小牛腸堿性磷酸酶活性檢測(cè)方法的建立

賴曉芳，林 霖，李 意，劉奕雄，蘭全學(xué)，賴心田，楊國(guó)武

(深圳市計(jì)量質(zhì)量檢測(cè)研究院，廣東深圳 518131)

堿性磷酸酶在科研上的應(yīng)用目前主要集中在用于DNA片段的去磷酸化，即從核酸中去除5’磷酸以減少質(zhì)粒載體在連接反應(yīng)中的環(huán)化，使DNA易受或抵抗某些作用于核酸的酶。堿性磷酸酶根據(jù)其來(lái)源不同分為小牛腸堿性磷酸酶、蝦源堿性磷酸酶和細(xì)菌源堿性磷酸酶等［1］。其中，小牛腸堿性磷酸酶為目前科研中最常用的且最容易購(gòu)買到的，其活性部位由Asp101-Ser102-Ala103、3個(gè)在空間上相靠近的金屬離子及配體、Arg166及其他一些相鄰氨基酸殘基組成［1-2］。最佳反應(yīng)pH取決于反應(yīng)底物以及反應(yīng)底物濃度和所選擇的緩沖液類型，然而堿性磷酸酶對(duì)于各種已知的緩沖液及底物，其最適酶活 pH 不低于 8.0［3］。

堿性磷酸酶測(cè)定常用的緩沖體系分為激活型、抑制型和惰性型3類，其測(cè)定結(jié)果差異很大，其主要原因是其緩沖體系不僅具有緩沖作用，還可作為磷酸?；氖荏w，提高酶促反應(yīng)的速度，從而導(dǎo)致了測(cè)定結(jié)果的差異［4］。磷性磷酸酶檢驗(yàn)方法有化學(xué)抑制法、電泳法、免疫法、分光光度法等，前2種方法的靈敏度和特異性較低，免疫法雖有較高的靈敏性和特異性但操作復(fù)雜耗時(shí)，而基于堿性磷酸酶活力的分光光度法更加方便和快捷［5］?？蒲杏眯∨Ｄc堿性磷酸酶目前國(guó)內(nèi)外均無(wú)專門的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。國(guó)內(nèi)關(guān)于堿性磷酸酶活性檢測(cè)的現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)有NY/T 801-2004《生鮮牛乳及其制品中堿性磷酸酶活度的測(cè)定方法》［6］、WS/T 351-2011《堿性磷酸酶(ALP)催化活性濃度測(cè)定參考方法》［7］，這2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)中采用的底物、緩沖液和酶活單位定義均大不相同。

由于NY/T 801-2004中檢測(cè)對(duì)象為牛乳因此需要大量使用揮發(fā)性有機(jī)試劑正丁醇，對(duì)通常以毫克級(jí)別提供的科研用小牛腸堿性磷酸酶極不合適;WS/T 351-2011檢測(cè)對(duì)象為血清，因此對(duì)試驗(yàn)環(huán)境條件控制嚴(yán)格，對(duì)分光光度計(jì)要求配制恒溫模塊，恒溫模塊價(jià)格昂貴，普通實(shí)驗(yàn)室難以達(dá)到［6-7］。由于科研中常用Tris·HCl緩沖液，與標(biāo)準(zhǔn)中所用不同會(huì)造成檢測(cè)結(jié)果的偏差，因此有必要建立與科研中使用條件一致的檢測(cè)方法。筆者比較科研中小牛腸堿性磷酸酶反應(yīng)條件以及現(xiàn)有酶活性檢測(cè)方法與條件，建立了一套適用于科研用小牛腸堿性磷酸酶活性的檢測(cè)方法，以有助于統(tǒng)一科研中使用的小牛腸堿性磷酸酶活單位，從而保證試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 碳酸鈉，購(gòu)自西隴化工股份有限公司;碳酸氫鈉，購(gòu)自天津市紅巖化學(xué)試劑廠;Tris base，購(gòu)自深圳新拓?fù)渖锟萍加邢薰?磷酸苯二鈉鹽水合物(98%)，購(gòu)自阿法埃莎化學(xué)有限公司;鐵氰化鉀，購(gòu)自天津市紅巖化學(xué)試劑廠;硼酸，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)有限公司;氫氧化鈉，購(gòu)自天津市紅巖化學(xué)試劑廠;4-氨基安替比林，購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;無(wú)水苯酚，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)有限公司;氯化鎂，購(gòu)自西隴化工股份有限公司;氯化鋅，購(gòu)自西隴化工股份有限公司;氯化鉀，購(gòu)自西隴化工股份有限公司;甘油(純度99.9%)，購(gòu)自Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(DU730型)，為美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司產(chǎn)品。(試驗(yàn)使用1 cm光徑、4 ml容量的石英比色皿。)

