凝膠注入系統(tǒng)在DNA分型中的影響分析及解決方法

常海龍 公安部第一研究所

一、引言

DNA分型自20世紀(jì)80年代中期問世以來，在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域引發(fā)了革命性的變革，極大提高了執(zhí)法部門根據(jù)現(xiàn)場搜尋罪犯的能力。DNA分型就是通過對遺傳物質(zhì)DNA序列多態(tài)性及長度多態(tài)性的檢驗來進(jìn)行法醫(yī)學(xué)的個體識別及親權(quán)鑒定。如今，該技術(shù)已經(jīng)成為法醫(yī)物證檢驗的常規(guī)技術(shù)，為打擊違法犯罪提供了強有力的武器。

毛細(xì)管凝膠電泳是目前應(yīng)用最為廣泛、技術(shù)最為成熟的主流DNA分型技術(shù)，被全世界范圍內(nèi)的法醫(yī)學(xué)DNA實驗室廣泛采用。毛細(xì)管凝膠電泳向毛細(xì)管柱中充入凝膠聚合物等篩分介質(zhì)，通過建立高壓直流電場驅(qū)動帶負(fù)電的DNA片段，通過篩分介質(zhì)，對DNA片段按其大小進(jìn)行篩分分離。

公安部第一研究所在國家十一五課題“法醫(yī)DNA專用檢測硬件平臺關(guān)鍵技術(shù)研究”的支撐下，成功研制了基于毛細(xì)管凝膠電泳的GA118-16A遺傳分析儀，其中凝膠注入系統(tǒng)是具有自主知識產(chǎn)權(quán)的關(guān)鍵核心部件。本文對凝膠注入系統(tǒng)工作原理及對DNA分型結(jié)果影響要素進(jìn)行分析，結(jié)合在凝膠注入系統(tǒng)研制過程及產(chǎn)業(yè)化過程中遇到的常見問題，提出解決方法，期待對公安系統(tǒng)廣大法醫(yī)工作者有所幫助，以更好應(yīng)用遺傳分析儀，為打擊違法犯罪提供更加高效的手段。

二、DNA分型原理及常用篩分介質(zhì)

理想的DNA分離介質(zhì)應(yīng)具備以下幾種性質(zhì)：（1）高親水性，（2）良好的溶解能力，（3）良好的篩分性能，（4）在堿性條件下仍具有很好的化學(xué)穩(wěn)定性，（5）具有動態(tài)涂層能力以抑制電滲流及消除DNA和毛細(xì)管管壁的吸附作用。

毛細(xì)管凝膠電泳最常采用聚二甲基丙烯酰胺POP-4和POP-7聚合物用于DNA分型。聚二甲基丙烯酰胺有一定的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，是由聚丙烯酰胺和交聯(lián)共聚單體N，N’-甲叉雙丙烯酰胺在TEMED催化下聚合交聯(lián)形成的，其孔徑與鏈長度和交聯(lián)度有關(guān)。

聚二甲基丙烯酰胺的優(yōu)點是吸附很小，能夠有效消除毛細(xì)管電滲現(xiàn)象；減小分子擴(kuò)散，抗對流；具有分子篩效應(yīng)，遷移時間能反映組分分子量大??；在一定溫度范圍內(nèi)透明，便于觀察和實現(xiàn)樣品的光學(xué)檢測。但其制備復(fù)雜、產(chǎn)生氣泡會中斷電路，一些大分子積留會影響毛細(xì)管柱的壽命，影響聚合物的動態(tài)涂層能力和降低聚合物的黏度。

