究方案，用RT-PCR、T/A成功克隆擴(kuò)增出Beclin1基因，成功構(gòu)建了Beclin1的真核表達(dá)載體pcDNA3.1-Beclin1，MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染外源性Beclin1基因后，實(shí)驗(yàn)組HEC細(xì)胞生長速率較其他兩組明顯減慢。Western blot法測(cè)定HEC中Beclin1的含量，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)量并紀(jì)錄結(jié)果、繪制細(xì)胞生長曲線顯示，當(dāng)自噬基因Beclin1表達(dá)水平升高后，凋亡的細(xì)胞明顯上升；提示Beclin1基因可通過自噬調(diào)控，進(jìn)而影響子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展及臨床預(yù)后，以Bcelin1基因?yàn)橹委煱悬c(diǎn)，可為子宮內(nèi)膜癌的治療提供廣闊的視角。

綜上所述，結(jié)合本研究，Beclin1的表達(dá)程度與許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程相關(guān)[9]。因此，根據(jù)腫瘤發(fā)生的不同時(shí)期，調(diào)節(jié)Beclin1的表達(dá)，對(duì)于制定腫瘤的預(yù)防和治療方案極為重要，在子宮內(nèi)膜癌的治療中，基于Beclin1的靶向治療可成為一種新的探討方向，全面闡明Beclin1的功能、機(jī)制及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，必將有助于理解子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展規(guī)律，并有效指導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌的臨床診治。

參考文獻(xiàn)

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（收稿日期：2014-01-26） （本文編輯：黃新珍）endprint

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 13.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，Western blot法測(cè)量結(jié)果采用重復(fù)測(cè)量方差分析（ANOVA）；計(jì)量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用 字2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Beclin1基因擴(kuò)增 T/A克隆PCR擴(kuò)增，從人子宮內(nèi)膜癌HEC細(xì)胞提取，經(jīng)鑒定其純度和完整性均較好，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳得到約326 bp的特異條帶，與預(yù)期擴(kuò)增片段大小相符，見圖1。

2.2 重組載體鑒定結(jié)果 將構(gòu)建的pcDNA3.1-Beclin1重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定，測(cè)序結(jié)果與設(shè)計(jì)一致，見圖2。

2.3 轉(zhuǎn)染HEC細(xì)胞中pcDNA3.1-Beclin1表達(dá)測(cè)定 分別提取轉(zhuǎn)染組、空載體組及對(duì)照組HEC細(xì)胞總蛋白，Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染組條帶明顯增粗，提示有外源的Beclin1高表達(dá)，見圖3。用熒光顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)染數(shù)小時(shí)后即可見到部分細(xì)胞表達(dá)Beclin1，在4 h之內(nèi)表達(dá)Beclin1的HEC細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，在48 h達(dá)到高峰，其pcDNA3.1-Beclin1轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量明亮的綠色熒光，陰性對(duì)照組（空載體組）熒光表達(dá)百分率約為4.8%，轉(zhuǎn)染組熒光表達(dá)百分率約為72.0%，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效率70.0%，可以滿足實(shí)驗(yàn)需要，見圖4。

2.4 MTT檢測(cè)轉(zhuǎn)染HEC細(xì)胞增殖狀態(tài) MTT結(jié)果顯示，pcDNA3.1-Belin1轉(zhuǎn)染組與陰性對(duì)照組（脂質(zhì)體組）及pcDNA3.1空載體組間HEB細(xì)胞相比吸光度值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；陰性對(duì)照組織（脂質(zhì)體組）與空載體對(duì)照組HEC細(xì)胞相比，吸光度值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表1。描繪細(xì)胞曲線顯示轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Beclin1載體的子宮內(nèi)膜癌HEC細(xì)胞生長有明顯抑制，實(shí)驗(yàn)組織HEC細(xì)胞增殖明顯低于對(duì)照組。

3 討論

Beclin1位于人類染色體17q21上，大約有150 kb，最初是由學(xué)者在致死性Sindbis病毒性腦炎的研究中被發(fā)現(xiàn)的，被認(rèn)為是一種雙等位抑癌基因（hapliinsufficient tumor suppressor），其雜合性缺失是細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的原因之一[3]。據(jù)研究，自噬基因通過自噬作用、抑制基因空突變、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制血管構(gòu)建而抑制腫瘤的發(fā)生。據(jù)報(bào)道75%的人類卵巢癌、50%乳腺癌和40%的前列腺癌細(xì)胞存在Beclin1單等位基因缺失突變，其表達(dá)量不同程度下降[4-6]。王贊宏等[7]通過研究發(fā)現(xiàn)，自噬基因Beclin1抑制人宮頸癌HeLa細(xì)胞的生長，降低其致瘤活性，抑制腫瘤細(xì)胞的惡性增殖，誘導(dǎo)自噬和凋亡，抑制腫瘤的生長。