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 酶活性的檢測(cè)方法。①在空白管:加入1.0 ml 0.04 mol/L磷酸苯二鈉，37℃預(yù)熱5 min;加入1.0 ml 0.01 mol/L Tris·HCl緩沖液(pH 8.0)，混勻后37℃中水浴10 min;加入1.0 ml 0.5 mol/L NaOH溶液、1.0 ml 4-氨基安替比林、2.0 ml鐵氰化鉀溶液，立即混勻。②在反應(yīng)管中加入1.0 ml 0.04 mol/L磷酸苯二鈉，37℃預(yù)熱5 min;加入1.0 ml酶液，混勻后37℃水浴10 min;加入1.0 ml 0.5 mol/L NaOH溶液、1.0 ml 4-氨基安替比林、2.0 ml鐵氰化鉀溶液，立即混勻。使用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)于波長(zhǎng)510 nm處，以零號(hào)管為空白，讀取各管吸光度，繪制校正曲線。

酶活單位定義(Defined enzyme unit，DEU):在37℃0.01 mol/L Tris·HCl緩沖液(pH8.0)中，1 min水解磷酸苯二鈉產(chǎn)生1 μg苯酚。比活力單位為DEU/mg或DEU/ml。

鐵氰化鉀溶液的配制:稱取鐵氰化鉀2.5 g和硼酸17 g，各自溶于去離子水400 ml中，混合后加入去離子水至1 000 ml，置于棕色瓶中避光保存(如出現(xiàn)藍(lán)綠色立即棄去)。4-氨基安替比林溶液的配制:稱取4-氨基安替比林1.5 g，加去離子水溶解至500 ml置于棕色瓶中保存。

1.3.2 酶液稀釋。酶活性檢測(cè)影響試驗(yàn)所用酶為NEB M0290S小牛腸堿性磷酸酶(明示酶活為10 000 U/ml)，吸取10 μl酶液置于 990 μl堿性磷酸酶貯備液(10 mmol/L Tris·HCl(pH 8.0)，50 mmol/L KCl，1 mmol/L MgCl，0.1 mmol/L ZnCl2，50%甘油)中，制成 NEB的酶母液(100 U/ml)，置于-20℃冰箱備用。使用0.1 mol/L碳酸鹽緩沖液(pH 10.2)、Tris·HCl緩沖液(pH 8.0)分別對(duì)母液中的酶進(jìn)行稀釋，直至明示酶活分別如表1所示。

表1 酶液稀釋度

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。

1.3.3.1 1 mg/ml酚標(biāo)準(zhǔn)貯存液的制備。稱取重蒸餾苯酚1.0 g，溶解于0.1 mol/L鹽酸中，并定容至1 000 ml。

1.3.3.2 0.05 mg/ml酚標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液的制備。取上述酚標(biāo)準(zhǔn)貯存液5 ml，加去離子水定容至100 ml。此溶液只能保存2～3 d。按表2添加各溶液，立即混勻，于510 nm處，以零號(hào)管為空白，讀取各管吸光度，繪制校正曲線。

表2 各溶液的配制ml

1.3.4 緩沖液更換對(duì)酶活檢測(cè)的影響試驗(yàn)。反應(yīng)酶液按照“1.3.2”配制。按“1.3.1”中方法進(jìn)行酶活性檢測(cè)，比較Tris·HCl緩沖液(pH 8.0)和0.1 mol/L碳酸鹽緩沖液(pH 10.2)的中酶活性變化。各酶活梯度檢測(cè)時(shí)設(shè)置2個(gè)重復(fù)。

1.3.5 靜止時(shí)間對(duì)酶活檢測(cè)的影響試驗(yàn)。按“1.3.1”中方法進(jìn)行酶活性檢測(cè)。加入鐵氰化鉀后分別靜止0、5、10 min進(jìn)行酶活性檢測(cè)，分別采用鐵氰化鉀溶液和加硼酸的鐵氰化鉀溶液(每1 L含硼酸17 g)測(cè)定。各個(gè)酶活梯度檢測(cè)時(shí)設(shè)置2個(gè)重復(fù)。