三、凝膠注入系統(tǒng)的組成及工作原理

要實現(xiàn)毛細(xì)管電泳的DNA分型，首先必須將聚二甲基丙烯酰胺等篩分介質(zhì)注入內(nèi)徑僅為50μm的毛細(xì)管，這需要系統(tǒng)提供很高的壓強，凝膠注入系統(tǒng)正是為實現(xiàn)這一功能而設(shè)計的。該系統(tǒng)由精密分配泵、針閥系統(tǒng)、下膠塊、凝膠瓶、高壓電極、毛細(xì)管等組成，系統(tǒng)工作介質(zhì)為聚二甲基丙烯酰胺凝膠。精密分配泵提供動力源，將凝膠瓶中的凝膠吸入泵倉。凝膠瓶管路末端接上單向閥，當(dāng)精密分配泵的柱塞向下運動時，單向閥關(guān)閉。若此時針閥系統(tǒng)打開，即下膠塊管路開通，由于毛細(xì)管的流體阻力遠(yuǎn)大于下膠塊管路，凝膠將向下膠塊管路流動，在排除氣泡過程中經(jīng)常應(yīng)用此操作。當(dāng)針閥系統(tǒng)關(guān)閉時，即下膠塊管路閉合，凝膠將向毛細(xì)管中運動，向毛細(xì)管中注入凝膠，從而實現(xiàn)毛細(xì)管的自動注膠功能。該系統(tǒng)組成參見圖2。

該系統(tǒng)具有氣泡排除功能。由于凝膠自身混有一定的氣泡，同時在更換凝膠的過程中，不可避免的會帶入氣泡。氣泡的存在將阻斷電泳通路或使通路不穩(wěn)定。因此，當(dāng)凝膠注入系統(tǒng)中有氣泡時，必須運行該系統(tǒng)的排氣泡操作，確保注入毛細(xì)管中的凝膠沒有氣泡。

為實現(xiàn)凝膠注入和排除氣泡操作，凝膠注入系統(tǒng)在下膠塊位置設(shè)計了針閥系統(tǒng)，這個子系統(tǒng)由電磁鐵、針閥銷、針閥構(gòu)成，其組成見圖3。當(dāng)需要閉合針閥系統(tǒng)時，電磁鐵關(guān)閉，電磁鐵帶動針閥銷轉(zhuǎn)動，使針閥向下運動，與下膠塊的錐形孔形成緊密配合。為了緩沖電磁鐵閉合時針閥對下膠塊的沖擊，在電磁鐵與針閥銷之間設(shè)置了一個彈簧及調(diào)節(jié)螺釘，當(dāng)電磁鐵閉合時，彈簧起到一定的緩沖作用，并為針閥與下膠塊的閉合提供密封壓強。

四、DNA分型中凝膠注入系統(tǒng)的影響分析及解決方法

作為基于毛細(xì)管電泳的DNA檢測儀的重要組成部分，凝膠注入系統(tǒng)的工作狀態(tài)直接影響到DNA的檢測結(jié)果。以下是DNA檢測過程中遇到的相關(guān)問題及解決方法：

為進(jìn)一步確保城區(qū)河道的行洪安全、維護(hù)河道生態(tài)健康、美化水城環(huán)境，臨沂市在沂河干支流上科學(xué)規(guī)劃建設(shè)了一系列橡膠壩和攔河閘，并通過建設(shè)開通河道間調(diào)水工程，構(gòu)建城市水網(wǎng)，實現(xiàn)城區(qū)河道間生態(tài)用水的優(yōu)化配置，促進(jìn)水網(wǎng)內(nèi)的水循環(huán)，實現(xiàn)了臨沂城區(qū)的水資源優(yōu)化配置、防洪安全和水系生態(tài)安全。

（一）凝膠注入系統(tǒng)氣泡排除問題及解決方法

凝膠注入系統(tǒng)一個重要的功能就是將電泳通道中凝膠的氣泡排除。氣泡會阻斷電泳通路或改變電泳遷移率，導(dǎo)致嚴(yán)重的區(qū)帶擴(kuò)展，降低分辨力，影響DNA檢測結(jié)果。如果氣泡進(jìn)入毛細(xì)管中，直流高壓電場被切斷，電泳無法形成，不能通過篩分作用對DNA片段進(jìn)行分離；如果氣泡進(jìn)入集束端安裝位置或下膠塊管路中，會導(dǎo)致電泳通道變窄，電阻變大，電泳通道發(fā)熱，這將導(dǎo)致膠的黏度等性質(zhì)發(fā)生變化，從而改變DNA片段在電泳過程中的遷移率，影響分離效果，嚴(yán)重時會損壞集束端和下膠塊管路。