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率呈明顯上升和年輕化趨勢(shì)。有關(guān)子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機(jī)制仍不完全清楚，目前認(rèn)為多基因、多階段的癌基因或抑癌基因突變構(gòu)成其發(fā)生和發(fā)展的分子基礎(chǔ)。針對(duì)子宮內(nèi)膜癌的Beclin1基因研究目前較為少見，浙江醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院趙劍虹等[8]通過免疫組化的研究方法發(fā)現(xiàn)，Beclin1蛋白在正常子宮內(nèi)膜組織、良性增殖的子宮內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜癌組織中表達(dá)率逐漸下降且呈顯著差異性，Beclin1蛋白表達(dá)程度與子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞分化、組織學(xué)類型相關(guān)，而與手術(shù)病理分期和肌層浸潤深度無關(guān)。本課題組通過免疫組化實(shí)驗(yàn)證實(shí)：Beclin1蛋白在正常子宮內(nèi)膜組織、良性增殖的子宮內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜癌組織中表達(dá)率下降，呈顯著差異性，與趙劍虹等[8]實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。為更好的研究Beclin1蛋白表達(dá)程度只與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，筆者設(shè)計(jì)研究方案，用RT-PCR、T/A成功克隆擴(kuò)增出Beclin1基因，成功構(gòu)建了Beclin1的真核表達(dá)載體pcDNA3.1-Beclin1，MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染外源性Beclin1基因后，實(shí)驗(yàn)組HEC細(xì)胞生長速率較其他兩組明顯減慢。Western blot法測(cè)定HEC中Beclin1的含量，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)量并紀(jì)錄結(jié)果、繪制細(xì)胞生長曲線顯示，當(dāng)自噬基因Beclin1表達(dá)水平升高后，凋亡的細(xì)胞明顯上升；提示Beclin1基因可通過自噬調(diào)控，進(jìn)而影響子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展及臨床預(yù)后，以Bcelin1基因?yàn)橹委煱悬c(diǎn)，可為子宮內(nèi)膜癌的治療提供廣闊的視角。

綜上所述，結(jié)合本研究，Beclin1的表達(dá)程度與許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程相關(guān)[9]。因此，根據(jù)腫瘤發(fā)生的不同時(shí)期，調(diào)節(jié)Beclin1的表達(dá)，對(duì)于制定腫瘤的預(yù)防和治療方案極為重要，在子宮內(nèi)膜癌的治療中，基于Beclin1的靶向治療可成為一種新的探討方向，全面闡明Beclin1的功能、機(jī)制及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，必將有助于理解子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展規(guī)律，并有效指導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌的臨床診治。

參考文獻(xiàn)

[1]程秋蓉，馬玲，羅雪梅，等.子宮內(nèi)膜癌ER、PR的表達(dá)及其臨床意義[J].中國實(shí)用醫(yī)藥雜志，2008，15（1）：1-2.

[2] Zou L B， Zhang R J， Tan Y J， et al.Identification of estrogen response element in the aquaporin-2 gene that mediates estrogen-induced cell migration and invasion in human endometrial carcinoma[J].J Clin Endocrinol Metab， 2011， 96（9）： 1399-1408.

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[4] Tangir J， Muto M G， Bercowitze R S， et al. A400 kb novel deletion unit centromeric to the BRCAI gene in sporadic epithelial ovarian cancer[J]. Oncogene， 1996， 12（4）： 735-740.

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[8]趙劍虹，萬小云，謝幸，等.Beclin1、PTEN在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)[J].癌癥雜志，2006，25（6）：753-757.

[9]王霞，郭娜，彌曼，等.Beclinl與腫瘤研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代腫瘤學(xué)雜志，2013，21（5）：1149-1151.

（收稿日期：2014-01-26） （本文編輯：黃新珍）endprint

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 13.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，Western blot法測(cè)量結(jié)果采用重復(fù)測(cè)量方差分析（ANOVA）；計(jì)量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用 字2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Beclin1基因擴(kuò)增 T/A克隆PCR擴(kuò)增，從人子宮內(nèi)膜癌HEC細(xì)胞提取，經(jīng)鑒定其純度和完整性均較好，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳得到約326 bp的特異條帶，與預(yù)期擴(kuò)增片段大小相符，見圖1。

2.2 重組載體鑒定結(jié)果 將構(gòu)建的pcDNA3.1-Beclin1重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定，測(cè)序結(jié)果與設(shè)計(jì)一致，見圖2。

2.3 轉(zhuǎn)染HEC細(xì)胞中pcDNA3.1-Beclin1表達(dá)測(cè)定 分別提取轉(zhuǎn)染組、空載體組及對(duì)照組HEC細(xì)胞總蛋白，Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染組條帶明顯增粗，提示有外源的Beclin1高表達(dá)，見圖3。用熒光顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)染數(shù)小時(shí)后即可見到部分細(xì)胞表達(dá)Beclin1，在4 h之內(nèi)表達(dá)Beclin1的HEC細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，在48 h達(dá)到高峰，其pcDNA3.1-Beclin1轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量明亮的綠色熒光，陰性對(duì)照組（空載體組）熒光表達(dá)百分率約為4.8%，轉(zhuǎn)染組熒光表達(dá)百分率約為72.0%，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效率70.0%，可以滿足實(shí)驗(yàn)需要，見圖4。