1.3.6 水浴時(shí)間對(duì)酶活性檢測(cè)的影響試驗(yàn)。按“1.3.1”中方法進(jìn)行酶活性檢測(cè)。加入反應(yīng)酶液后分別水浴2、5、10、15 min進(jìn)行酶活性檢測(cè)。各個(gè)酶活梯度檢測(cè)時(shí)設(shè)置2個(gè)重復(fù)。

1.3.7 底物濃度對(duì)酶活性檢測(cè)的影響試驗(yàn)。分別配制0.01、0.02、0.04和0.06 mol/L磷酸苯二鈉溶液。按“1.3.1”中方法進(jìn)行酶活性檢測(cè)。各個(gè)酶活梯度檢測(cè)時(shí)設(shè)置2個(gè)重復(fù)。

1.3.8 溫度對(duì)酶活性檢測(cè)的影響試驗(yàn)。按“1.3.1”中酶活性檢測(cè)方法，分別于25、37、45、55 ℃下水浴10 min，進(jìn)行酶活性檢測(cè)各個(gè)酶活梯度檢測(cè)時(shí)設(shè)置2個(gè)重復(fù)。

1.3.9 pH對(duì)酶活性檢測(cè)的影響試驗(yàn)。按“1.3.1”中酶活性檢測(cè)方法，分別配制0.01 mol/L Tris·HCl(pH 7.0、7.5、8.0、9.0、9.5)緩沖液，進(jìn)行酶活性檢測(cè)各個(gè)酶活梯度檢測(cè)時(shí)設(shè)置2個(gè)重復(fù)。

1.3.10 緩沖液離子強(qiáng)度對(duì)酶活性檢測(cè)的影響試驗(yàn)。按“1.3.1”中酶活性檢測(cè)方法，分別于配制的0.005、0.01、0.05、0.1 mol/L Tris·HCl(pH 8.0、)緩沖液，進(jìn)行酶活性檢測(cè)各個(gè)酶活梯度檢測(cè)時(shí)設(shè)置2個(gè)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 苯酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線 從圖1可以看出，苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程為y=0.023 1x-0.004 9，線性相關(guān)系數(shù)(R2值)為0.999 6。

2.2 緩沖液更換對(duì)酶活檢測(cè)的影響 由表3可知，在碳酸鹽緩沖液(0.1 mol/L pH 10.2)中達(dá)到相近檢測(cè)吸光度值的酶液濃度比Tris·HCl緩沖液(0.01 mol/L pH 8.0)更低。若采用統(tǒng)一濃的度酶液溶解于不同緩沖液中會(huì)導(dǎo)致其吸光度值大不相同。

2.3 靜止時(shí)間對(duì)酶活性檢測(cè)的影響 加了硼酸的鐵氰化鉀溶液顯色穩(wěn)定。由表4可知，靜止0、5、10 min后檢測(cè)其吸光度值偏差在±0.005內(nèi)，而不添加硼酸的鐵氰化鉀溶液則用肉眼即可見(jiàn)其顏色隨時(shí)間增加而迅速褪減。

圖1 苯酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線

表3 不同濃度緩沖液的吸光度值

表4 不同靜止時(shí)間后的吸光度值

2.4 水浴時(shí)間對(duì)酶活測(cè)定的影響 從圖2可以看出，15 min內(nèi)酶活性反應(yīng)呈線性增長(zhǎng)，而且線性相關(guān)系數(shù)(R2值)能達(dá)到0.99以上，因此選擇10 min為最佳反應(yīng)時(shí)間，此時(shí)線性區(qū)域更加符合檢驗(yàn)需求。

圖2 水浴時(shí)間對(duì)酶活性的影響

2.5 底物濃度對(duì)酶活性檢測(cè)的影響 由圖3可以看出，底物濃度改變時(shí)酶活性變化不大，但底物濃度為0.01～0.02 mol/L時(shí)其吸光度值差異較大(接近0.020)，而當(dāng)?shù)孜餄舛葹?.04～0.06 mol/L時(shí)吸光度值趨于穩(wěn)定，因此底物濃度選用0.04 mol/L較為合適。

2.6 溫度對(duì)酶活性檢測(cè)的影響 從圖4可以看出，隨著溫度的增加，對(duì)低濃度酶其活性影響變化幅度不大，但對(duì)高濃度的酶溫度對(duì)其酶活性影響逐漸增大。

