液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定葡萄酒中赭曲霉毒素A

侯建波，謝 文，李 杰，沈煒?shù)h，何建敏

（1.浙江出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，浙江 杭州 310016；2.浙江省檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院，浙江 杭州 310016；3.浙江立德產(chǎn)品技術(shù)有限公司，浙江 杭州 310016）

赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）是由生長(zhǎng)在糧食、花生、蔬菜、水果等農(nóng)作物上的曲霉屬和青霉屬產(chǎn)生的一種有毒代謝產(chǎn)物。由于其具有很高的化學(xué)穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性且對(duì)多種動(dòng)物具有潛在的腎毒性、神經(jīng)毒性和免疫毒性等特性，并與巴爾干地方性腎?。˙alkan endemic nephropathy，BEN）有著密切的關(guān)系，因此，國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（international agency for research on cancer，IARC）將其定義為II 2B類(lèi)致癌物[1]。

由于從葡萄酒中攝取到的OTA占到總攝取量的13%，因此OTA在葡萄酒中的污染情況日益受到人們的關(guān)注[2]。歐盟（European Union，EU）和國(guó)際葡萄與葡萄酒局（international organization of vine and wine，OIV）等國(guó)際組織規(guī)定葡萄酒中OTA的最大限量為2μg/L[3]，意大利和保加利亞規(guī)定啤酒中OTA含量不得超過(guò)0.2μg/L，保加利亞還規(guī)定葡萄汁中OTA含量不得超過(guò)3μg/L[4]。我國(guó)雖然尚未對(duì)葡萄酒中赭曲霉毒素A的殘留量進(jìn)行明確規(guī)定，但已明確要求谷物、豆類(lèi)及其制品中OTA的最大限量為5.0μg/kg[5]，飼料中OTA允許量≤100μg/kg[6]。為降低葡萄酒中赭曲霉毒素A的殘留，國(guó)際食品法典委員會(huì)（codex alimentarius commission，CAC）已經(jīng)制定預(yù)防和降低葡萄酒中赭曲霉毒素A污染的操作規(guī)范[7]。

目前對(duì)于葡萄酒中赭曲霉毒素A的測(cè)定主要以高效液相色譜法[8-10]、酶聯(lián)免疫法[11-12]和液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法為主[13-15]。在前處理凈化方式上，美國(guó)分析化學(xué)家協(xié)會(huì)（association of official analytical chemists，AOAC）采用免疫親和柱（immunoaffinity chromatography，IAC）進(jìn)行凈化[8]，該法被OIV等國(guó)際組織所采用，但由于免疫親和柱成本過(guò)高，因此研究人員陸續(xù)研發(fā)采用HLB、C18等固相萃取柱的凈化方式[15-17]。赭曲霉毒素B（ochratoxin B，OTB）和赭曲霉毒素A在化學(xué)結(jié)構(gòu)上僅相差一個(gè)氯原子，理化性質(zhì)接近，且已有研究表明赭曲霉毒素B的產(chǎn)生幾率和毒性均較低[18]，因此本研究以赭曲霉毒素B為內(nèi)標(biāo)物，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)葡萄酒中OTA的殘留量進(jìn)行測(cè)定。方法操作簡(jiǎn)便，適用性強(qiáng)，測(cè)定低限滿足目前國(guó)內(nèi)外對(duì)其限量的要求。可為提高葡萄酒質(zhì)量安全，對(duì)葡萄酒中赭曲霉毒素A含量的檢測(cè)提供有效的技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

C18固相萃取柱（solid phase extraction，SPE）（500mg，3mL）：德國(guó)CNW科技公司；OasisHLBSPE柱（500mg，6mL）：美國(guó)Waters公司；MAX SPE柱（150mg，6mL）：美國(guó)Waters公司；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、甲酸（色譜純）：美國(guó)Tedia公司；乙酸銨（分析純）：中國(guó)國(guó)藥集團(tuán)；赭曲霉毒素A（純度＞98%）：美國(guó)Enzo Life Sciences公司；赭曲霉毒素B（質(zhì)量濃度10.1μg/mL）：英國(guó)LGC標(biāo)準(zhǔn)品公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1260-6490型液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：美國(guó)安捷倫公司；HERAEUS Multifuge X1R型臺(tái)式離心機(jī)：美國(guó)Thermo公司；Milli-Q Gradient型超純水凈化系統(tǒng)：美國(guó)Millipore公司；VISIPREPTM DL型固相萃取裝置：美國(guó)SUPELCO公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理方法