氣泡常出現(xiàn)的位置有三種情況：

1．凝膠瓶管路出現(xiàn)氣泡

在更換凝膠瓶的過程中可能會引入新的氣泡，氣泡位于凝膠瓶管路中，此時應(yīng)運行自動排氣泡程序排出氣泡。因此，在更換凝膠瓶之前，應(yīng)該將待用凝膠常溫靜置2小時以上，以使凝膠中的氣泡析出；同時在更換凝膠瓶的過程中避免劇烈操作，防止凝膠瓶管路中混入氣泡。

2．毛細(xì)管集束端出現(xiàn)氣泡

當(dāng)毛細(xì)管集束端位置紡錘體密封不嚴(yán)時，在集束端容易出現(xiàn)氣泡。毛細(xì)管集束端出現(xiàn)氣泡會導(dǎo)致高壓電泳通道電阻增大，氣泡位置發(fā)熱，從而影響DNA片段的遷移率，同時容易損壞集束端。此時應(yīng)該擰松手輪，運行精密分配泵，使精密分配泵柱塞向下運動，使氣泡隨凝膠從集束端排除。由于凝膠具有生物毒性，操作中應(yīng)佩戴手套操作，并使用滴水盤收集排除的凝膠。

3．下膠塊管路出現(xiàn)氣泡

當(dāng)陽極杯中的緩沖液沒有達(dá)到指定體積（即達(dá)到刻度線）時，由于下膠塊管路處于開放狀態(tài)，在溫度變化的時候氣泡容易進(jìn)入下膠塊管路。此處氣泡會導(dǎo)致下膠塊管路局部發(fā)熱，從而影響DNA片段的遷移率，同時容易損壞下膠塊管路。此時應(yīng)該運行精密分配泵，使精密分配泵柱塞向下運動，使氣泡隨凝膠從下膠塊排除。

（二）凝膠注入系統(tǒng)凝膠無法注入問題及解決方法

凝膠注入系統(tǒng)的主要功能是向毛細(xì)管中注入凝膠，在遺傳分析儀的使用過程中，由于各種因素的影響，會使凝膠注入系統(tǒng)無法正常工作。如果儀器繼續(xù)運行，毛細(xì)管內(nèi)殘留的廢膠會導(dǎo)致毛細(xì)管電泳過程中出現(xiàn)雜峰；同時會使DNA片段的遷移率變低，峰值變寬，DNA檢測過程無法正常完成。相關(guān)的問題原因及解決辦法如下：

1．如果凝膠瓶管路出現(xiàn)凝膠回流現(xiàn)象，則是單向閥出現(xiàn)故障

在發(fā)現(xiàn)凝膠注入系統(tǒng)出現(xiàn)無法注入凝膠的情況，首先應(yīng)該檢查凝膠瓶管路是否出現(xiàn)凝膠回流現(xiàn)象，如果出現(xiàn)，說明單向閥無法實現(xiàn)單向密封作用。單向閥內(nèi)部是由一個紅寶石球和藍(lán)寶石座組成的精密單向密封裝置，在長期不使用凝膠注入系統(tǒng)的時候，紅寶石球和藍(lán)寶石座由于凝膠干結(jié)附著在密封件表面，從而使單向閥失去單向密封能力。此時應(yīng)取下單向閥，用超純水潤洗單向閥，清洗完畢后，再重新吸入凝膠，完成凝膠注入工作。

2．如果水洗密封艙出現(xiàn)凝膠，說明高壓密封圈損壞

精密分配泵的高壓實現(xiàn)是由藍(lán)寶石柱塞和高壓密封圈配合實現(xiàn)，由于長時間工作，或者由于凝膠注入系統(tǒng)長期不工作導(dǎo)致凝膠干結(jié)在柱塞表面，在柱塞運動過程中可能會損壞高壓密封圈，使藍(lán)寶石柱塞與高壓密封圈之間出現(xiàn)泄漏，凝膠將從此位置泄漏到水洗密封艙內(nèi)。此時，應(yīng)該立即停止精密分配泵的操作，更換高壓密封圈。