2.7 pH對(duì)酶活性檢測(cè)的影響 從圖5可以看出，pH 7.0～8.0范圍內(nèi)酶活性變化不大，但隨著pH的升高，酶活性變化逐漸出現(xiàn)跳躍式的增大。因此，采用pH 7.0～8.0的緩沖液能夠較好維持酶活性的穩(wěn)定性。

2.8 緩沖液離子強(qiáng)度對(duì)酶活性檢測(cè)的影響 從圖6可以看出，不同緩沖液離子強(qiáng)度中酶活性稍有變化，但是變化幅度不大，因此確定緩沖液粒子強(qiáng)度對(duì)其影響不大。

圖3 底物濃度對(duì)酶活性的影響

圖4 溫度對(duì)酶活性的影響

圖5 pH對(duì)酶活性的影響

圖6 緩沖液離子強(qiáng)度對(duì)酶活性的影響

式中，K為510 nm處分光光度值帶入苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的公式中計(jì)算而得產(chǎn)生的苯酚濃度(μg/ml);6表示反應(yīng)總體積為6 ml;10表示反應(yīng)水浴時(shí)間為10 min，酶活單位定義以1 min計(jì);d表示2 min酶反應(yīng)液中所含原酶粉重量(mg)或原酶液體積(ml)。

3 討論

國(guó)內(nèi)對(duì)堿性磷酸酶檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)分別是針對(duì)牛奶和血清中堿性磷酸酶的活性檢測(cè)，由于檢測(cè)對(duì)象的不同所采用的緩沖液、底物、pH、溫度等也都大不相同［6-7］。其中，WS/T 351-2011標(biāo)準(zhǔn)中檢測(cè)底物采用對(duì)硝基苯酚磷酸鹽，由于檢測(cè)對(duì)象為血清，血清中存在大量顏色干擾物質(zhì)，因此其設(shè)置的加入量為100 μl，檢測(cè)溫度為接近體溫的37℃，并且檢測(cè)時(shí)使用受體激活劑2-氨基-2-甲基1-丙醇，因此其檢測(cè)值應(yīng)比實(shí)際使用時(shí)偏高。據(jù)報(bào)道，若處于高于25℃的環(huán)境中就會(huì)產(chǎn)生自分解反應(yīng)，因此這也將影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性［5］。選用磷酸苯二鈉作為酶活性檢測(cè)底物，主要原理為磷酸苯二鈉在堿性磷酸酶作用下被分解、釋放出苯酚，苯酚在堿性環(huán)境中經(jīng)過(guò)鐵氰化鉀氧化作用，并與4-氨基安替比林顯色劑結(jié)合產(chǎn)生紅色的醌類化合物，于510 nm特異波長(zhǎng)檢測(cè)，在與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比換算可計(jì)算出酶活力。由于科研中多使用0.01 mol/LTris·HCl(pH8.0)緩沖液對(duì)核酸進(jìn)行保護(hù)，而對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行去磷酸化反應(yīng)時(shí)常使用溫度為37℃，因此采用該緩沖液及溫度進(jìn)行酶活性檢測(cè)能夠更真實(shí)反映酶活性。同時(shí)，NY/T 801-2004使用2，6-二氯醌氯亞胺以及硫酸銅對(duì)苯酚進(jìn)行顯色檢測(cè)，由于2，6-二氯醌氯亞胺容易降解產(chǎn)生游離物質(zhì)，因此需使用當(dāng)日配制，這在日常檢驗(yàn)工作中增加了工作量也造成了一定程度的浪費(fèi)［8］。

該試驗(yàn)中通過(guò)設(shè)置2種緩沖液，發(fā)現(xiàn)若使用不同的緩沖液對(duì)酶活性進(jìn)行檢測(cè)其測(cè)量值差異較大，因此應(yīng)選用與實(shí)際使用條件一致的緩沖液;而通過(guò)設(shè)置不同的靜止時(shí)間若使用加了硼酸的鐵氰化鉀溶液則可以實(shí)現(xiàn)顏色的穩(wěn)定顯示，以減少誤差;針對(duì)目前采用磷酸苯二鈉底物濃度不一致的情況［9-10］;通過(guò)設(shè)置不同的底物濃度，選擇較穩(wěn)定的最低濃度(0.04 mol/L);通過(guò)設(shè)置不同反應(yīng)時(shí)間，將反應(yīng)時(shí)間縮短至10 min。筆者建立了科研用小牛腸堿性磷酸酶的活性檢測(cè)方法，說(shuō)明采用該方法其檢測(cè)結(jié)果更加貼近實(shí)際使用活性。

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