準(zhǔn)確移取5mL葡萄酒，加入赭曲霉毒素B內(nèi)標(biāo)物20ng，用5%的氨水調(diào)節(jié)pH=7.0±0.3，8 500r/min離心5min，上清液轉(zhuǎn)移至C18固相萃取凈化柱（3mL甲醇和3mL水進(jìn)行活化），加入5mL水進(jìn)行淋洗，減壓抽干，加入5mL甲醇進(jìn)行洗脫，洗脫液氮吹至近干，用甲醇/0.15%甲酸水溶液=7∶3（V/V）定容至1.0mL，過(guò)0.22μm濾膜后待測(cè)定。

1.3.2 儀器測(cè)試方法

色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18（150mm×4.6mm，5μm）。流動(dòng)相：甲醇/0.15%甲酸水溶（含5mmol/L乙酸銨）=7∶3（V/V），等度洗脫；流速：0.6mL/min；進(jìn)樣量：20μL；柱溫：40℃。離子源參數(shù)：干燥氣溫度250℃，干燥氣流速16L/min，霧化氣壓力0.005 6Pa，鞘氣溫度：350℃，鞘氣流速10L/min，毛細(xì)管電壓3 500V。

2 結(jié)果與分析

2.1 凈化條件的選擇

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)葡萄酒自身pH值3.5～4.5，分別考察不同pH值[葡萄酒自身pH值和pH=5.0±0.3，7.0±0.3（僅MAX SPE柱）和9.0±0.3（僅MAX SPE柱）]下OTA在C18、HLB和MAX 3種類(lèi)型SPE柱的色譜行為。結(jié)果表明，pH值對(duì)OTA的凈化效果影響不大，MAX SPE柱凈化譜圖背景效果最好，其凈化需要的洗脫液體積最大，且回收率較C18和HLB SPE柱約低10%。綜合考慮凈化操作的簡(jiǎn)易程度和實(shí)驗(yàn)成本等因素，最終選擇C18SPE柱在pH=7.0條件下進(jìn)行凈化。

2.2 色譜條件的選擇

以Agilent Eclipse XDB-C18（150mm×4.6mm，5μm）和Agilent Eclipse XDB-C8（150mm×4.6mm，5μm）色譜柱為基礎(chǔ)，對(duì)色譜分離流動(dòng)相[乙腈/0.15%甲酸水溶液，甲醇/0.15%甲酸水溶液，乙腈/0.15%甲酸水溶液（含5mmol/L乙酸銨）和甲醇/0.15%甲酸水溶液（含5mmol/L乙酸銨）]和定容溶液[乙腈，甲醇，乙腈/0.15%甲酸水溶液，甲醇/0.15%甲酸水溶液，乙腈/0.15%甲酸水溶液（含5mmol/L乙酸銨）和甲醇/0.15%甲酸水溶液（含5mmol/L乙酸銨）]展開(kāi)正交試驗(yàn)。結(jié)果表明，酸性環(huán)境的流動(dòng)相可明顯改善譜峰形狀，乙酸銨可明顯提高譜峰強(qiáng)度（甲醇為流動(dòng)相），綜合對(duì)比譜峰的峰形、響應(yīng)強(qiáng)度以及分離效果，最終選擇C18色譜柱，甲醇/0.15%甲酸水溶液=7∶3（V/V）為定容溶液，甲醇/0.15%甲酸水溶液（含5mmol/L乙酸銨）7∶3（V/V）為液相色譜分離體系。

2.3 質(zhì)譜條件的選擇

采用流動(dòng)注射的方式在正和負(fù)離子模式下對(duì)待測(cè)化合物的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)行稀釋和母離子全掃描，確定分子離子峰，再以分子離子峰為母離子對(duì)其子離子進(jìn)行全掃描。結(jié)果顯示，OTA的[M-H]-的信號(hào)響應(yīng)最低，其[M+H]+（質(zhì)荷比404.2）和[M+Na]+（質(zhì)荷比426.1）獲得的碎片離子如圖1所示。綜合考慮信號(hào)響應(yīng)強(qiáng)度和離子穩(wěn)定性，選擇[M+H]+及其子離子進(jìn)行測(cè)試。按照歐盟EC/657指令的要求，選擇404.2/239.1和404.2/358.0為兩個(gè)特征子離子，其中404.2/239.1信噪比高、峰形好、干擾小作為定量離子對(duì)，OTB內(nèi)標(biāo)物離子對(duì)為370.2/205.2。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 基質(zhì)效應(yīng)