3．如果下膠塊管路接頭處出現(xiàn)凝膠，說明下膠塊管路接頭密封不嚴(yán)

下膠塊管路接頭是凝膠注入系統(tǒng)實現(xiàn)高壓的一個關(guān)鍵部件，采用錐形密封頭配合精密分配泵及下膠塊實現(xiàn)密封，如果固定螺母沒足夠預(yù)壓力，就會出現(xiàn)凝膠泄漏現(xiàn)象。此時應(yīng)加大密封接頭固定螺母的擰緊力度，使其達(dá)到密封效果。

4．如果在毛細(xì)管集束端出現(xiàn)凝膠泄漏，說明毛細(xì)管集束端密封不嚴(yán)

毛細(xì)管集束端是與錐形紡錘體與手輪的配合實現(xiàn)密封，手輪依靠螺紋實現(xiàn)預(yù)緊力，紡錘體的兩端錐形面與精密分配泵和手輪密封面的配合實現(xiàn)高壓密封。此時，首先應(yīng)擰緊手輪，加大手輪的預(yù)緊力，以提高密封面的壓力；如果加大預(yù)緊力后仍然出現(xiàn)凝膠泄漏現(xiàn)象，則是紡錘體表面有殘留雜質(zhì)，應(yīng)取出紡錘體及手輪，超純水潤洗后，重新安裝毛細(xì)管集束端。

5．如果從陽極杯觀察到下膠塊有凝膠流出，說明下膠塊針閥密封不嚴(yán)

下膠塊針閥密封是依靠針閥的錐形面與下膠塊配合實現(xiàn)高壓密封，常見的泄漏情況有兩種：（1）由于磨損導(dǎo)致針閥壓力不夠。針閥和下膠塊均采用塑料制成，在長期開合過程中難免有一定的磨損，此時針閥與下膠塊的配合間隙加大，容易出現(xiàn)凝膠泄漏現(xiàn)象。遇到這種情況，應(yīng)該調(diào)節(jié)電磁鐵調(diào)節(jié)螺釘，增加電磁鐵與針閥銷之間彈簧的彈力，從而加大針閥與下膠塊配合的壓力，實現(xiàn)高壓密封。（2）下膠塊或針閥損壞。在磨損進(jìn)一步加大的情況下，由于下膠塊或者針閥磨損不規(guī)則性導(dǎo)致密封面無法緊密配合，此時加大彈簧彈力也無法實現(xiàn)高壓密封，應(yīng)更換下膠塊或者針閥。

6．大分子堵塞毛細(xì)管導(dǎo)致凝膠注入壓力過大

在毛細(xì)管長期使用過程中，一些大分子會殘留在毛細(xì)管內(nèi)壁，隨著時間的推移，積累越來越多，最終導(dǎo)致精密分配泵的壓力不足以將適量的凝膠注入到毛細(xì)管中。這種情況需要更換新的毛細(xì)管，再進(jìn)行凝膠注入。

五、結(jié)論

凝膠注入系統(tǒng)是遺傳分析儀的重要組成部分，凝膠注入的性能對DNA分型結(jié)果產(chǎn)生顯著影響，關(guān)系到設(shè)備整體工作成本、效率和使用壽命。要使凝膠注入系統(tǒng)盡可能長時間地保持安全、高效的工作狀態(tài)，就一定要保證凝膠注入的質(zhì)量，科學(xué)合理地解決在使用中遇到的問題。

本文結(jié)合在凝膠注入系統(tǒng)研制和產(chǎn)業(yè)化過程中遇到的問題，對凝膠注入系統(tǒng)的工作原理進(jìn)行分析，提出了法醫(yī)DNA工作人員常見問題出現(xiàn)的原因及解決方法。經(jīng)過大量實踐驗證，上述方法能夠有效解決凝膠注入系統(tǒng)工作中遇到的問題，保證遺傳分析儀高效穩(wěn)定地工作。

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