2.4 MTT檢測(cè)轉(zhuǎn)染HEC細(xì)胞增殖狀態(tài) MTT結(jié)果顯示，pcDNA3.1-Belin1轉(zhuǎn)染組與陰性對(duì)照組（脂質(zhì)體組）及pcDNA3.1空載體組間HEB細(xì)胞相比吸光度值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；陰性對(duì)照組織（脂質(zhì)體組）與空載體對(duì)照組HEC細(xì)胞相比，吸光度值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表1。描繪細(xì)胞曲線顯示轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Beclin1載體的子宮內(nèi)膜癌HEC細(xì)胞生長有明顯抑制，實(shí)驗(yàn)組織HEC細(xì)胞增殖明顯低于對(duì)照組。

3 討論

Beclin1位于人類染色體17q21上，大約有150 kb，最初是由學(xué)者在致死性Sindbis病毒性腦炎的研究中被發(fā)現(xiàn)的，被認(rèn)為是一種雙等位抑癌基因（hapliinsufficient tumor suppressor），其雜合性缺失是細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的原因之一[3]。據(jù)研究，自噬基因通過自噬作用、抑制基因空突變、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制血管構(gòu)建而抑制腫瘤的發(fā)生。據(jù)報(bào)道75%的人類卵巢癌、50%乳腺癌和40%的前列腺癌細(xì)胞存在Beclin1單等位基因缺失突變，其表達(dá)量不同程度下降[4-6]。王贊宏等[7]通過研究發(fā)現(xiàn)，自噬基因Beclin1抑制人宮頸癌HeLa細(xì)胞的生長，降低其致瘤活性，抑制腫瘤細(xì)胞的惡性增殖，誘導(dǎo)自噬和凋亡，抑制腫瘤的生長。

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率呈明顯上升和年輕化趨勢(shì)。有關(guān)子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機(jī)制仍不完全清楚，目前認(rèn)為多基因、多階段的癌基因或抑癌基因突變構(gòu)成其發(fā)生和發(fā)展的分子基礎(chǔ)。針對(duì)子宮內(nèi)膜癌的Beclin1基因研究目前較為少見，浙江醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院趙劍虹等[8]通過免疫組化的研究方法發(fā)現(xiàn)，Beclin1蛋白在正常子宮內(nèi)膜組織、良性增殖的子宮內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜癌組織中表達(dá)率逐漸下降且呈顯著差異性，Beclin1蛋白表達(dá)程度與子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞分化、組織學(xué)類型相關(guān)，而與手術(shù)病理分期和肌層浸潤深度無關(guān)。本課題組通過免疫組化實(shí)驗(yàn)證實(shí)：Beclin1蛋白在正常子宮內(nèi)膜組織、良性增殖的子宮內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜癌組織中表達(dá)率下降，呈顯著差異性，與趙劍虹等[8]實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。為更好的研究Beclin1蛋白表達(dá)程度只與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，筆者設(shè)計(jì)研究方案，用RT-PCR、T/A成功克隆擴(kuò)增出Beclin1基因，成功構(gòu)建了Beclin1的真核表達(dá)載體pcDNA3.1-Beclin1，MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染外源性Beclin1基因后，實(shí)驗(yàn)組HEC細(xì)胞生長速率較其他兩組明顯減慢。Western blot法測(cè)定HEC中Beclin1的含量，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)量并紀(jì)錄結(jié)果、繪制細(xì)胞生長曲線顯示，當(dāng)自噬基因Beclin1表達(dá)水平升高后，凋亡的細(xì)胞明顯上升；提示Beclin1基因可通過自噬調(diào)控，進(jìn)而影響子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展及臨床預(yù)后，以Bcelin1基因?yàn)橹委煱悬c(diǎn)，可為子宮內(nèi)膜癌的治療提供廣闊的視角。

綜上所述，結(jié)合本研究，Beclin1的表達(dá)程度與許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程相關(guān)[9]。因此，根據(jù)腫瘤發(fā)生的不同時(shí)期，調(diào)節(jié)Beclin1的表達(dá)，對(duì)于制定腫瘤的預(yù)防和治療方案極為重要，在子宮內(nèi)膜癌的治療中，基于Beclin1的靶向治療可成為一種新的探討方向，全面闡明Beclin1的功能、機(jī)制及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，必將有助于理解子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展規(guī)律，并有效指導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌的臨床診治。

參考文獻(xiàn)

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[6] Cuervo A M，Dice J F，Knecht E， et al.A receptor for the se1ective uptake and degradation of proteins by lysosomes[J].Science， 1996， 273（26）： 501-503.

[7]王贊宏，李莉，彭芝蘭，等.自噬基因Beclin1對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞生長影響的體內(nèi)外研究[J].中華腫瘤學(xué)雜志，2011，33（11）：804-809.

[8]趙劍虹，萬小云，謝幸，等.Beclin1、PTEN在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)[J].癌癥雜志，2006，25（6）：753-757.

[9]王霞，郭娜，彌曼，等.Beclinl與腫瘤研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代腫瘤學(xué)雜志，2013，21（5）：1149-1151.

（收稿日期：2014-01-26） （本文編輯：黃新珍）endprint