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定藥物殘留時(shí)，有時(shí)基質(zhì)對(duì)離子對(duì)具有增強(qiáng)或抑制效應(yīng)。本研究在不含待測(cè)目標(biāo)化合物的空白葡萄酒中添加OTA的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（添加質(zhì)量濃度2.0μg/L），外表法定量，以抑制率[（葡萄酒基質(zhì)中OTA離子對(duì)的響應(yīng)強(qiáng)度-溶劑中OTA離子對(duì)的響應(yīng)強(qiáng)度）/溶劑中OTA離子對(duì)的響應(yīng)強(qiáng)度×100%]來(lái)考察基質(zhì)效應(yīng)情況。計(jì)算結(jié)果顯示基質(zhì)抑制率約13%，最終實(shí)驗(yàn)采用葡萄酒空白提取液作為標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋溶液，可使標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液具有同樣的離子化條件，從而克服樣品基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)合OTB內(nèi)標(biāo)法消除操作過(guò)程中的系統(tǒng)誤差，更好地保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

圖1 赭曲霉毒素A([M+H]+和[M+Na]+)和赭曲霉毒素B(M+H]+)的離子全掃描質(zhì)譜圖Fig.1 Full scan ion spectrogram of ochratoxin A and ochratoxin B

2.4.2 方法的線性關(guān)系、定量限和方法精密度

在確定的實(shí)驗(yàn)條件下展開(kāi)測(cè)試，測(cè)定各化合物的譜峰面積，以質(zhì)量濃度x（μg/L）為橫坐標(biāo)，以O(shè)TA與OTB的峰面積比值y為縱坐標(biāo)，繪制OTA標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，OTA的溶液質(zhì)量濃度分別為0、10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、50ng/mL（OTB內(nèi)標(biāo)物溶液質(zhì)量濃度20ng/mL）；OTA的相應(yīng)質(zhì)量濃度分別為0、2.0μg/L、4.0μg/L、8.0μg/L、10.0μg/L。OTA標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程：y=0.141x+0.002 63，相關(guān)系數(shù)0.998 5。在OTA含量為2.0μg/L時(shí)，信噪比約384＞10，即該方法滿足歐盟和OIV設(shè)定的OTA定量限要求，可進(jìn)行準(zhǔn)確定量OTA。

選用不含待測(cè)組分的空白葡萄酒，分別添加OTA標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加質(zhì)量濃度分別均為2.0μg/L、4.0μg/L和8.0μg/L，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。由表1可知，赭曲霉毒素A回收率范圍97.6%～109.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relativestandarddeviation，RSD）3.0%～4.6%。葡萄酒中OTA標(biāo)準(zhǔn)溶液的LC-MS/MS測(cè)試選擇離子流圖如圖2所示。

表1 葡萄酒中赭曲霉毒素A的回收率及精密度Table 1 Recovery rate and precision of ochratoxin A in wine sample

圖2 不同條件下赭曲霉毒素A的選擇性離子流圖Fig.2 Selected ion chromatograms of ochratoxin A in different conditions

3 結(jié)論

本研究通過(guò)C18固相萃取凈化，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS），在正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下對(duì)葡萄酒中赭曲霉毒素A進(jìn)行測(cè)定。以赭曲霉毒素B為內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行定量計(jì)算，方法定量限2.0μg/L。在0～10μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性相關(guān)系數(shù)R＞0.998?；厥章史秶?7.6%～109.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 3.0%～4.6%，該方法簡(jiǎn)便快速，準(zhǔn)確度高，精密度好。滿足歐盟和OIV等國(guó)際機(jī)構(gòu)對(duì)葡萄酒中OTA的限量法規(guī)要求，可用于葡萄酒中赭曲霉毒素A的定量測(cè)定。

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